Name: Medindo a confluência de iPSCs usando um sistema automatizado de imagem. (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Aprenda a medir a confluência de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando um sistema automatizado de imagem. Este método avalia diferentes revestimentos de matriz extracelular sem perturbar o crescimento celular.

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O estudo foi apoiado por bolsas da Fondazione Bambino Gesù e Ricerca Corrente (Ministério da Saúde italiano) para C.C.  Gostaríamos de agradecer ao Dr. Enrico Bertini (Departamento de Neurociência, Unidade de Doenças Neuromusculares e Neurodegenerativas, Laboratório de Medicina Molecular, Hospital de Pesquisa Infantil Bambino Gesù), Dra. Stefania Petrini (Centro de Núcleo de Microscopia Confocal, Laboratórios de Pesquisa, Hospital de Pesquisa Infantil Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Departamento de Onco-hematologia, Terapia Genética e Celular, Hospital de Pesquisa Infantil Bambino Gesù) e Roberta Ferretti (Departamento de Onco-hematologia, Terapia Gênica e Celular, Hospital de Pesquisa Infantil Bambino Gesù) para discussões científicas e ajuda técnica. Maria Vinci é beneficiária de uma "bolsa Children with Cancer UK".

1. Revestimento de 96 placas de poço
NOTA: Diferentes revestimentos foram testados na mesma placa, mas poços separados (consulte Arquivo Suplementar).
<ol><li>Diluir o Matrigel 1:100 em DMEM. Adicionar 100 μL por poço às 96 placas de poço e incubar por 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, remova a solução e lave os poços com 100 μL de DMEM duas vezes.</li>
	<li>Laminina diluída (20 μg/mL, LN-521) em PBS (com cálcio e magnésio). Adicionar 100 μL ao poço e incubar a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, realize duas lavagens com DMEM antes de semear as células.</li>
	<li>Vitronectina diluída (10 μg/mL) em tampão de diluição. Adicionar 100 μL por poço à placa de 96 poços e incubar por 1 hora à temperatura ambiente. Lave os poços com PBS (sem cálcio e magnésio) antes de chapear as células.</li>
	<li>Diluir HU-Fibronectina (30 μg/mL) em ddH2O. Adicionar 100 μL aos poços e incubar à temperatura ambiente por 45 minutos. Em seguida, lave os poços com o meio antes de semear as células.</li>
</ol>2. Manutenção das iPSCs em cultura
NOTA: iPSCs foram comprados comercialmente. As iPSCs foram derivadas de fibroblastos humanos saudáveis e reprogramadas usando tecnologia episómica.
<ol><li>A partir do congelador a -80 °C ou do azoto líquido, descongelar as iPSCs criopreservadas num banho-maria de 37 °C. Limpe o frasco para injetáveis que contém as células com etanol a 70% antes de o mover para o armário de segurança biológica.</li>
	<li>Adicione a suspensão celular a 5 mL de meio de cultura celular pré-aquecido (por exemplo, mTeSR1) gota a gota com uma pipeta de 1000 μL em um tubo cônico estéril de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar as células a 304 x g durante 5 min à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Remova o meio e ressuspenda o pellet celular em 4 mL de meio de cultura celular.</li>
	<li>Chapear a suspensão celular em dois poços das placas de 6 poços (105 iPSCs por placa de cultura celular de 6 poços), onde os fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) foram revestidos anteriormente. MEFs de sementes dois dias antes do revestimento de iPSCs a uma densidade de 2,4 x 104/cm2 em DMEM (contendo 10% de soro fetal bovino, 1% de L-glutamina e 1% de penicilina-estreptomicina).</li>
	<li>Após a semeadura, complemente o meio celular com 10 μM de inibidor de ROCK Y-27632.</li>
	<li>Cultivar as iPSCs em MEFs durante as primeiras 4-5 semanas e, em seguida, em condição livre de alimentador (condição livre de MEF), usando um dos revestimentos de interesse (ver etapa 1 e Tabela 1) em mTeSR1.</li>
	<li>Quando as iPSCs são 70-80% confluentes, passagem 1:4 usando o tratamento de EDTA 0,5 mM por 3-5 min no RT. Adicione 1 mL de EDTA 0,5 mM para uma placa de 6 poços (ou quantidades proporcionais para outros tipos de placas). Transferir para novos poços em condições livres de alimentadores e incubar a 37 °C, 5% de CO2, 20% de O2.</li>
	<li>Mude a mídia com mTeSR1 fresco todos os dias e divida as células a cada 2 dias.</li>
</ol>3. Caracterização da confluência celular
<ol><li>Use 96 placas de poço para os experimentos.</li>
	<li>Semear 10.000 células por poço após pelo menos 1 mês de cultura em condição livre de alimentadores, a fim de ter certeza de que os MEFs não foram passados. Use lâminas de contagem descartáveis para contar as células com o microscópio óptico.</li>
	<li>Realizar os experimentos em triplicado. Portanto, teste cada condição de semeadura em três poços.</li>
	<li>Realize a aquisição automatizada de imagens a partir do dia 1 após a semeadura usando um citômetro no modo de campo brilhante. Realize a aquisição automatizada de imagens a cada 24 horas durante 5 dias. Para obter informações detalhadas sobre os parâmetros experimentais, consulte o Arquivo Suplementar.</li>
	<li>Use o auto-contraste e auto-exposição para visualizar melhor as células.</li>
	<li>Defina a configuração de análise (consulte Arquivo Suplementar) para análise de confluência para aplicar uma máscara de 60%, 80% e 100% por poço, a fim de avaliar as mudanças de foco devido à refração de luz na borda dos poços. Use a configuração de análise de máscara diferente mencionada acima para analisar a confluência celular em cada ponto de tempo.</li>
</ol>4. Análises estatísticas
<ol><li>Relatar resultados quantitativos como meio ± erro padrão da média (EPM).</li>
	<li>Para comparar as diferenças gerais das diferentes condições de revestimento, obtenha dados usando as mesmas amostras e execute o teste t de amostra emparelhada de Student. Valores de p menores que 0,05 são considerados estatisticamente significativos, e todos os valores de p relatados são de dois lados.</li>
</ol>5. Caracterização dos microfilamentos citoesqueléticos
<ol><li>Fixar células com paraformaldeído a 4% (PFA a 4%) em PBS por 10 min no RT, seguido de duas lavagens em PBS (total de 10 min).</li>
	<li>Adicionar 100 μL de solução de bloqueio (composta por 5% de BSA, 0,1% de Triton em PBS) a cada poço por 1 h no RT.</li>
	<li>Retire a solução de bloqueio e lave as amostras duas vezes com PBS por 10 min.</li>
	<li>Adicionar 100 μL da solução de trabalho conjugada com faloidina por amostra e incubar durante 1 h a RT.</li>
	<li>Lave as células duas vezes com PBS (10 min no RT).</li>
	<li>Núcleos de coloração com Hoechst 33342 diluídos 1:10000 em PBS durante 10 min a RT.</li>
	<li>Retire a solução Hoechst e lave as células duas vezes com PBS durante 10 minutos de cada vez.</li>
	<li>Lavar a amostra com H2O e deixar secar debaixo de um exaustor químico.</li>
	<li>Adicionar 100 μL de meio de montagem (ou seja, PBS:glicerol, 1:1) para cobrir as células e preservar a fluorescência das amostras.</li>
	<li>Observe a célula em Ex/Em 493/517 nm em um microscópio confocal de varredura a laser equipado com uma fonte de laser de luz branca (WLL) e um laser de diodo de 405 nm. Adquira imagens confocais sequenciais usando um objetivo de imersão em óleo HC PLAPO 40x. Use a mesma potência do laser, divisores de feixe, configurações de filtro, diâmetros de orifício e modo de varredura para todas as amostras examinadas.</li>
</ol>

<ol><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aged+iPSCs+display+an+uncommon+mitochondrial+appearance+and+fail+to+undergo+in+vitro+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis.</a> Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Kleinman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+type+IV+procollagen%2C+laminin%2C+and+heparan+sulfate+proteoglycan+from+the+EHS+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma.</a> Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521%2FE-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195(2014).</li>
<li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521+based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li>
<li>Laperle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-5+Laminin+Synthesized+by+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Promotes+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).</li>
<li>Albalushi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+521+stabilizes+the+pluripotency+expression+pattern+of+human+embryonic+stem+cells+initially+derived+on+feeder+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells.</a> Stem Cell International. 2018, 7127042(2018).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-derived+laminin-511+promotes+midbrain+dopaminergic+neuron+survival+and+differentiation+through+YAP%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP.</a> Science Signaling. 10 (493), (2017).</li>
<li>Lu, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+xeno-free+and+feeder-free+culture+system+for+the+derivation%2C+expansion+and+direct+differentiation+of+transgene-free+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).</li>
<li>Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+slow+cooling+cryopreservation+for+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells.</a> Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).</li>
<li>Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Xeno-free culture of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vitronectin+is+a+functionally+defined+substrate+that+supports+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+via+alphavbeta5+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin.</a> Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+vitronectin+concentration+and+surface+properties+on+the+stable+propagation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells.</a> Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).</li>
<li>Prowse, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+on+recombinant+vitronectin+in+ascorbate+free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media.</a> Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).</li>
<li>Rowland, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+integrins+in+human+induced+pluripotent+stem+cell+growth+on+Matrigel+and+vitronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin.</a> Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).</li>
<li>Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+studies+on+amniotic+fluid+and+plasma+fibronectins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins.</a> Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).</li>
<li>Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+activation+by+dithiothreitol+or+Mn2%2B+induces+a+ligand-occupied+conformation+and+exposure+of+a+novel+NH2-terminal+regulatory+site+on+the+beta1+integrin+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain.</a> Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).</li>
<li>Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+wound+healing+assay+in+an+epithelial-mesenchymal+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+%26+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system.</a> Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).</li>
<li>Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder+layer-and+serum-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells.</a> Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).</li>
<li>Vaheri, A., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+molecular+weight%2C+cell+surface-associated+glyco-protein+%28fibronectin%29+lost+in+malignant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).</li>
<li>Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+fibrillogenesis%2C+a+cell-mediated+matrix+assembly+process%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process.</a> Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).</li>
<li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states%3A+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).</li>
<li>Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fibrillogenesis%3A+fibronectin%2C+integrins%2C+and+minor+collagens+as+organizers+and+nucleators%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).</li>
<li>Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tightening+the+connections+between+cadherins+and+fibronectin+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix.</a> Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).</li>
<li>Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+The+evolution+of+human+pluripotent+stem+cell+culture%3A+from+feeder+cells+to+synthetic+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings.</a> Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Vigilante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Extrinsic+versus+Intrinsic+Drivers+of+Variation+in+Cell+Behavior+in+Human+iPSC+Lines+from+Healthy+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors.</a> Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O uso de iPSCs para modelagem de doenças e futura triagem de medicamentos, juntamente com sua possível aplicação em medicina de precisão, torna-a uma tecnologia de grande relevância e, por essa razão, acreditamos que é necessário entender claramente a condição de cultura in vitro que melhor se assemelha à situação fisiológica das células-tronco embrionárias. Neste contexto, testamos diferentes revestimentos de ECM usando iPSCs do tipo selvagem, a fim de entender as condições que permitem que as células permaneçam em um e...

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são obtidas a partir de células somáticas e podem ser diferenciadas em diferentes tipos de células. Eles são frequentemente usados como um sistema para modelar a patogênese da doença ou realizar triagem de medicamentos, e também oferecem o potencial para ser usado no contexto da medicina personalizada. Como as iPSCs têm grande potencial, é importante caracterizá-las completamente para uso como um sistema modelo confiável. Mostramos anteriormente a importância do cultivo de iPSCs em um ambiente hipóxico, pois essas células dependem da glicólise e um ambiente aeróbio pode causar desequilíbrioredox1. As iPSCs também são vulneráveis a outras condições de cultura, particularmente o ambiente extracelular. A otimização das condições da cultura é uma questão fundamental para mantê-las saudáveis e proliferantes. Uma cultura saudável de iPSC levará a células diferenciadas saudáveis que geralmente são o ponto final do modelo usado para entender as características moleculares, celulares e funcionais de distúrbios humanos específicos ou processos celulares.
Neste estudo, um protocolo simples foi utilizado para testar a confluência de iPSCs utilizando diferentes condições de revestimento em poços separados. As iPSCs requerem uma camada alimentadora de fibroblastos embrionários murinos (MEF) para se ligarem adequadamente, mas a coexistência de iPSCs e MEF dificulta a realização de análises como RNA ou extração de proteínas, uma vez que duas populações de células estão presentes. A fim de evitar a camada de alimentação, diferentes proteínas pertencentes à matriz extracelular (ECM) têm sido utilizadas para recriar o nicho celular natural e para ter cultura iPSC livre de alimentador. Em particular, Matrigel é uma preparação de membrana basal solubilizada extraída do sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), que é enriquecida em proteínas da matriz extracelular (ou seja, laminina, colágeno IV, proteoglicanos de sulfato de heparano, entactina/nidogênio e fatores de crescimento)2,3. As outras condições de revestimento utilizadas são, em vez disso, proteínas purificadas com relevância conhecida na construção dos ECMs: a laminina-521 é conhecida por ser secretada por células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) na massa celular interna do embrião e é uma das lamininas mais comuns no corpo após o nascimento 4,5,6,7,8,9, 10,11; a vitronectina é uma matriz de cultura celular livre de xeno conhecida por apoiar o crescimento e a diferenciação da hPSC 12,13,14,15,16; a fibronectina é uma proteína da MEC importante para o desenvolvimento de vertebrados e a fixação e manutenção de células-tronco embrionárias em estado pluripotente 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Uma vez que diferentes condições de revestimento estão disponíveis, nós as comparamos em termos de seu efeito na confluência das iPSCs.

<table><tbody><tr><td>Pipetas Sorológicas Stripette de 10 mL, Poliestireno, Embaladas individualmente em papel/plástico, Ferramenta Corning</td><td></td><td>4488</td><td></td>estéril</tr><tr><td>Tubos de centrífuga cônicos de polipropileno (PP) de alta clareza de 15 mL Ferramenta</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (Com Ca2+; Mg2+)</td><td>Thermofisher</td><td>14040133</td><td>Medium</td></tr><tr><td>1x PBS (sem Ca2+; Mg2+)</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>Medium 5 mL Stripette Pipetas sorológicas, poliestireno, embaladas individualmente em papel/plástico, ferramenta estéril</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de cultura celular, 96 WELL, PS, F-Bottom</td><td>Greiner Bio One</td><td>655090</td><td>Suporte</td></tr><tr><td>Placa de cultura celular, 6 poços</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>Support</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose)</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td>Medium</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED4SS-500g</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>FAST - READ 102</td><td>Biosigma</td><td>BVS100</td><td></td></tr><tr><td>Tool Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Merck</td><td>FC010</td><td>Revestimento</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>H2O</td><td></td><td>MILLIQ</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Thermofisher</td><td>33342</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Laminina 521</td><td>Tecnologias de Células-Tronco</td><td>77003</td><td>Revestimento</td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Reagente</td><td>Gibco LS25030081</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Coating Fibroblastos embrionários de camundongo (MEF)</td><td>Life Technologies</td><td>A24903</td><td>Revestimento</td></tr><tr><td>MTESR1 Medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85851</td><td>Suplemento</td></tr><tr><td>Medium MTESR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85852</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina Média (10.000 U/mL)</td><td>Reagente Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Faloidina</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Vitronectina</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7180</td><td>Revestindo</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Reagente</td></tr></tbody></table>

medindo a confluência de ipscs usando um sistema automatizado de imagem.

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

Este estudo se concentra em entender como o crescimento de iPSCs em diferentes substratos de revestimento de ECM pode afetar a confluência celular. Um protocolo para avaliar a confluência de iPSC em tempo real foi estabelecido sem a necessidade de contar células em suspensão de célula única para evitar qualquer perturbação do crescimento. Um sistema de análise de imagens de alto conteúdo foi usado para avaliar a confluência de iPCS em 4 ECMs diferentes ao longo do tempo de forma automatizada. Diferentes configurações de análise foram usadas para avaliar a confluência celular de iPSCs aderentes e apenas uma pequena diferença (em 24 e 48 horas com laminina) foi observada se uma máscara de 60, 80 ou 100% foi aplicada. Também mostramos que a laminina leva à melhor confluência em comparação com Matrigel, vitronectina e fibronectina.

Neste estudo, investigamos a confluência de iPSCs quando cultivadas em diferentes condições de revestimento. Usando um citômetro, fomos capazes de obter resultados prontamente informativos em triplicados em 5 dias. Como as iPSCs dificilmente se ligam a recipientes plásticos e um revestimento é necessário para suportar sua proliferação, decidimos monitorar a confluência de iPSCs humanas, pois é indicativa da saúde da cultura celular e pode refletir em seu potencial de diferenciação. Após a expansão in vitro, semeamos as i...

O objetivo do protocolo é comparar diferentes condições de revestimento de matriz extracelular (ECM) para avaliar como o revestimento diferencial afeta a taxa de crescimento de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Em particular, pretendemos estabelecer condições para obter o crescimento ideal das culturas de iPSC.

Medindo a confluência de iPSCs usando um sistema automatizado de imagem.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

Este protocolo é significativo porque permite uma avaliação rápida da confluência de células-tronco pluripotentes induzidas em diferentes substratos de revestimento de matriz extracelular em tempo real. A principal vantagem deste protocolo é que ele não requer a contagem de suspensão de célula única, evitando assim a perturbação do crescimento para iPSCs, que são sensíveis à passagem. Demonstrando o procedimento estará Valentina Magliocca, pós-doutoranda do meu laboratório.Para configurar placas revestidas com matriz de membrana basal, dilua a matriz de membrana basal, defina uma proporção de 1 para 100 em DMEM e adicione 100 microlitros da solução resultante a cada poço de uma placa de 96 poços. Quando todos os poços tiverem sido codificados, coloque a placa na incubadora de cultura de células por uma hora. No final da incubação, descarte a solução de matriz de membrana basal e lave cada poço duas vezes com 100 microlitros de DMEM fresco por poço.Para configurar placas revestidas com laminina, dilua 20 microgramas por mililitro de laminina em PBS com cálcio e magnésio e adicione 100 microlitros da solução de laminina a cada poço de uma nova placa de 96 poços. Em seguida, incube a placa a quatro graus Celsius durante a noite antes de lavar os poços duas vezes com DMEM fresco, conforme demonstrado. Para configurar placas revestidas com vitronectina, dilua 10 microgramas por mililitro de vitronectina em tampão de diluição e adicione 100 microlitros de tampão a cada poço de uma nova placa de 96 poços.Após uma hora de incubação em temperatura ambiente, lave os poços com 100 microlitros de PBS sem cálcio e magnésio por poço. Para preparar placas revestidas com fibronectina humana, dilua 30 microgramas por mililitro de fibronectina em água bidestilada e adicione 100 microlitros da solução de fibronectina a cada poço de uma nova placa de 96 poços. Após uma incubação de 45 minutos à temperatura ambiente, lave os poços com DMEM fresco, conforme demonstrado.Dois dias antes de estabelecer uma cultura de iPSC, semeie fibroblastos embrionários de camundongos com densidade de 2,4 por 10 elevado a quarto por centímetro quadrado em meio de cultura de células completo em cada um dos dois poços de placas de cultura de células de seis poços e coloque as placas na incubadora de cultura de células. Para configurar uma cultura de iPSC, aqueça uma solução estoque de iPSCs criopreservadas em banho-maria a 37 graus Celsius. Quando as células acabarem de descongelar, limpe o frasco com etanol a 70% e coloque as células em um armário de segurança biológica.Usando uma pipeta de 1000 microlitros, transfira as células gota a gota para um tubo cônico estéril de 15 mililitros contendo cinco mililitros de meio de cultura de células pré-aquecido. Colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em quatro mililitros de meio de cultura de células frescas. Em seguida, coloque 1 por 10 até as quintas células em cada um dos dois poços das placas de seis poços com sementes de fibroblastos embrionários de camundongo.Após a semeadura, suplemente as culturas de células com 10 micromolares do inibidor de ROCK Y-27632 e coloque as placas na incubadora de cultura de células por quatro a cinco semanas. Quando as células atingirem 70 a 80% de confluência, trate cada cultura com um mililitro de EDTA 0,5 milimolar por três a cinco minutos em temperatura ambiente. Quando as células se separarem, divida as células na proporção de um para quatro em meio de cultura de células frescas e coloque as células em cada um dos quatro poços restantes da placa de seis poços em condições livres de alimentador.Em seguida, retorne as placas para a incubadora de cultura de células. Para avaliar os efeitos dos diferentes revestimentos na confluência celular após pelo menos um mês de cultura em condições sem alimentador, use lâminas de contagem descartáveis para contar as células de cada cultura usando uma câmara de contagem. Dilua as células em uma por 10 elevado a quarta células por 200 microlitros de concentração média e semeie as células em triplicado em cada um dos três poços de uma placa de 96 poços revestida com cobertura por condição.Quando todas as células tiverem sido plaqueadas, coloque as placas na incubadora de cultura de células por 24 horas. No dia seguinte e todos os dias nos próximos cinco dias, execute imagens automatizadas das células usando as configurações de contraste automático e exposição automática para visualização ideal. Para avaliar as mudanças de foco devido à refração da luz na borda dos poços, defina as configurações de análise para análise de confluência para aplicar uma máscara de 60, 80 ou 100% por poço e use as diferentes configurações de análise de máscara para analisar a confluência celular em cada ponto de tempo.Para comparar as diferenças gerais das diferentes condições de codificação, use os dados da amostra para realizar o teste T de amostra pareada de Student, relatando os resultados quantitativos como as mudanças médias na confluência, mais ou menos o erro padrão da média. Para a caracterização dos microfilamentos do citoesqueleto, primeiro, fixe as células com 100 microlitros de paraformaldeído a 4% em PBS por poço por 10 minutos à temperatura ambiente, seguido de duas lavagens de 10 minutos em 200 microlitros de PBS por lavagem. Transfira a lamínula colocada anteriormente da placa para a lâmina do microscópio.Adicione 100 microlitros de soro bovino a 5% e 0,1% de tritão em PBS a cada poço por uma hora em temperatura ambiente para bloquear qualquer ligação não específica e lave as amostras com duas lavagens de PBS de 10 minutos, conforme demonstrado. Após a segunda lavagem, adicione 100 microlitros de solução de trabalho conjugada de faloidina por amostra para uma incubação de uma hora em temperatura ambiente, seguida de duas lavagens de 10 minutos em PBS. Em seguida, corar os núcleos com Hoechst 33342 diluído a uma concentração de um a 10.000 em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente, seguido de duas lavagens de PBS.Após a segunda lavagem, enxágue as células com água e deixe as placas secarem sob uma capa química. Quando a lamínula de vidro secar, cubra as células com 100 microlitros de um meio de montagem apropriado por poço e localize as células em um microscópio confocal de varredura a laser equipado com uma fonte de laser de luz branca e um laser de diodo de 405 nanômetros nos comprimentos de onda apropriados de excitação e emissão. Em seguida, selecione a objetiva de imersão em óleo 63x e adquira imagens confocais sequenciais das células.A coloração com faloidina permite a visualização do grau de adesão celular à superfície de um vaso e, especificamente, ao revestimento usado para o vaso. As células aderentes a um revestimento demonstram microfilamentos do citoesqueleto claramente visíveis em vez de microfilamentos colapsados. A imagem de campo claro também permite a aquisição de imagens do nível de adesão das iPSCs às superfícies revestidas.As iPSCs semeadas na laminina demonstram uma alta taxa de proliferação celular de forma linear ao longo do tempo em comparação com outros revestimentos. As células semeadas na matriz da membrana basal, Vitronectina e fibronectina humana, por outro lado, exibem uma taxa de proliferação linear nas primeiras 96 horas com um aumento da inclinação na curva de confluência durante as últimas 24 horas, independentemente da máscara usada. Como a diferença inicial em 24 horas para os diferentes revestimentos pode ser devido a diferenças na ligação celular, o crescimento celular pode ser normalizado para os dados de 24 horas para os pontos de tempo posteriores.Como observado, não existem diferenças em termos de confluência entre os diferentes revestimentos, sugerindo que as diferenças observadas nas culturas revestidas com laminina são provavelmente devidas a uma maior capacidade das iPSCs de aderir a esse revestimento quando passadas. Este estudo pode contribuir para o desenvolvimento de metodologias padronizadas para cultura de iPSCs e pode auxiliar em seu possível uso futuro em clínicas. Atualmente, estamos investigando a biologia dos principais receptores de superfície celular que medeiam os contatos célula-ECM e que podem ser responsáveis pela manutenção de sua capacidade de autorrenovação.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo detalhes como quantificar o número sinapse neuronal tanto na cultura dissociada e nas seções do cérebro utilizando imunocitoquímica. Usando compartimento de anticorpos específicos, nós rótulo terminais pré-sinápticos, bem como sites de especialização pós-sináptica. Nós definimos sinapses como pontos de co-localização entre os sinais gerados por estes marcadores.

Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

Nós apresentamos um sistema de introdução de amostras de gotículas discreto para espectrometria de massas com plasma (ICPMS). Baseia-se um chip de microfluidos barato e descartável, que gera gotículas altamente monodispersas numa gama de tamanhos de 40-60 mm a frequências de 90 a 7.000 Hz.

Um chip microfluídico para ICPMS Amostra Introdução

Para investigar as velocidades de fluxo e a direcionalidade da actina filamentosa na sinapse imunológica das células T, a imagem de super-resolução de células vivas é combinada com fluorescência de reflexão interna total e quantificada com espectroscopia de correlação de imagem espaço-temporal.

Cortical actina Fluxo nas células T quantificada pela correlação espacial e temporal Imagem Espectroscopia de iluminação estruturada Microscopia Dados

Nós apresentamos um protocolo para a aplicação de interferometria fotoativado Localization Microscopy (iPALM), um método de microscopia de super-resolução 3-dimensional única molécula localização, à imagem do citoesqueleto de actina em células de mamíferos aderentes. Esta abordagem permite a visualização à base de luz de características estruturais em nanoescala que, caso contrário permanecem sem solução por microscopia óptica limitado por difração convencional.

Tridimensional Super Resolution Microscopia de filamentos de actina F por Interferometric fotoativado Localization Microscopy (iPALM)

Neste trabalho é fornecido um guia prático, descrevendo as diferentes etapas para estabelecer o acoplamento de sistemas SMPS e ICPMS e como usá-los. Três exemplos descritivos são apresentados.

Um guia prático sobre o acoplamento de um analisador de mobilidade de varredura e um espectrômetro de massa plasmática acoplado de forma indutível (SMPS-ICPMS)

Anticorpos que se ligam a receptores de alvo na superfície da pilha podem conferir alterações clusterização e conformação. Estas mudanças dinâmicas têm implicações para caracterizar o desenvolvimento de drogas em células-alvo. Este protocolo utiliza a microscopia confocal e espectroscopia de correlação de imagem através do ImageJ/FIJI para quantificar a extensão do receptor na superfície das células de clustering.

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Aqui nós apresentamos um guia prático de construção de um sistema integrado de microscopia, que mescla imagens de epi-fluorescente convencional, único-molécula detecção-baseado Super-resolução imagem e deteção de único-molécula multi cor, incluindo transferência de energia de ressonância de fluorescência de único-molécula de imagem, em um set-up de uma maneira custo-eficiente.

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Etiqueta-Free Imaging de único proteínas secretadas de células vivas através de iSCAT microscopia

Aqui, nós apresentamos uma aproximação combinatória usando a microscopia de alta resolução, as ferramentas computacionais, e a rotulagem da único-pilha em embriões vivos de C. elegans para compreender a única dinâmica da pilha durante o neurodevelopment.

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A formação de uma rede de sarcomere adequada é importante para o amadurecimento dos cardiomiócitos derivados do iPSC. Apresentamos uma abordagem baseada em super resolução que permite a avaliação quantitativa da maturação estrutural dos cardiomiócitos derivados de células-tronco, para melhorar as condições culturais que promovem o desenvolvimento cardíaco.

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Apresentamos um método para a aquisição de cursos de tempo de repórter fluorescência de células únicas usando matrizes micropatteradas. O protocolo descreve a preparação de matrizes unicelulares, a configuração e o funcionamento de microscopia de lapso de tempo de varredura de células vivas e uma ferramenta de análise de imagem de código aberto para pré-seleção automatizada, controle visual e rastreamento de cursos de tempo de fluorescência integrados por células por local de adesão.

Imagem de células vivas de matrizes unicelulares (LISCA) - uma técnica versátil para quantificar cinética celular

Aprenda a medir a confluência de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando um sistema automatizado de imagem. Este método avalia diferentes revestimentos de matriz extracelular sem perturbar o crescimento celular.

Medindo a confluência de iPSCs usando um sistema automatizado de imagem.

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