Name: Uma configuração em pequena escala para testes de toxicidade de algas de nanomateriais e outras substâncias difíceis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Aprenda a usar a plataforma LEVITATT para testes de toxicidade em algas com nanomateriais e substâncias coloridas. Este método utiliza iluminação LED para garantir campo de luz uniforme sem geração de calor excessivo.

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Esta pesquisa foi financiada pela PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, Grant agreement 760813 sob o programa de pesquisa e inovação Horizon 2020.

1. Descrição da configuração LEVITATT
<ol><li>Use frascos de vidro cintilante de 20 mL(Figura 1, insira 1) permitindo penetração de luz. Alternativamente, podem ser usados frascos de plástico penetráveis leves. Quantifique a intensidade da luz usando um fotômetro.</li>
	<li>Use pelo menos uma suspensão de teste de 4 mL no início do teste para permitir a quantificação da biomassa e para caracterização/quantificação de nanomateriais durante e após a incubação(Figura 1, inserir 2).</li>
	<li>Encaixe os frascos de cintilação de 20 mL com uma tampa(Figura 1, insira 3) onde um pequeno orifício é perfurado (aproximadamente 1 mm de diâmetro) para permitir a troca de CO2 com a atmosfera. Esta troca é crucial para garantir níveis estáveis de pH e CO2 durante os testes.</li>
	<li>Para substâncias voláteis, use uma tampa revestida de Teflon a ar para permitir o enriquecimento de CO2 do espaço para a cabeça usando uma seringa9 ou frascos completamente fechados sem fase de gás em que o CO2 é mantido em solução por um sistema tampão de sódio enriquecido (NaHCO3)sistema tampão 10.</li>
	<li>Aperte os frascos com grampos montados na carcaça externa(Figura 1, insira 4).</li>
	<li>Use uma fonte de luz LED localizada abaixo dos frascos de teste(Figura 1, insira 5) fornecendo uma iluminação fluorescente uniforme do tipo "branco-frio" ou "luz do dia" e uma intensidade de luz na faixa de 60-120 μE∙m-2∙s-1 medida na faixa de comprimento de onda fotointtheticamente eficaz de 400 nm a 700 nm. A configuração emprega intensidade de luz ajustável na faixa de 5-160 μE∙m-2∙s-1, encaixando um dimmer leve na fonte. Isso permite testar em intensidades de luz mais altas e mais baixas.</li>
	<li>Monte a configuração em um agitador orbital para agitar amostras durante toda a duração do teste. Isso mantém as células em suspensão livre e facilita a transferência de massa de CO2 do ar para a água (Figura 1, insira 6).</li>
	<li>Coloque a configuração em uma sala controlada pela temperatura ou em um armário termostático para manter temperaturas estáveis durante os testes (Figura 1, insira 7).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61209/61209fig1v2.jpg"> Figura 1: Imagem da tabela de iluminação vertical led para testes de toxicidade de algas (LEVITATT). 1) Frascos de cintilação de vidro de 20 mL para incubação, 2) amostra de 4 mL para análise, 3) tampa com orifício perfurado para troca de CO2, 4) invólucro para condições de luz definidas, 5) fonte de luz LED localizada no centro do invólucro, 6) shaker orbital para agitação durante o experimento e 7) um armário termostático. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61209/61209fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Preparação do meio de crescimento de algas
<ol><li>O meio de crescimento de algas ISO 8692 consiste em quatro soluções de estoque diferentes. Pesar a quantidade apropriada de sais e diluir em água ultrauso de acordo com a Tabela 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Soluções de estoque</td>
			<td>Nutrientes</td>
			<td>Concentração na solução de estoque</td>
			<td>Concentração na solução de teste</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">1: Macronutrientes</td>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>1,5 g/L</td>
			<td>15 mg/L (N: 3,9 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2∙6H2O</td>
			<td>1,2 g/L</td>
			<td>12 mg/L (Mg: 2,9 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2∙2H2O</td>
			<td>1,8 g/L</td>
			<td>18 mg/L (Ca: 4,9 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4∙7H2O</td>
			<td>1,5 g/L</td>
			<td>15 mg/L (S: 1,95 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>0,16 g/L</td>
			<td>1,6 mg/L (P: 0,36 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">2: Fe-EDTA</td>
			<td>FeCl3∙6H2O</td>
			<td>64 mg/L</td>
			<td>64 μg/L (Fe: 13 μg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2EDTA∙2H2O</td>
			<td>100 mg/L</td>
			<td>100 μg/L</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">3: Traços</td>
			<td>H3BO3a
</td>
			<td>185 mg/L</td>
			<td>185 μg/L (B: 32 μg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2∙4H2O</td>
			<td>415 mg/L</td>
			<td>415 μg/L (Mn: 115 μg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZnCl2
</td>
			<td>3 mg/L</td>
			<td>3 μg/L (Zn: 1,4 μg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CoCl2∙6H2O</td>
			<td>1,5 mg/L</td>
			<td>1,5 μg/L (Co: 0,37 μg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CuCl2∙2H2O</td>
			<td>0,01 mg/L</td>
			<td>0,01 μg/L (Cu: 3,7 ng/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2MoO4∙2H2O</td>
			<td>7 mg/L</td>
			<td>7 μg/L (Mo: 2,8 μg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4: NaHCO3</td>
			<td>NaHCO3
</td>
			<td>50 g/L</td>
			<td>50 mg/L (C: 7,14 mg/L)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Concentrações de nutrientes em soluções de estoque para meio de crescimento de algas
NOTA: H3BO3 pode ser dissolvido adicionando 0,1 M NaOH. O EDTA deve ser removido ao testar metais, para evitar a complexação com íons metálicos. Esterilizar as soluções de estoque por filtração de membrana (diâmetro médio de poros 0,2 μm) ou por autoclaving (120 °C, 15 min). Não faça soluções de estoque autoclave 2 e 4, mas esterilize-as por filtragem de membrana. Armazene as soluções no escuro a 4 °C.
<ol start="2"><li>Para produzir 1 L de meio de crescimento algal, transfira 500 mL de água ultrapura esterilizada em um frasco volutrico esterilizado de 1 L e adicione 10 mL de solução de estoque 1: Macronutrientes, 1 mL de solução de estoque 2: Fe-EDTA, 1 mL de solução de estoque 3: Elementos de rastreamento, e 1 mL de solução de estoque 4: NaHCO3.</li>
	<li>Encha até 1 L com água ultrauso esterilizada, roa o frasco e agite bem para homogeneizar o meio de crescimento de algas.</li>
	<li>Equilibre a solução antes de usá-la deixando-a durante a noite em contato com o ar ou borbulhando com ar estéril e filtrado por 30 minutos. Após o equilíbrio, ajuste o pH, se necessário, para pH 8,1 ± 0,2, com 1 M HCl ou 1 M NaOH.</li>
</ol>3. Configuração do teste de algas
NOTA: Um diagrama de fluxo do procedimento de teste de algas é mostrado na Figura 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61209/61209fig2v6.jpg"> Figura 2: Diagrama de fluxo da configuração do teste de algas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61209/61209fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol><li>Prepare uma solução de estoque do composto de ensaio na maior concentração de teste desejada no meio de crescimento de algas preparada de acordo com a etapa 2. Para a preparação de soluções/suspensões de estoque, siga a OCDE 201 (para compostos solúveis) ou a OCDE 318 (para nanomateriais).</li>
	<li>Meça o pH na solução de estoque. Se ele desviar mais de uma unidade do meio de crescimento de algas, ajuste o pH para 8 com 1 M HCl ou 1 M NaOH.</li>
	<li>Calcule o volume de inóculo necessário para atingir uma concentração celular final de 1 x 104 células/mL em uma solução de teste de 25 mL. NOTA: O inóculo deve vir de uma cultura de subcapitata Raphidocelis de crescimento exponencial não contaminado cultivada usando a configuração LEVITATT.</li>
	<li>Calcule a quantidade de solução de estoque para adicionar a cada frasco volumoso de 25 mL para obter as concentrações desejadas do teste. O fator entre cada concentração não deve exceder 3,2.</li>
	<li>Marque um frasco volumoso de 25 mL para cada concentração escolhida e um controle de frasco volumoso adicional de 25 mL.</li>
	<li>Adicione a quantidade de solução de estoque do composto de teste necessária para alcançar as concentrações desejadas ao frasco volumoso de 25 mL. Não adicione a solução de estoque ao controle.</li>
	<li>Adicione o frasco volumoso médio de 25 mL para atingir um volume de aproximadamente 20 mL.</li>
	<li>Adicione o volume de inóculo calculado na etapa 3.3 a cada frasco volumoso de 25 mL. Adicione o frasco volumoso médio a cada 25 mL de volumer para um volume total final de 25 mL.</li>
	<li>Roa os frascos e misture bem girando os frascos duas vezes verticalmente.</li>
	<li>Transfira 0,4 mL de cada frasco em frascos individuais de tampa de parafuso e adicione 1,6 mL de acetona (saturado com MgCO3): uma amostra para cada concentração de teste e o controle. Feche bem as tampas e armazene no escuro à temperatura ambiente até medições de fluorescência (seção 4).</li>
	<li>Pipet 4 mL de cada solução de teste em frascos de cintilação de 20 mL (3 réplicas por concentração e 5 réplicas para o controle). Enrosque as tampas dos frascos de cintilação. Lembre-se que as tampas devem ter um orifício perfurado (aproximadamente 1 mm de diâmetro) para permitir a troca de CO2.</li>
	<li>Após 24h, 48h e 72h, pipet 0,4 mL de cada frasco em frascos de tampa de parafuso e adicionar 1,6 mL de acetona (saturado com MgCO3). Feche bem as tampas e armazene no escuro à temperatura ambiente até medições de fluorescência (seção 4).</li>
	<li>Após a última amostra ser colhida a 72 h, acumule suavemente as três réplicas para uma dada concentração em um frasco e meça o pH. Repita para todas as concentrações e o controle. O pH não deve desviar mais de 1,5 unidades do pH inicial para qualquer uma das amostras medidas.</li>
	<li>Descarrete os líquidos restantes em um recipiente de resíduos seguindo suas regras e regulamentos institucionais.</li>
</ol>4. Analisando amostras de teste de algas
<ol><li>Use um espectrofotômetro de fluorescência para medir a biomassa alga (aqui expressa como clorofila A). O pico de emissão de clorofila A é de 420 nm para o comprimento de onda de excitação e 671 nm para o comprimento de onda de emissão.</li>
	<li>Meça a fluorescência de cada amostra individual três vezes e calcule o valor médio de cada amostra.</li>
	<li>Use a equação 1 para calcular a taxa de crescimento. A fluorescência medida (unidades relativas) pode ser usada diretamente como parâmetro de biomassa na equação 1. Equação 1: μ = (ln Nt – ln N0) / t onde μ é a taxa de crescimento (d-1), N0 é a biomassa inicial, Nt é a biomassa no momento t, e t é a duração do período de teste (d). Nota, N0 e Nt devem ser expressos na mesma unidade.</li>
	<li>Use um software estatístico para encaixar uma curva de regressão não linear (por exemplo, uma função log-logistic ou Weibull) aos dados da taxa de crescimento para obter valores efetivos de concentração em 10%, 20% e 50% de inibição. Nas informações complementares é dado um exemplo de código para a montagem no software estatístico R utilizando o pacote RDC11.</li>
</ol>

<ol><li>European Chemicals Agency. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+on+Registration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Chemicals+Agency%22%5BJournal%5D)">Guidance on Registration.</a> European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland. (2016).</li>
<li>Organisation for Economic Cooperation and Development. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+Document+on+Aquatic+Toxicity+Testing+of+Difficult+Substances+and+Mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Organisation+for+Economic+Cooperation+and+Development%22%5BJournal%5D)">Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures.</a> Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).</li>
<li>Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+microplate+algal+assay+technique+for+aquatic+toxicity+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicity+Assessment%22%5BJournal%5D)">A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment.</a> Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).</li>
<li>Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+certain+shade+of+green%3A+can+algal+pigments+reveal+shading+effects+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Integrated+Environmental+Assessment+and+Management%22%5BJournal%5D)">A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles.</a> Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algae+response+to+engineered+nanoparticles%3A+current+understanding%7B%2C%7D+mechanisms+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science%3A+Nano%22%5BJournal%5D)">Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications.</a> Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).</li>
<li>Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniscale+algal+toxicity+test%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">A miniscale algal toxicity test.</a> Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).</li>
<li>Organisation for Economic Cooperation and Development. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Test+No.+201%3A+Freshwater+Alga+and+Cyanobacteria%2C+Growth+Inhibition+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Organisation+for+Economic+Cooperation+and+Development%22%5BJournal%5D)">Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test.</a> Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).</li>
<li>International Organization for Standardization (ISO). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+Quality+-+Fresh+Water+Algal+Growth+Inhibition+Test+with+Unicellular+Green+Algae%5BTitle%5D)+AND+%22International+Organization+for+Standardization+%28ISO%29%22%5BJournal%5D)">Water Quality - Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae.</a> International Organization for Standardization (ISO). , (2012).</li>
<li>Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal+toxicity+tests+with+volatile+and+hazardous+compounds+in+air-tight+test+flasks+with+CO2+enriched+headspace%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace.</a> Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).</li>
<li>Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal+growth+inhibition+test+in+filled%2C+closed+bottles+for+volatile+and+sorptive+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).</li>
<li>Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-response+analysis+using+R%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dose-response analysis using R.</a> PloS One. 10 (12), 0146021(2015).</li>
<li>Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+freely+dissolved+concentrations+of+semivolatile+and+hydrophobic+test+chemicals+in+in+vitro+assays-measuring+high+losses+and+crossover+by+headspace+solid-phase+microextraction%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction.</a> Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).</li>
<li>Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Headspace+passive+dosing+of+volatile+hydrophobic+chemicals+-+toxicity+testing+exactly+at+the+saturation+level%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals - toxicity testing exactly at the saturation level.</a> Chemosphere. 211, 694-700 (2018).</li>
<li>Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+studies+on+algal+toxicity+testing+using+fluorometric+microplate+and+Erlenmeyer+flask+growth-inhibition+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).</li>
<li>Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O'Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+miniaturized+algal+bioassay+in+phytotoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening.</a> Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).</li>
<li>Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round-robin+testing+with+the+selenastrum--capricornutum+microplate+toxicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">Round-robin testing with the selenastrum--capricornutum microplate toxicity assay.</a> Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).</li>
<li>Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+fluorometric+microplate+algal+toxicity+assay+for+riverine+periphytic+algal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).</li>
<li>Lee, W. M., An, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+zinc+oxide+and+titanium+dioxide+nanoparticles+on+green+algae+under+visible%2C+UVA%2C+and+UVB+irradiations%3A+no+evidence+of+enhanced+algal+toxicity+under+UV+pre-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation.</a> Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).</li>
<li>Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+morphology+and+size+of+zinc+oxide+nanoparticles+on+its+toxicity+to+the+freshwater+microalga%2C+Raphidocelis+subcapitata%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research%22%5BJournal%5D)">The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata.</a> Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).</li>
<li>Neale, P. A., Jaemting, A. K., O'Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviour+of+titanium+dioxide+and+zinc+oxide+nanoparticles+in+the+presence+of+wastewater-derived+organic+matter+and+implications+for+algal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science%3A+Nano%22%5BJournal%5D)">Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity.</a> Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).</li>
<li>Hartmann, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+of+testing+metal+and+metal+oxide+nanoparticles+in+algal+bioassays%3A+titanium+dioxide+and+gold+nanoparticles+as+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies.</a> Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).</li>
<li>Farkas, J., Booth, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+fluorescence-based+chlorophyll+quantification+methods+suitable+for+algae+toxicity+assessment+of+carbon+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials.</a> Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).</li>
<li>Handy, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+conducting+ecotoxicity+test+methods+with+manufactured+nanomaterials%3A+what+have+we+learnt+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far.</a> Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).</li>
<li>Handy, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecotoxicity+test+methods+for+engineered+nanomaterials%3A+practical+experiences+and+recommendations+from+the+bench%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O fitoplâncton converte energia solar e dióxido de carbono em matéria orgânica e, portanto, tem um papel fundamental no ecossistema aquático. Por essa razão, os testes de inibição da taxa de crescimento de algas são incluídos como um dos três testes de toxicidade aquática obrigatórios necessários para a avaliação de risco regulatório de produtos químicos. A capacidade de realizar um teste de toxicidade algas confiável e reprodutível é fundamental nesse sentido. As configurações de teste usando frascos de Erlenmeyer intro...

O teste de toxicidade de algas é um dos três únicos testes obrigatórios utilizados para gerar os dados de ecotoxicidade necessários para o registro pré e pós-mercado de produtos químicos por regulamentos europeus e internacionais (por exemplo, REACH1 e TSCA (EUA)." Para isso, foram desenvolvidas diretrizes padronizadas de testes de algas por organismos internacionais (por exemplo, ISO e OCDE). Estes padrões e diretrizes de teste prescrevem condições ideais de teste em termos de pH, temperatura, níveis de dióxido de carbono e intensidade de luz. No entanto, manter condições estáveis de teste durante os testes de algas é na prática difícil e os resultados sofrem de problemas com reprodutibilidade e confiabilidade para uma gama de substâncias químicas e nanomateriais (muitas vezes chamados de "substâncias difíceis")2. A maioria das configurações de teste de toxicidade de algas existentes operam com volumes relativamente grandes (100-250 mL) situados em um agitador orbital dentro de uma incubadora. Tal configuração limita o número de concentrações de teste e replica volumes alcançáveis e altos de cultura alga e material de teste. Além disso, essas configurações raramente têm um campo de luz uniforme e condições de iluminação confiáveis são ainda mais difíceis de obter em frascos grandes, em parte à medida que a intensidade da luz diminui exponencialmente quanto mais a luz viaja e em parte devido à geometria do frasco. As configurações alternativas compreendem microtiter plástico3 placas contendo pequenos volumes de amostra que não permitem volumes de amostragem adequados para medir pH, medições adicionais de biomassa, extração de pigmento ou outras análises que requerem amostragem destrutiva. Um desafio particular usando as configurações existentes para testes de toxicidade de algas de nanomateriais e substâncias que formam suspensões coloridas é a interferência ou bloqueio da luz disponível para as células algas, muitas vezes referidas como "sombreamento"4,,5. O sombreamento pode ocorrer dentro de frascos pelo material de teste e/ou interações entre o material de teste e as células algas, ou sombreamento pode ocorrer entre frascos, devido ao seu posicionamento em relação uns aos outros e à fonte de luz.
O método baseia-se na configuração do teste de toxicidade de algas em pequena escala introduzida por Arensberg et al.6 que permite testar em conformidade com normas como a OCDE 2017e ISO 86928. O método é ainda otimizado para atender às limitações acima indicadas por: 1) utilizando a tecnologia de luz LED para garantir condições uniformes de luz com geração mínima de calor, 2) fornecendo volume amostral adequado para análise química/biológica, mantendo pH constante, níveis de CO2 e 3) permitindo o uso de material de recipiente de teste versátil para testes de substâncias voláteis ou substâncias com alto potencial de sorção.

<table><tbody><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V179124</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254134</td><td></td></tr><tr><td>garrafas BlueCap (1L)</td><td>Buch & Holm A/S</td><td>&nbsp; </td><td></td>9072335</tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0394</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>Folha acrílica transparente (40x40 cm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cobalto (II) hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255599</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cobre (II) di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>307483</td><td></td></tr><tr><td>Sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; E5134</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro de Fluorescência F-7000</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de ferro (III) hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz LED</td><td>Helmholt Elektronik A / S</td><td>H35161</td><td>Branco neutro, 6500K</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de manganês (II) tetrahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>IKA</td><td>2980200</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Raphidocelis subcapitata</td><td>NORCCA</td><td></td><td>NIVA-CHL1 </td></tr><tr><td>frascos de cintilação (20 mL)</td> <td>Fisherscientific</td><td>11526325</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato de sódio di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331058&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Grampo de mola</td><td>Frederiksen Scientific A/S</td><td>472002</td><td></td></tr><tr><td>Armário termostático</td><td>VWR</td><td>WTWA208450</td><td>Alternativa: sala com temperatura controlada</td></tr><tr><td>Tubo de ventilação (&Oslash; 125 mm)</td><td>Balões</td> volumétricos <td>Silvan 22605630165</td><td></td></tr><tr><td>(25 mL)</td><td>DWK Life Sciences</td><td>246781455</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de zinco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr></tbody></table>

uma configuração em pequena escala para testes de toxicidade de algas de nanomateriais e outras substâncias difíceis

A Small-Scale Setup for Algal Toxicity Testing of Nanomaterials and Other Difficult Substances

Os dados de ecotoxicidade são um requisito para o registro pré e pós-mercado de produtos químicos por regulamentos europeus e internacionais (por exemplo, REACH). O teste de toxicidade de algas é frequentemente utilizado na avaliação de risco regulatório de produtos químicos. Para alcançar alta confiabilidade e reprodutibilidade, o desenvolvimento de diretrizes padronizadas é vital. Para testes de toxicidade alga, as diretrizes requerem condições estáveis e uniformes de parâmetros como pH, temperatura, níveis de dióxido de carbono e intensidade de luz. Nanomateriais e outras substâncias chamadas difíceis podem interferir com a luz causando uma grande variação nos resultados obtidos dificultando sua aceitação regulatória. Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos o LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). A configuração utiliza a iluminação LED de baixo permitindo uma distribuição de luz homogênea e controle de temperatura, minimizando também o sombreamento intra-amostra. A configuração otimiza o volume amostral para quantificação de biomassa e, ao mesmo tempo, garante um influxo suficiente de CO2 para suportar o crescimento exponencial das algas. Além disso, o material dos recipientes de teste pode ser adaptado para minimizar a adsorção e a volatilização. Ao testar substâncias coloridas ou suspensões de partículas, o uso de luzes LED também permite aumentar a intensidade da luz sem geração adicional de calor. O design compacto e os requisitos mínimos de equipamentos aumentam as possibilidades de implementação do LEVITATT em uma ampla gama de laboratórios. Embora em conformidade com as diretrizes padronizadas do ISO e da OCDE para testes de toxicidade alga, a LEVITATT também mostrou uma menor variabilidade inter-amostra para duas substâncias de referência (3,5-Dicholorofenol e K2Cr2O7) e três nanomateriais (ZnO, CeO2e BaSO4) em comparação com frascos erlen e placas de microtídeos.

Um teste inicial com uma substância de referência é realizado para determinar a sensibilidade da cepa de algas. As substâncias de referência regularmente utilizadas para R. subcapitata são dicromato de potássio e 3,5-Diclorfenol7,8. A Figura 3 e a Tabela 2 mostram um resultado representativo de um teste de algas, incluindo encaixe de curva e saídas estatísticas quando o pacote RDC em R é aplicado às taxas de...

Demonstramos testes de toxicidade de algas para substâncias difíceis (por exemplo, substâncias coloridas ou nanomateriais) usando uma configuração iluminada verticalmente com um LED.

Uma configuração em pequena escala para testes de toxicidade de algas de nanomateriais e outras substâncias difíceis

Ecotoxicity data is a requirement for pre- and post-market registration of chemicals by European and international regulations (e.g., REACH). The algal ...

Quando uma empresa química quer colocar um novo produto químico ou outro material no mercado, eles precisam fornecer dados de uma série de testes de ecotoxicidade. O teste de algas é um dos três testes obrigatórios que precisam ser realizados. O teste de algas sofre do fato de que é bastante desafiador de executar.Por essa razão, desenvolvemos a plataforma de testes LEVITATT. O LEVITATT usa luz LED para evitar problemas com a geração excessiva de calor. Além disso, garante um campo leve uniforme.Ele tem um tamanho compacto, o que significa que você não precisa de muito espaço para realizar o teste de algas, mas, ao mesmo tempo, permite usar volume de amostra suficiente para realizar análise química e caracterização antes, durante e depois do teste. Isso é especialmente importante quando você testa nanomateriais. Este vídeo demonstrará o uso de LEVITATT para testes de toxicidade alga de nanomateriais e outras substâncias difíceis.A demonstração consiste nos quatro passos seguintes. Primeiro, descreva os componentes do LEVITATT. O segundo passo é preparar a solução para a mídia de crescimento de algas.E o terceiro passo é dar uma visão geral do procedimento de como realizar um teste de toxicidade de algas. O passo final é medir o aumento da biomassa de algas por fluorômetro. O LEVITATT pode ser colocado no armário de sala controlado pela temperatura.Isso permite temperatura estável durante toda a exposição. A configuração é colocada em um agitador orbital para permitir a rotação das amostras durante o teste. O teste é realizado em frascos de cintilação de 20 mililitros contendo quatro mililitros de exposição.Uma tampa de parafuso com um orifício perfurado permite a troca de CO2 com o ar durante a exposição. A fonte led é sanduíche entre duas folhas de plástico e localizada no centro de cada invólucro. A colocação cria um campo de luz homogêneo e minimiza o sombreamento entre as amostras.Cada invólucro é montado com grampos e pode conter até cinco amostras. O tamanho compacto minimiza o espaço necessário para realizar o experimento. Para preparar as soluções de estoque, pese a quantidade apropriada de cada composto.A solução de estoque consiste em vários sais vitais para o crescimento das algas. Quando a quantidade apropriada de sais foram pesados, eles são diluídos com água ultra-pura. As soluções de estoque são esterilizadas por filtragem ou autoclavagem.Após a esterilização, as soluções de estoque podem ser armazenadas no escuro a quatro graus Celsius. Prepare uma série de concentrações de exposição. O fator entre as concentrações de exposição não deve exceder 3,2.O volume apropriado de algas em crescimento exponencial é adicionado a cada concentração de teste. A densidade celular final deve ser de aproximadamente 10.000 células algas por mililitro. É fundamental que a pré cultura cresça exponencialmente para cumprir os critérios de validade do teste.Os frascos de medição são misturados para permitir uma distribuição homogênea de algas e compostos antes da amostragem. As amostras são derramadas em béquers, e quatro mililitros são pipetados em frascos de cintilação de 20 mililitros. Os frascos de cintilação estão agora tampados.Pipeta 0,4 mililitro de cada concentração. Adicione acetona de 1,6 mililitro para interromper a parede celular e solte a clorofila à fase líquida. Cada frasco de vidro está agora perto firmemente para evitar a evaporação de acetona durante o armazenamento.Os frascos de cintilação tampados são agora distribuídos aleatoriamente no LEVITATT e incubados por 72 horas. Meça a intensidade da luz e a temperatura no início e no fim da incubação para garantir o cumprimento das diretrizes desejadas. A subperse amostral é feita no intervalo de 24 horas por pipetação de 0,4 mililitros de cada frasco de cintilação em frascos de vidro.Adicione 1,6 milhão de acetona para interromper a parede celular e liberar a clorofila à fase líquida. Depois que a acetona for adicionada, aparar as tampas firmemente e deixe as amostras no escuro até a análise. Use um fluorômetro para quantificar a biomassa na amostra adquirida durante todo o período de teste.As configurações no fluorômetro devem ser de 420 nanômetros como comprimento de onda de excitação e um comprimento de onda de emissão de 671 nanômetros. Cada amostra individual é medida três vezes, e os valores relativos são observados. Os valores relativos do fluorômetro são utilizados para calcular a taxa de crescimento que será usada para posterior tratamento de dados.Use um software estatístico para encaixar uma curva de regressão não linear aos dados calculados da taxa de crescimento. Um exemplo de uma curva de regressão não linear pode ser um log-logístico de função viável. O intervalo de confiança associado de 95% é mostrado ao lado do ajuste do modelo.Valores de concentração regularmente eficazes como 10, 20 e 50% ineficientes são usados para relatar o resultado de um teste de ecotoxicidade. Em conclusão, o LEVITATT fornece uma plataforma compacta para testes de toxicidade alga de produtos químicos regulares em conformidade com as diretrizes padronizadas internacionais. Além disso, a configuração fornece uma plataforma robusta para testes de substâncias difíceis que interferem na passagem da luz em direção à alga, como nanomateriais ou substâncias coloridas.

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Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

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Uma configuração em pequena escala para testes de toxicidade de algas de nanomateriais e outras substâncias difíceis

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