Avaliação da estrutura ocular global após o voo espacial usando um método de imagem de tomografia microcomputada (Micro-CT)

Aqui propomos um método de avaliação da estrutura ocular global após o voo espacial usando o método de imagem de tomografia microcomputóubra. O ambiente de voo espacial, que inclui paragravidade e exposição à radiação, causa mudanças únicas na fisiologia humana, incluindo mudanças de fluidos. Essas mudanças de fluido levam a uma pressão intracraniana elevada e tem sido atribuída como uma das principais causas da síndrome neuro-ocular associada ao voo espacial.

O impacto fisiológico da SANS impacta múltiplos componentes do olho e inclui edema de disco óptico, achatamento do globo, dobras choroidais e retina, mudanças de erro hiperópicas e refrativas e infratos de camada de fibra nervosa. Embora as características fisiológicas da SANS estejam bem documentadas, os mecanismos que impulsionam a SANS ainda são mal compreendidos. Para ter uma melhor compreensão da SANS, modelos de roedores estão sendo usados para técnicas de imagem não invasivas.

Uma dessas técnicas é a microCC, que tem sido utilizada com sucesso para a avaliação de estruturas anatômicas e processos patológicos em animais tão pequenos quanto camundongos. A microcsi tomografia pode alcançar uma resolução microdimensionada, e através da combinação com um agente de contraste, pode fornecer um bom contraste para os tecidos moles. A microcâmia fornece uma clara vantagem em relação aos métodos tradicionais, incluindo anatomia bruta, microscopia leve e exame de histologia para não causar danos ao perfil geométrico dos espécimes e às relações espaciais entre as estruturas.

Em nosso estudo atual, os camundongos foram expostos ao ambiente espacial por 35 dias a bordo da Estação Espacial Internacional para determinar se o ambiente espacial induz danos oculares quantificando a microestrutura da retina, RPE e camadas coroides usando micro-CT. Aqui demonstramos como preparamos amostras para análise micro-CT. Camundongos foram usados e olhos dentro de 38 mais ou menos quatro horas após o respingo para baixo.

Os olhos foram enucleados, e os olhos esquerdos foram fixados em 4% de paraformaldeído e tampões de fosfato salino por 24 horas. Após a fixação, os olhos estavam desidratados no etanol. Para evitar um encolhimento adicional e abrupto da amostra fixa, foi utilizada uma série de soluções etanoóicas classificadas.

Primeiro, as amostras foram transferidas para 50% de etanol por uma hora e, em seguida, aumentando as concentrações por uma hora cada, 70, 80, 90, 96 e 100%Depois, os olhos ficaram manchados com 10% de peso por volume de ácido fosfolipídico durante seis dias. Finalmente, as amostras foram lavadas em etanol absoluto e, em seguida, colocadas em recipientes plásticos individuais de dois moinhos cheios de etanol absoluto para digitalização. Uma almofada de algodão também foi adicionada para estabilizar a amostra durante a varredura.

Em seguida, a amostra foi colocada dentro de um scanner de micro-CT de raio-x skyscan 1272 para avaliar o dano na retina. Para digitalização, usamos o software SkyScan 1272. Depois de abrir o software, centralizemos nossa amostra no quadro.

Em nosso protocolo, não usamos filtro e definimos a matriz para aumentar o tamanho do pixel para quatro mícrons. O micro-posicionamento é usado para manter a amostra centrada no quadro. Em seguida, verificamos os parâmetros para maximizar o agente de contraste dentro de nossa amostra e calibrar a máquina.

Para realizar a calibração, removemos a amostra do scanner, e definimos os parâmetros de digitalização. Durante a calibração, uma correção plana também é verificada. Deve ser superior a 80% Após as calibrações, a amostra é reinserida na câmara de varredura.

Antes da digitalização, os arquivos de amostra são nomeados. Os parâmetros de digitalização são os seguintes, passo de rotação 0.4, quadros quatro, movimento aleatório 30, verificar duas vezes se o tamanho do pixel está definido para 4 mícrons. Então a varredura é iniciada.

Após a varredura, o NRecon é usado para reconstruir a amostra. Primeiro, abrimos os arquivos da varredura e visualizamos as imagens brutas de digitalização. Ajustamos o salto do histograma para caber dentro da curva.

Em seguida, corrigimos para o artefato de endurecimento do feixe. Então ajustamos o artefato de alisamento. Finalmente, corrigimos para a redução do artefato do anel.

Depois de todas as correções, confirmamos que nossas amostras se encaixam em nossa região de interesse. Então podemos começar a reconstrução. Usamos o software DataViewer para visualizar as imagens reconstruídas nos três campos.

Para análise, o software CTAn é usado. As imagens reconstruídas são carregadas no software. O nervo óptico foi usado para deliminar a região de interesse para análise.

Pelo cálculo, utilizamos a fatia média da região de interesse para realizar todas as medições para análise. Três medidas repetidas foram tomadas para calcular a medição linear da área. As seguintes medidas foram tomadas para tecidos oculares, retina, RPE, coroide e nossa análise microcânica mostrou que as áreas transversais da retina, RPE e camada coroide foram significativamente menores em amostras de voo espacial em comparação com os controles do solo.

A Micro-CT fornece técnicas eficientes e não destrutivas para calcular o tamanho das mudanças sem qualquer manipulação. Ao usar o agente de contraste, ele melhora a qualidade das imagens Micro-CT, que nos ajudam a obter uma imagem gráfica clara bem sucedida da reconstrução sem a interestrusão do espécime. Além disso, mostra que os dados originais são digitalmente, aumentando assim a acessibilidade e a reprodutibilidade dos achados.

Além disso, o propósito básico, é aceitável usar medidas tridimensionais, mas a segmentação da estrutura tridimensional bruta pode ser benéfica para fornecer contorno específico de toda a amostra. Nossos resultados indicam que as condições de voo espacial, especialmente as mudanças gravitacionais, podem induzir uma resposta aguda e de curto prazo no olho. Além disso, o trabalho futuro deve utilizar dados volumosos para realizar outras análises que aproveitem as capacidades de imagem microcâmica, uma vez que tem sido utilizada com sucesso para o estudo de muitos tecidos normais e patológicos.