Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias do rato in vitro
2 de junho de 2020
Aqui, estabelecemos um método de baixo custo e fácil de operar que direciona a diferenciação rápida e eficiente das células-tronco embrionárias para os neurônios. Este método é adequado para popularização entre laboratórios e pode ser uma ferramenta útil para a pesquisa neurológica.
A diferenciação neuronal de ensaios em camundongos é um excelente modelo para ilustrar os principais mecanismos envolvidos na neurogênese. Demonstramos um método otimizado para neurogênese embrióide usando uma estratégia de triagem toro da empresa. Esta técnica tem as vantagens de alta eficiência, baixo custo e fácil operação, e é adequada para popularização entre laboratórios.
É uma ferramenta poderosa para a pesquisa em neurociência. Para realizar a diferenciação usando o protocolo um, semeie 20.000 células-tronco embrióides de camundongo em dois mililitros de meio de diferenciação basal em cada poço de uma placa de seis poços revestida com gelatina a 0,1%. Após a fixação das células, lave as células com dois mililitros de PBS e adicione dois mililitros de meio de diferenciação basal a cada poço, depois coloque as células de volta na incubadora.
Deixe as células se diferenciarem por oito dias, substituindo o meio a cada dois dias. Para realizar o protocolo dois, adicione 1,5 milhão de células-tronco embrióides de camundongo em uma placa bacteriana não adesiva em 10 mililitros de meio de diferenciação basal e incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir a formação do corpo embrióide. Após dois dias, transfira os agregados celulares para tubos de centrífuga de 15 mililitros e deixe-os assentar por gravidade.
Remova o sobrenadante e adicione 10 mililitros de meio de diferenciação basal fresco para ressuspender os corpos embrióides. Em seguida, replante-os em um novo prato não adesivo e incube-os por mais dois dias. Colete e semeie cerca de 50 corpos embrióides em dois mililitros de meio de diferenciação basal por poço em uma placa de seis poços revestida com gelatina.
Para indução de ácido retinóico, adicione dois microlitros de estoque de RA em cada poço até uma concentração final de um micromolar. Retorne a placa para a incubadora e diferencie as células por mais quatro dias. Para realizar a diferenciação usando o protocolo três, repita o protocolo dois, mas aguarde apenas dois dias para a formação do corpo embrionário e seis dias para a indução da AR.
O controle de qualidade da formação de corpos embrióides deve ser realizado por microscopia. Somente aqueles com núcleos brilhantes podem se diferenciar com sucesso no processo subsequente. Para o protocolo quatro, semeie 20.000 células-tronco embrionárias de camundongo por poço nas placas revestidas de gelatina e siga o protocolo um.
Depois de permitir que as células se diferenciem por quatro dias, adicione dois microlitros de todo o estoque de trans RA em cada poço e incube a placa por mais quatro dias. Para realizar o protocolo cinco, repita o protocolo quatro, mas inicie a indução da AR após apenas dois dias de diferenciação. Para o protocolo seis, plante 1,5 milhão de células-tronco em uma placa bacteriana não adesiva em 10 mililitros de N2B27 meio dois e incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir a formação do corpo embrióide.
Após dois dias, colete os agregados celulares conforme descrito anteriormente e ressuspenda os corpos embrióides com 10 mililitros de meio N2B27 fresco dois. Replante-os em um novo prato bacteriano não adesivo e permita a diferenciação por mais dois dias. No quarto dia, colete e semeie cerca de 50 corpos embrióides por poço em placas de seis poços revestidas de gelatina com dois mililitros de N2B27 meio dois.
Adicione dois microlitros de todo o estoque de trans RA em cada poço e induza a diferenciação por mais quatro dias. Para realizar o protocolo sete, semeie cerca de 20.000 células em dois mililitros de meio de diferenciação basal por poço nas placas revestidas de gelatina. Após a fixação das células e duas lavagens com PBS, adicione dois mililitros de meio N2B7, dois a cada poço e permita que as células se diferenciem por oito dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Depois de realizar a diferenciação da fase um usando o protocolo três, semeie cerca de 500.000 derivados de células-tronco embrionárias de camundongos em dois mililitros de meio de diferenciação basal por poço nas placas revestidas com gelatina a 0,1%. Divida aleatoriamente as derivadas em três grupos para testar protocolos de diferenciação trifásica e duas. Incube a placa por seis horas, depois lave as células duas vezes com dois mililitros de PBS e adicione dois mililitros de meio de diferenciação basal N2B27 meio um ou meio N2B27 dois a cada poço, dependendo do protocolo.
Coloque as lâminas na incubadora e deixe as células se diferenciarem por mais 10 dias, trocando o meio correspondente a cada dois dias. Sete protocolos foram testados para determinar o protocolo ideal para a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos em células precursoras gerais ou NPCs. Os protocolos foram testados em fechaduras A2lox e 129 células e o status de diferenciação de cada grupo foi monitorado usando um microscópio óptico.
A maioria dos derivados de A2lox e 129 apresentou morfologias bem empilhadas e semelhantes a neuritos sob o protocolo três, indicando a formação de NPCs. No entanto, as células diferenciadas usando o protocolo dois pareceram apoptóticas, o que pode ser devido à falta de nutrientes nos corpos embrióides. Para confirmar ainda mais a formação de NPCs, células nestinamente positivas foram detectadas usando um ensaio de imunofluorescência.
O protocolo três resultou na maior porcentagem de células nestin-positivas, atingindo até 78 e 69% em A2lox e 129 derivados, respectivamente. Três protocolos foram testados para a diferenciação de NPCs em neurônios. Foi determinado que o protocolo três induz a diferenciação de forma mais eficaz.
A maioria dos derivados de A2lox e 129 na fase dois do protocolo três tinha estruturas semelhantes a neurônios prolongadas com neurites claros e extensões do corpo celular. Os ensaios de imunofluorescência confirmaram ainda a geração de neurônios com a porcentagem de beta tubulina três células positivas até 68 e 59% em A2lox e 129 derivados, respectivamente, usando o protocolo três. Ao tentar este procedimento, é importante garantir que os ensaios em camundongos sejam saudáveis e indiferenciados antes da diferenciação.
Além disso, um rigoroso controle de qualidade deve ser realizado após a formação em corpos perfurados e antes da diferenciação da fase dois. Esta técnica fornece um modelo padrão para pesquisadores de neurobiologia e biologia do desenvolvimento e espera-se que seja uma ferramenta poderosa para ilustrar os principais mecanismos envolvidos na neurogênese.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método otimizado e econômico para a diferenciação de células-tronco embrionárias em neurônios. Utilizando ensaios de células-tronco embrionárias de camundongo, a técnica demonstra alta eficiência e simplicidade, tornando-a ideal para uso laboratorial amplamente disseminado em pesquisas neurológicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Diferenciação celular
- Biologia de células-tronco
Antecedentes
- A diferenciação neuronal é fundamental para compreender a neurogênese.
- Os modelos de células-tronco embrionárias são eficientes para estudar o desenvolvimento celular.
- Protocolos ideais podem melhorar o rendimento e a viabilidade das células diferenciadas.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método padrão e eficiente para derivar neurônios de células-tronco embrionárias.
- Facilitar a utilidade deste método em diversos laboratórios.
- Avaliar diferentes protocolos para obter os melhores resultados na diferenciação celular.
Métodos Utilizados
- Cultura celular em placas revestidas com gelatina e placas bacterianas não adesivas.
- Células-tronco embrionárias de camundongo como modelo biológico para diferenciação.
- Sete protocolos de diferenciação envolvendo condições variáveis para formação de corpos embrioides e indução por ácido retinóico.
- Monitoramento da diferenciação por meio de microscopia e ensaios de imunofluorescência.
- Medidas de controle de qualidade para viabilidade dos corpos embrioides e sucesso da diferenciação.
Resultados Principais
- O protocolo três gerou a maior porcentagem de células precursoras neurais positivas para nestina (78% em derivados A2lox e 69% em derivados 129).
- Neurônios positivos para beta-tubulina III foram observados nas taxas de 68% e 59% para derivados A2lox e 129, respectivamente.
- O controle de qualidade indicou que corpos embrioides saudáveis são cruciais para uma diferenciação bem-sucedida.
Conclusões
- Este estudo fornece uma ferramenta robusta para a diferenciação de células-tronco embrionárias em neurônios, aprimorando a pesquisa em neurobiologia.
- As metodologias descritas podem ser adaptadas para aplicações mais amplas em biologia do desenvolvimento.
- Cria oportunidades para uma melhor compreensão do desenvolvimento neuronal e das doenças relacionadas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de modelos in vitro confiáveis de neurogênese é essencial para a validação de alvos em programas de doenças neurodegenerativas. Este método fornece um sistema escalonável e economicamente eficaz para gerar células precursoras neurais e neurônios a partir de células-tronco embrionárias de camundongo, apoiando a desvinculação mecanicista em estágios iniciais. A abordagem permite triagem fenotípica reprodutível e o desenvolvimento de ensaios para estudos de modulação de vias.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas em vias de neurodesenvolvimento utilizando um sistema definido de diferenciação.
- Valor Operacional: Fornece uma fonte renovável de células precursoras neurais positivas para nestina para estudos de engajamento de alvos.
- Valor Preditivo: Apoia o alinhamento de biomarcadores por meio de resultados quantificáveis, como a geração de neurônios positivos para beta-tubulina III.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera populações neuronais padronizadas adequadas para triagem de compostos e ensaios de modulação de vias.
- Valor Operacional: Utiliza protocolos de baixo custo e de fácil operação, compatíveis com formatos de placas de múltiplos poços para alto rendimento.
- Valor de Reprodutibilidade: Os passos definidos de formação de corpos embrioides e indução por ácido retinóico garantem consistência entre lotes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Produz células neurais relevantes para doenças que modelam mecanismos-chave da neurogênese para validação de alvos.
- Valor Operacional: Suporta o amadurecimento longitudinal em meio N2B27 II para manutenção prolongada de neurônios e ensaios funcionais.
- Continuidade Translacional: Conecta a diferenciação de células-tronco em estágio de descoberta com fluxos de trabalho de pesquisa neurobiológica pré-clínica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase inicial da descoberta, permitindo modelos neurais derivados de células-tronco para testar hipóteses sobre alvos e preparar ensaios antes dos esforços de identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Facilita a desvinculação mecanicista ao fornecer um sistema controlado para estudar vias neurogênicas e dinâmicas de diferenciação.
- Triagem: Fornece leituras quantificáveis, baseadas em microscopia e imunofluorescência, para avaliação do efeito de compostos em populações de precursores neurais e neurônios.
- Análises: Gera métricas percentuais de eficiência de diferenciação (nestina+, beta-tubulina III+) que apoiam a análise comparativa de condições e a seleção de alvos positivos.
- Pesquisa Translacional: Permite a continuidade da diferenciação de células-tronco até a maturação neuronal, para validação fenotípica e funcional posterior.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma padronizada e reutilizável de diferenciação aplicável a múltiplos projetos de neurobiologia e biologia do desenvolvimento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos por meio da geração reprodutível de células precursoras neurais e neurônios a partir de células-tronco embrionárias murinas (mESCs).
- Valor Operacional: Reduz a variabilidade técnica por meio de controle de qualidade definido de corpos embrioides e etapas cronometradas de indução com ácido retinóico.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência das decisões de avanço ou interrupção ao fornecer leituras biológicas precoces em um sistema fisiologicamente relevante.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos ao permitir a redução de riscos mecanicistas nas vias de neurogênese.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células-tronco, manipulação de corpos embrioides e técnicas de ensaio de imunofluorescência.
- Depende de placas revestidas com gelatina, placas bacterianas não adesivas e condições controladas de incubação (37°C, 5% CO2).
- Necessita padronização na preparação do estoque de ácido retinóico e na avaliação da qualidade dos corpos embrioides por meio de microscopia.
- Envolve considerações de adaptação ao transferir protocolos entre linhagens de células-tronco embrionárias murinas (por exemplo, A2lox versus derivados de 129).
- Limitado pela necessidade de controle rigoroso da qualidade da saúde dos corpos embrioides antes da indução com ácido retinóico, para garantir o sucesso da diferenciação.
