Avaliação da oxidação celular usando uma proteína fluorescente verde específica do compartimento subcelular

Os atuais assessores de protocolo em têxteis, redox estado muda de forma intracelular com compartimento específico. Nosso protocolo permite uma melhor compreensão e monitoramento de todos os mecanismos fisiológicos ou fisiofisiológicos do estresse oxidativo. Esta técnica permite quantificação sem interrupções da relação de sulfeto de olho em células intactas usando uma saída métrica de razão para contrabalançar as diferenças entre níveis de expressão de sinal, branqueamento de fotos e sensibilidades de detecção.

Este protocolo pode ser aplicado a vários organismos, incluindo bactérias em plantas. No primeiro dia do experimento, o experimento tratou as células de uma linha de células cancerígenas de mama confluentes por dois minutos, com dois mililitros de 0,2, 5% de viagens em EDTA. Quando as células começam a se desprender, desprendem a reação com seis mililitros de meio completo e sedimentos as células por centrifugação.

Suspender a pelota em cinco mililitros de meio fresco e completo, contar as células e diluí-las para 1,5 vezes 10 para as quintas células por um mililitro de meio completo. Em seguida, semente 1,5 vezes 10 para a quinta células por mililitro de células por poço em uma placa de 6 poços, e incubar as células na incubadora de cultura celular durante a noite. Ou não adicionar transdução de linha viral GFP.

Na manhã seguinte, adicione 12,5, 25 e 50 microliters de um a 100 diluídos seis vezes 10 à 10ª placa formando unidades por mililitro de adicionar nenhuma solução GFP de corrosão viral, em meio completo. Adicione isso aos poços apropriados ou à placa de 6 poços para transduzir as células com 50, 100 e 200 multiplicidades de infecção, respectivamente. Quando todas as amostras de Wells tiverem sido transduzidas com vírus, devolva as células à incubadora de cultura celular por 16 a 24 horas.

No dia seguinte, visualize as células por microscopia de fluorescência e substitua o supernascer por médio, sem vírus para permitir que as células se recuperem por mais 24 horas. Para determinar a eficiência ideal de transdução, avalie a intensidade da fluorescência e a morfologia das células por citometria de fluxo. Certifique-se de conduzir todos os procedimentos que podem causar infecção de aerossóis ou respingos dentro de um armário de segurança biológica certificado de biossegurança dois.

Para avaliar o estado de redox das células, na manhã seguinte, incubar as células e os Poços apropriados da placa de 6 poços com 10 peróxido de hidrogênio micromolar por uma hora, antes de desacoplar as células com 750 microlitres de 0,2 5% gotejamentos em EDTA por bem, como demonstrado. Pare a reação com dois mililitros de meio completo por poço e puxe os supernantes para cada condição em tubos cônicos individuais de 15 mililitros. Sedimentar as células por centrifugação e lavar as pelotas em 500 microlitadores de PBS por bem por centrífugas duas vezes.

Após a segunda lavagem, filtre as suspensões celulares através de malhas de 40 micrometros em tubos compatíveis com citometria de fluxo no gelo, protegidos da luz. No software do citómetro Flow, execute a multiplicidade zero da amostra de controle de infecções. Em seguida, analise o peróxido de hidrogênio e células não tratadas.

Permitirá o cálculo da relação média de intensidade fluorescente entre as formas oxidadas versus reduzidas de RSG de linha, utilizando a fórmula conforme indicado. Aqui está a estratégia de gating para selecionar um grande número de células por citometria de fluxo é mostrada. A citometria de fluxo também pode ser usada para determinar a curva de resposta da dose para análise de GFP de linha e a multiplicidade mais eficiente de entrada de infecção.

De acordo com a multiplicidade de infecção, curva de resposta de dose nesta análise representativa, uma multiplicidade de 200 infecções deu a maior expressão de GFP rodoviário, mas a morfologia celular foi efetuada sugerindo citotoxicidade. Portanto, a eficiência de transdução ideal foi determinada como uma multiplicidade de infecção de 100. Nesta análise de status redox, foram obtidas intensidades médias de fluorescência de gfp de linha oxidada e reduzida a partir da análise de citometria de fluxo para o veículo e quatro tratamentos de peróxido de hidrogênio de controle positivo de 10 micromolar.

Os histogramas sobrepostos representam as mudanças no número de células nos 10 grupos de peróxido de hidrogênio micromolar e veículos tratados ou gfp de erode reduzida e oxidada. O cálculo da razão entre o GFP oxidado e a linha reduzida para esta análise revelou que 10 peróxido de hidrogênio micromolar causaram um aumento triplo na oxidação do GFP de linha em comparação com o tratamento do veículo. Ter números de células precisos é importante para cálculos de ressonância magnética e reprodutibilidade.

Para obter resultados reprodutíveis, os pesquisadores devem misturar completamente as soluções antivirais para obter suspensões homogêneas. Este protocolo permite que os pesquisadores estudem mudanças rápidas de redox como parte integrante da ampla gama de processos celulares normais e da progressão da doença em tempo real.