Avaliação da oxidação celular usando uma proteína fluorescente verde específica do compartimento subcelular
June 18th, 2020
Este protocolo descreve a avaliação do status de redox específico do compartimento subcelular dentro da célula. Uma sonda fluorescente sensível ao redox permite uma análise racionmétrica conveniente em células intactas.
Os atuais assessores de protocolo em têxteis, redox estado muda de forma intracelular com compartimento específico. Nosso protocolo permite uma melhor compreensão e monitoramento de todos os mecanismos fisiológicos ou fisiofisiológicos do estresse oxidativo. Esta técnica permite quantificação sem interrupções da relação de sulfeto de olho em células intactas usando uma saída métrica de razão para contrabalançar as diferenças entre níveis de expressão de sinal, branqueamento de fotos e sensibilidades de detecção.
Este protocolo pode ser aplicado a vários organismos, incluindo bactérias em plantas. No primeiro dia do experimento, o experimento tratou as células de uma linha de células cancerígenas de mama confluentes por dois minutos, com dois mililitros de 0,2, 5% de viagens em EDTA. Quando as células começam a se desprender, desprendem a reação com seis mililitros de meio completo e sedimentos as células por centrifugação.
Suspender a pelota em cinco mililitros de meio fresco e completo, contar as células e diluí-las para 1,5 vezes 10 para as quintas células por um mililitro de meio completo. Em seguida, semente 1,5 vezes 10 para a quinta células por mililitro de células por poço em uma placa de 6 poços, e incubar as células na incubadora de cultura celular durante a noite. Ou não adicionar transdução de linha viral GFP.
Na manhã seguinte, adicione 12,5, 25 e 50 microliters de um a 100 diluídos seis vezes 10 à 10ª placa formando unidades por mililitro de adicionar nenhuma solução GFP de corrosão viral, em meio completo. Adicione isso aos poços apropriados ou à placa de 6 poços para transduzir as células com 50, 100 e 200 multiplicidades de infecção, respectivamente. Quando todas as amostras de Wells tiverem sido transduzidas com vírus, devolva as células à incubadora de cultura celular por 16 a 24 horas.
No dia seguinte, visualize as células por microscopia de fluorescência e substitua o supernascer por médio, sem vírus para permitir que as células se recuperem por mais 24 horas. Para determinar a eficiência ideal de transdução, avalie a intensidade da fluorescência e a morfologia das células por citometria de fluxo. Certifique-se de conduzir todos os procedimentos que podem causar infecção de aerossóis ou respingos dentro de um armário de segurança biológica certificado de biossegurança dois.
Para avaliar o estado de redox das células, na manhã seguinte, incubar as células e os Poços apropriados da placa de 6 poços com 10 peróxido de hidrogênio micromolar por uma hora, antes de desacoplar as células com 750 microlitres de 0,2 5% gotejamentos em EDTA por bem, como demonstrado. Pare a reação com dois mililitros de meio completo por poço e puxe os supernantes para cada condição em tubos cônicos individuais de 15 mililitros. Sedimentar as células por centrifugação e lavar as pelotas em 500 microlitadores de PBS por bem por centrífugas duas vezes.
Após a segunda lavagem, filtre as suspensões celulares através de malhas de 40 micrometros em tubos compatíveis com citometria de fluxo no gelo, protegidos da luz. No software do citómetro Flow, execute a multiplicidade zero da amostra de controle de infecções. Em seguida, analise o peróxido de hidrogênio e células não tratadas.
Permitirá o cálculo da relação média de intensidade fluorescente entre as formas oxidadas versus reduzidas de RSG de linha, utilizando a fórmula conforme indicado. Aqui está a estratégia de gating para selecionar um grande número de células por citometria de fluxo é mostrada. A citometria de fluxo também pode ser usada para determinar a curva de resposta da dose para análise de GFP de linha e a multiplicidade mais eficiente de entrada de infecção.
De acordo com a multiplicidade de infecção, curva de resposta de dose nesta análise representativa, uma multiplicidade de 200 infecções deu a maior expressão de GFP rodoviário, mas a morfologia celular foi efetuada sugerindo citotoxicidade. Portanto, a eficiência de transdução ideal foi determinada como uma multiplicidade de infecção de 100. Nesta análise de status redox, foram obtidas intensidades médias de fluorescência de gfp de linha oxidada e reduzida a partir da análise de citometria de fluxo para o veículo e quatro tratamentos de peróxido de hidrogênio de controle positivo de 10 micromolar.
Os histogramas sobrepostos representam as mudanças no número de células nos 10 grupos de peróxido de hidrogênio micromolar e veículos tratados ou gfp de erode reduzida e oxidada. O cálculo da razão entre o GFP oxidado e a linha reduzida para esta análise revelou que 10 peróxido de hidrogênio micromolar causaram um aumento triplo na oxidação do GFP de linha em comparação com o tratamento do veículo. Ter números de células precisos é importante para cálculos de ressonância magnética e reprodutibilidade.
Para obter resultados reprodutíveis, os pesquisadores devem misturar completamente as soluções antivirais para obter suspensões homogêneas. Este protocolo permite que os pesquisadores estudem mudanças rápidas de redox como parte integrante da ampla gama de processos celulares normais e da progressão da doença em tempo real.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para avaliar o status redox específico do compartimento subcelular dentro das células usando uma sonda fluorescente sensível ao redox. Esta técnica permite a quantificação não disruptiva do estado redox em células intactas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Biologia do Redox
- Estresse Oxidativo
Fundo
- Entender os estados redox é crucial para estudar o estresse oxidativo.
- Sondas sensíveis ao redox fornecem insights sobre os mecanismos celulares.
- Mudanças no status redox podem indicar condições fisiológicas ou fisiopatológicas.
- Este método pode ser aplicado em vários organismos.
Propósito do Estudo
- Permitir o monitoramento do estresse oxidativo nas células.
- Fornecer um método não disruptivo para quantificar estados redox.
- Aprimorar a compreensão das respostas celulares a condições oxidativas.
Métodos Utilizados
- Uso de uma sonda fluorescente sensível ao redox.
- Análise ratiométrica para compensar diferenças de sinal.
- Aplicação do protocolo em vários tipos celulares, incluindo células cancerígenas.
- Tratamento celular e centrifugação para preparação da amostra.
Principais Resultados
- Quantificação bem-sucedida dos estados redox em células intactas.
- Demonstrou aplicabilidade em diferentes tipos celulares.
- Forneceu insights sobre os mecanismos fisiológicos do estresse oxidativo.
- Permitiu o monitoramento de mudanças redox em tempo real.
Conclusões
- Este protocolo é eficaz para avaliar o status redox nas células.
- Oferece uma ferramenta valiosa para estudar mecanismos de estresse oxidativo.
- O método pode ser adaptado para várias aplicações de pesquisa.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Assessing subcellular redox dynamics enables mechanistic de-risking in target validation by linking oxidative stress pathways to disease phenotypes. This method supports predictive confidence in preclinical models through quantitative, ratiometric readouts of cellular oxidation states. It provides translational continuity from discovery to lead identification by monitoring redox changes in living systems without disrupting cellular physiology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying redox shifts in response to oxidative stressors like H2O2.
- Operational Value: Enables functional target validation via subcellular compartment-specific resolution of roGFP signal.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by establishing dose-response relationships between oxidant exposure and GFP oxidation ratios.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline redox states in MDA-MB-231 cells.
- Operational Value: Delivers assay standardization through ratiometric measurement that corrects for expression variability and photobleaching.
- Scalability: Supports platform reuse across cell types and organisms as demonstrated in breast cancer and bacterial models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Biomarker Alignment: Connects redox measurements to disease-relevant systems using triple-negative breast cancer as a pathophysiological model.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by monitoring real-time redox changes during disease progression.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking by linking oxidative stress mechanisms to functional cellular outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work by providing redox status as a quantifiable biomarker.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring oxidation/reduction ratios in live cells.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility through flow cytometry-compatible sample preparation and gating strategies.
- Analytics: Delivers quantitative readouts via mean fluorescent intensity ratios of oxidized versus reduced roGFP forms.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling real-time monitoring of redox changes in disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for oxidative stress assessment across multiple projects and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in oxidative stress mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of redox measurements across experimental conditions.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early pathway de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative redox response thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, flow cytometry, and adenoviral transduction techniques.
- Needs instrumentation for dual-excitation fluorescence detection (405 nm and 488 nm) and emission at 525 nm.
- Demands cross-team standardization of transduction protocols, H2O2 treatment timing, and ratio calculation methods.
- Involves adaptation considerations for different subcellular targeting of roGFP constructs beyond cytosolic expression.
- Includes practical limitations such as cytotoxicity at high multiplicity of infection, requiring optimization for each cell type.
