Microbolhas magnéticas, acústicas e óptica-tripla-responsivas para hipertermia magnética e terapia de câncer de combinação pothototérmica

Este protocolo é uma grande promessa para melhorar a entrega pós-nanomedicina e as eficácias anticancerígenas das nanopartículas no tratamento do câncer. Esta técnica sinergiza as responsividades magnéticas, acústicas e ópticas em uma plataforma nanoterapêutica para o controle e entrega direcionada da nanomedicina e facilita a combinação de terapia de hipertermia fototérmica e magnética. Demonstrando o procedimento estará Siyu Wang, um bolsista de microbolhas magnéticas, acústicas e ópticas triplas para hipertermia magnética e terapia de câncer de combinação fototérmica do meu laboratório.

Para a formação de microbolhas com casca de nanopartículas, disperse uniformemente as nanopartículas magnéticas de óxido de ferro em água deionizada para gerar uma solução de estoque de 10 miligramas por mililitro e carregue a solução de nanopartículas em uma máquina de limpeza ultrassônica por 20 minutos. No final da sonicação, adicione 150 microlitros de água deionizada, 150 microlitros de dodecil sulfato de sódio 10 milimolares e 400 microlitros da solução de nanopartículas de óxido de ferro sonicado em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, fixe um homogeneizador com um andaime em um banho de gelo e coloque a solução de nanopartículas no banho de gelo.

Mergulhar a sonda homogeneizadora na solução de nanopartículas e homogeneizar a suspensão durante três minutos a 20 000 rotações por minuto. No final da homogeneização, deixe a solução estabilizar por 12 horas à temperatura ambiente antes de colocar o tubo em um suporte magnético para adsorver as microbolhas descascadas com nanopartículas na parede do tubo. Substitua o sobrenadante por um mililitro de água fresca deionizada três vezes para lavar as microbolhas com casca de nanopartículas.

Após a última lavagem, agite levemente o tubo e transfira 10 microlitros das microbolhas com casca de nanopartículas para uma lâmina de vidro limpa. Use um microscópio de fluorescência e uma ampliação de 20X para obter imagens das microbolhas com casca de nanopartículas. Após a imagem, abra a imagem no software do microscópio e use a régua para definir uma linha vermelha com o mesmo comprimento da régua.

Clique em definir e dimensionar para inserir o comprimento da régua e desenhar linhas dos mesmos comprimentos nos diâmetros de pelo menos 200 microbolhas individuais. Em seguida, clique em relatório e visualize o relatório. Para medir a resposta acústica das microbolhas, dilua 200 microlitros das microbolhas com casca de nanopartículas em 800 microlitros de água deionizada em um tubo de 1,5 mililitro e conecte o gerador de função, amplificador, correspondência de impedância e transdutor de foco caseiro.

Coloque o transdutor no centro da parte inferior da pia cubóide artificial e conecte o hidrofone a um osciloscópio para monitorar a intensidade do ultrassom de saída. Adicione água deionizada suficiente para submergir o transdutor e ajuste o gerador de funções para o modo de varredura. Sintonize a faixa de frequência de 10 a 900 kilohertz e defina a amplitude para 20 voltage pico a pico.

Use o amplificador para ajustar a potência do ultrassom para 0,1% e a duração do ciclo para quatro segundos com um intervalo de tempo de um segundo. Coloque o tubo de nanopartículas no andaime na parte superior do transdutor de foco caseiro e prenda o ímã na parte inferior do tubo. Ligue o gerador de funções e a potência do amplificador.

Após cinco ciclos de ultrassom de 25 segundos, desligue o gerador de funções e remova o ímã. Em seguida, substitua a solução de nanopartículas por um mililitro de água deionizada e repita o ultrassom e o tratamento. Para configurar o laser para tratamento óptico das microbolhas, primeiro ligue a fonte de alimentação do laser.

Após vários minutos, fixe um diodo laser de 808 nanômetros acoplado a fibra em um suporte de retorta e use uma fibra óptica para direcionar o feixe de laser para o estágio de amostra. Use uma lente convexa para focar no estágio de amostra para obter um ponto de luz de seis milímetros de diâmetro e medir a potência com o medidor de potência do laser. Em seguida, ajuste a potência para um watt por centímetro quadrado.

Para realizar uma medição fototérmica, prepare volumes de um mililitro de diferentes concentrações das nanopartículas de óxido de ferro em tubos de centrífuga individuais de 1,5 mililitro e coloque o primeiro tubo na região focalizada do feixe de laser. Registre a temperatura basal da amostra e ligue o laser e a câmera termográfica infravermelha. Irradie a amostra continuamente por 10 minutos enquanto registra a temperatura em tempo real.

Em seguida, desligue o laser e a câmera e aguarde a temperatura da região retornar à linha de base antes de medir as outras concentrações da amostra da mesma maneira. Para uma medição de hipertermia magnética em uma solução aquosa, prepare diferentes diluições de nanopartículas de óxido de ferro conforme demonstrado e coloque uma diluição no centro de uma bobina de cobre de indução magnética a frio da água. Ligue o campo magnético alternado e a câmera termográfica infravermelha e induza continuamente a amostra por 10 minutos enquanto registra a temperatura em tempo real.

No final do tratamento, desligue o campo magnético alternado e a câmera. Quando a temperatura da bobina de cobre retornar à linha de base, meça a próxima amostra. As microbolhas com casca de nanopartículas normalmente demonstram uma forma esférica com um diâmetro médio de cerca de 5,41 micrômetros.

Embora as microbolhas permaneçam intactas por até um ano, uma liberação gradual de ferro pode ser alcançada aumentando o número de ciclos de ultrassom. A medição fototérmica mediada por nanopartículas de óxido de ferro em solução aquosa revela um rápido aumento na temperatura das nanopartículas de óxido de ferro ao longo do tempo com um aumento de temperatura de 30 graus Celsius alcançado após 10 minutos de exposição à luz laser infravermelha próxima a uma concentração de ferro de cinco miligramas por mililitro. Em comparação com o grupo controle, não são observadas diferenças na morfologia ou no número de células vivas quando as linhagens celulares de câncer de mama são incubadas com alta concentração de ferro, sugerindo uma boa biodisponibilidade das nanopartículas de óxido de ferro.

Após a irradiação, as células cancerígenas tratadas com nanopartículas tornaram-se arredondadas e demonstraram viabilidade diminuída, indicando apoptose. Cinco minutos após a irradiação, a temperatura das áreas de injeção de gelatina aumenta rapidamente em cerca de 20 graus Celsius. Quando expostas à terapia de campo magnético alternado, as imagens térmicas de diferentes concentrações de nanopartículas de óxido de ferro revelam uma resposta de campo magnético alternado característica de microbolhas com casca de nanopartículas.

Além disso, imagens por atacado de camundongos expostos à terapia de campo magnético alternado revelam mudanças rápidas de temperatura significativas na área de interesse. Durante a agitação da solução de nanopartículas, certifique-se de que a sonda homogeneizadora permaneça completamente imersa na solução. Este protocolo também pode alcançar e melhorar a penetração nos tecidos tumorais para enfrentar os desafios da entrega de nanomedicina no tratamento do câncer.