Indução de lesão cerebral axonal difusa em ratos com base na aceleração rotacional
9 de maio de 2020
Este protocolo valida um modelo de roedor confiável, fácil de executar e reprodutível da lesão axonal difusa cerebral (DAI) que induz danos generalizados de matéria branca sem fraturas no crânio ou contusões.
Lesão cerebral traumática é uma das principais causas de morte e incapacidade. Lesão cerebral axonal difusa é um dano axonal generalizado se desenvolve após tbi. Nesta pesquisa, gostaria de apresentar nosso modelo sobre lesão cerebral axonal difusa por indução baseada no resultado do mecanismo de aceleração rotacional TBI.
Selecione ratos adultos machos Sprague-Dawley pesando de 300 a 350 gramas. Fornecer comida de rato e ad libitum de água. Realize todos os experimentos entre 6:00 e 12:00. O dispositivo foi colocado em uma mesa de laboratório pesada e estável.
O dispositivo consiste nos seguintes componentes: um cilindro, um peso de ferro, um mecanismo rotacional composto por um tubo cilíndrico e pinos de fixação da cabeça. O peso é fixado a uma corda e elevado à altura de 120 centímetros. O peso em queda livre atinge o parafuso ativando o mecanismo de rotação.
O dispositivo de rotação lateral da cabeça do rato foi usado para girar a cabeça rapidamente de zero a 90 graus. Após indução, lesão cerebral axonal difusa, rato foi transferido para a sala de recuperação. F é a força aplicada na cabeça do animal em quilogramas.
Capital M é o momento da força, K para energia cinética. Pouco m é a massa do peso em queda, g para aceleração gravitacional, h para altura em centímetros, e D é a distância entre os pinos de ouvido em centímetros. Para avaliação do déficit neurológico e déficits de modelos de grau, utilizamos escore de gravidade neurológica em ratos.
Avaliamos mobilidade, hemiplegia, tarefa de caminhada de feixe, falha na tarefa de caminhada do feixe. Falha de balanceamento de feixes de tarefa ampla 1,5 centímetros. Estabilidade e equilíbrio de feixes, esforço no equilíbrio do feixe de 1,5 centímetro de largura e reflexos.
48 horas após a lesão, todos os ratos, lesões e grupo controle, foram profundamente anestesiados e transcardiacalmente perfumados com soro fisiológico heparinizado de 0,9%, seguido por 500 mililitros de 4% de formaldeído em salina tampão fosfato de 0,1 M. Após a perfusão, a decapitação foi produzida e os cérebros foram imediatamente removidos, depois fixados em uma solução de 4% de formaldeído por 48 horas. Os cérebros foram então bloqueados em seções coronais de cinco milímetros da lâmpada olfativa face ao córtex visual enquanto o cerebelo e caules cerebrais foram dissecados.
Após a incorporação da parafina, seções coronais e sagidas foram feitas a partir do tálamo. Produzir a coloração imunoquímica da proteína precursora beta-amilóide. Os vários grupos de ratos em diferentes momentos são mostrados no esquema.
Lesão cerebral axonal difusa no início do experimento. Na época, 48 horas, o Escore de Gravidade Neurológica foi examinado. Na época, 48 horas, a coloração imunoquímica do beta-APP foi realizada em todos os dois grupos.
Déficit neurológico ilustrado 48 horas após lesão cerebral axonal difusa para dois grupos de estudo. Um teste de Mann-Whitney indicou que o déficit neurológico foi significativamente maior para 15 ratos de lesão cerebral axonal difusa em comparação com 15 ratos ingênuos em 48 horas após a intervenção. Fotomicrogramas representativos revelando imunoreactividades axais e neuronais após lesão cerebral axonal difusa isolada em ratos 48 horas após a lesão.
Cordas celulares menores são detectadas com proteína precursora beta-amilóide. Em grupo falso, não foi detectado. Em nosso trabalho, desenvolvemos um modelo novo simples, reprodutível e confiável para lesões cerebrais axonas difusas baseadas no mecanismo de aceleração rotacional.
Tal modelo permitirá uma melhor compreensão da fisiopatologia da lesão cerebral axonal difusa e desenvolvimento de tratamentos mais eficazes. Muito obrigado por sua atenção.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um modelo confiável e reprodutível em roedores de lesão axonal difusa (LAD) cerebral, que induz dano difuso da substância branca por meio de um mecanismo de aceleração rotacional. O modelo tem como objetivo melhor compreender a fisiopatologia da LAD após lesão cerebral traumática (LCT) e pode facilitar o desenvolvimento de tratamentos eficazes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Lesão Cerebral Traumática
- Modelos de Lesão Axonal
Antecedentes
- A lesão cerebral traumática é uma das principais causas de morte e incapacidade.
- A lesão axonal difusa provoca extensos danos axonais após trauma craniencefálico.
- Existe a necessidade de modelos animais robustos para estudar a LAD.
Objetivo do Estudo
- Validar um novo modelo roedor para o estudo de lesão axonal difusa (DAI).
- Induzir lesão cerebral sem fraturas cranianas ou contusões.
- Compreender o início de déficits neurológicos.
Métodos Utilizados
- A plataforma principal envolve um dispositivo de lesão cerebral rotacional.
- Ratos Sprague-Dawley machos adultos serviram como modelo biológico, com foco na indução de lesão axonal difusa (DAI).
- Os déficits neurológicos foram avaliados utilizando o Escore de Severidade Neurológica 48 horas após a lesão.
- Realizou-se coloração imunoquímica para a proteína precursora do beta-amiloide em cortes cerebrais.
Resultados Principais
- Foram observados déficits neurológicos significativamente aumentados em ratos com LAD em comparação com os controles.
- Ensaios imunoquímicos revelaram dano axonal indicado pela coloração da proteína precursora do beta-amiloide.
- O modelo demonstra impactos claros e mensuráveis na função neurológica dentro de 48 horas.
Conclusões
- Este estudo estabelece um modelo simples e eficaz para investigar os mecanismos da lesão axonal difusa.
- Os conhecimentos obtidos podem levar a uma melhor compreensão e tratamentos para a lesão cerebral traumática (TBI).
- Os achados podem orientar pesquisas futuras sobre os processos de lesão e recuperação neuronais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Modelos pré-clínicos confiáveis de lesão axonal difusa (LAD) são essenciais para reduzir os riscos na validação de alvos em neurotrauma e permitir a continuidade translacional na pesquisa de lesão cerebral traumática (LCT). Este modelo em ratos baseado em aceleração rotacional fornece uma plataforma reprodutível para quantificar déficits neurológicos e a patologia axonal, apoiando a confiança preditiva em estudos iniciais de descoberta e mecanicistas. A sua capacidade de induzir danos generalizados na substância branca sem lesões focais confundidoras posiciona-o como um recurso estratégico para o avanço da linha de desenvolvimento de neuroterapias.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de hipóteses sobre neurotrauma ao isolar mecanismos de lesão axonal difusa.
- Apoia a validação funcional de alvos por meio de desfechos neurológicos e histológicos quantificáveis.
- Facilita a redução de riscos biológicos ao excluir fatores de confusão de lesão focal.
- Oferece uma plataforma para estudos mecanicistas da patologia axonal relevante para lesão cerebral traumática (TBI).
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Proporciona indução padronizada de lesão para triagem pré-clínica reprodutível.
- Gera resultados quantitativos por meio da Pontuação de Gravidade Neurológica e coloração da proteína precursora do beta-amiloide.
- Permite preparo para ensaios na avaliação de compostos neuroprotetores ou regenerativos.
- Apóia a escalabilidade e a comparabilidade entre estudos na pesquisa de neurotrauma.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se aos mecanismos relevantes para a doença observados em pacientes humanos com TCE.
- Proporciona continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica de neuroterapêuticos.
- Permite decisões de avanço ajustadas ao risco com base em desfechos robustos e quantificáveis.
- Apoia o desenvolvimento de biomarcadores por meio da detecção imunoquímica de lesão axonal.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir estudos orientados por hipóteses, triagem quantitativa e validação translacional de intervenções para neurotrauma.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação da hipótese nula e a redução de riscos mecanicistas em vias de lesão axonal.
- Triagem: Fornece leituras neurológicas e histológicas quantitativas e reprodutíveis para avaliação de compostos.
- Análises: Permite comparação estatística da gravidade da lesão e dos efeitos do tratamento utilizando escores padronizados e imunomarcação.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados pré-clínicos à TCE clínica, modelando patologia axonal difusa sem interferências focais.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma validada e escalável para pesquisas contínuas em neurotrauma e desenvolvimento de terapias.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos em neurotrauma.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de estudos pré-clínicos de TCE.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisão de avançar ou interromper projetos e a eficiência do capital ao fornecer desfechos robustos e quantificáveis.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de candidatos a neuroterapêuticos.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em modelagem de neurotrauma em roedores e avaliação neurológica.
- Requer aparelho especializado para lesão rotacional e infraestrutura para análise histológica.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de indução e pontuação da lesão.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes linhagens de roedores ou severidades da lesão.
- O modelo foca na lesão aguda; estudos de desfechos crônicos podem requerer extensão do protocolo.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Preparing Rats for the Experimental Procedure
1:11
Procedure of Induction Diffuse Axonal Brain Injury
1:54
Measurement of Rotational Kinematics, Biomechanical Parameters
2:32
Evaluation of Neurological Severity Score after 48 hours
3:08
Brain Collection for Histological Examination after 48 hours
4:02
Immunohistochemical Staining
4:16
Results
5:22
Conclusion
