Name: Isolamento dos núcleos tecilódico adiposos para aplicações genômicas unicelulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda a isolar núcleos de adipócitos maduros para análise transcriptômica unicelular. Este protocolo minimiza agregados nucleares e detritos celulares, permitindo perfilamento de alta qualidade em milhares de células.

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Gostaríamos de agradecer a David Reynolds do núcleo de Genômica Albert Einstein e Jinghang Zhang do Núcleo de Citometria de Fluxo pelo apoio técnico. Reconhecemos o apoio dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) (DK110426) e do Pilot and Feasibility Grants do Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) e do New York Obesity Research Center (DK026687) (todos para K.S.). Também gostaríamos de agradecer ao Albert Einstein Cancer Center (CA013330) pelo apoio do núcleo.

O cuidado e a experimentação em animais foram realizados de acordo com os procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina Albert Einstein.
1. Preparação de tampões de digestão tecidual e lise
<ol><li>Prepare o tampão de digestão do tecido.<ol>
<li>Prepare ~1 mL de tampão de digestão para cada grama de tecido adiposo.</li>
		<li>Pesar 1,5 U/mL colagenase D e 2,4 U/mL dispase II e adicionar soro fisiológico tamponado fosfato (PBS).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o tampão de preparação dos núcleos (NPB).<ol>
<li>Prepare 10 mM HEPES, 1,5 mM cloreto de magnésio, cloreto de potássio de 10 mM, 250 mM de sacarose e 0,1% NP-40 em água sem nuclease. Misture bem. A sacarose pode levar mais tempo para se dissolver do que os outros componentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 0,5% solução de gérico bovino (BSA).<ol>
<li>Prepare 0,5% BSA em PBS contendo EDTA. Recomenda-se o uso de PBS de cultura celular filtrada estéril (ver Tabela de Materiais).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Digestão enzimática do tecido adiposo
<ol><li>Dissecar camundongos para extrair tecido adiposo de acordo com Aune et al.13. Coletar tecido isolado em um prato contendo PBS. Transfira o tecido para uma toalha de papel para secar. Em seguida, coloque o tecido em um prato limpo.</li>
	<li>Adicione cloreto de cálcio ao tampão de digestão a uma concentração final de 10 mM. Adicione um pequeno volume de tampão de digestão ao prato e pique completamente o tecido adiposo. O volume do tampão de digestão necessário será baseado na quantidade de tecido isolado. Normalmente ~ 1 mL ou menos é usado.</li>
	<li>Adicione cerca de metade da quantidade de tampão de digestão preparado (por exemplo, ~10 mL para cinco camundongos) ao tecido picado. Usando uma pipeta sorológica, transfira a amostra para um tubo de centrífuga cônica de 50 mL. Adicione qualquer quantidade restante de tampão para lavar o prato e transfira para o tubo de 50 mL contendo a amostra. Pipeta para cima e para baixo várias vezes. Em seguida, incubar com agitação a 200-210 rpm a 37 °C para 12-15 min.</li>
</ol>3. Isolamento adipócito
<ol><li>Após a incubação, adicione 0,5% de BSA a uma proporção de 1:1 para a amostra. Misture bem por pipetting para cima e para baixo várias vezes. Centrifugar a amostra a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT) para girar a fração vascular estromada (SVF). A fração de adipócito permanecerá na camada superior da amostra.</li>
	<li>Coloque um filtro de célula de 40 μm em cima de um tubo de centrífuga cônica de 50 mL e filtre a amostra, coletando a camada superior e deixando para trás o SVF na parte inferior do tubo. Transfira a camada superior (fração de adipócito) para um novo tubo, virando o filtro de cabeça para baixo sobre o tubo e usando 0,5% de BSA para lavar o filtro e coletar a amostra no tubo.</li>
	<li>Leve o volume total de 0,5% BSA a 10-15 mL com base no tamanho da amostra e pipeta para cima e para baixo com uma pipeta sorológica ou agite brevemente para cima e para baixo para misturar a amostra. Centrifugar a amostra novamente a 300 x g por 5 min no RT.</li>
</ol>4. Isolamento dos núcleos
<ol><li>Use uma ponta de pipeta de furo largo e transfira cuidadosamente a camada superior da amostra para um filtro de célula de 100 μm colocado em cima de um novo tubo pré-filhinho no gelo, deixando para trás qualquer SVF residual.</li>
	<li>Enxágüe/lave o filtro com uma quantidade suficiente de NPB e descarte o filtro. A partir deste passo em frente tem a amostra no gelo o mais frequentemente possível e trabalhar rapidamente para evitar núcleos vazando e/ou insalubres. É útil para pré-gelo microcentrifugar tubos para serem usados em passos futuros no gelo.</li>
	<li>Coloque a amostra no gelo por não mais do que 2 minutos com a inversão suave intermitente do tubo para misturar. O tempo de incubação no gelo deve ser otimizado para o tamanho da amostra e o tipo de adipócitos. Centrifugar a 1.000 x g a 4 °C por 10 min.</li>
	<li>Remova o supernatante e resuspense a pelota em 1 mL de NPB. Transfira a amostra para um tubo de microcentrifuuagem limpo. Durante a transferência, evite tocar nas paredes do tubo, que contêm detritos e lipídios. Adicione 0,6 U/μL Inibidor de RNase à amostra e misture. Centrifugar novamente a 1.000 x g a 4 °C por 10 min. NOTA: A velocidade e o tempo de centrifugação devem ser diminuídos nesta etapa para amostras menores.</li>
	<li>Remova o supernasciente e resuspend em 1 mL de Tampão de Lavagem Nuclei (2% BSA/PBS + 0,6 U/μL RNase inibidor).</li>
	<li>Filtro duplo em um tubo limpo com filtros empilháveis de 30 μm. Lave o filtro com um pequeno volume (~300 μL) de Nuclei Wash Buffer. Alternativamente, para amostras menores, use um filtro de 30 μm que se encaixe em um tubo de microcentrifuuagem e filtre diretamente nele.</li>
	<li>Confirme o isolamento bem sucedido de núcleos saudáveis.<ol>
<li>Manche uma pequena alíquota da amostra com tripano e use um contador de células automatizado para avaliar o tamanho médio dos mortos e por cento das células mortas. O tamanho médio morto para uma amostra contendo principalmente núcleos deve variar entre 7-10 μm. O tamanho dos núcleos é geralmente em torno de 8 μm.</li>
		<li>Colorique uma pequena alíquota da amostra com DAPI e examine sob um microscópio com um objetivo de 20x ou superior. A membrana nuclear deve estar intacta e os núcleos devem estar redondos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ETAPA DE limpeza e concentração de núcleos FACS
<ol><li>Proceda imediatamente ao passo FACS para limpar núcleos e remover quaisquer detritos em excesso. O buffer de coleta deve conter o tampão de lavagem dos núcleos. Durante o FACS, o buffer é diluído. Preparar uma maior concentração de inibidor de BSA e RNase para explicar a diluição durante a triagem é útil. O bloco de coleta FACS deve estar no modo de resfriamento.</li>
	<li>Após a triagem dos núcleos, centrífuga a 500 x g por 5 min a 4 °C para concentrar a amostra. Reconstituir em um volume apropriado de Buffer de Lavagem de Núcleos para alcançar uma concentração de 500-1.500 núcleos/μL. Não tente remover todo o supernatante. Isso resultará na perda de núcleos.</li>
	<li>Use um hemócito e uma alíquota manchada de DAPI para uma contagem final e para visualizar os núcleos. Em seguida, proceda imediatamente com snRNA-seq de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
</ol>

<ol><li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).</li>
<li>Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+evidence+for+active+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans%3A+effects+of+cold+exposure+and+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).</li>
<li>Yoneshiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruited+brown+adipose+tissue+as+an+antiobesity+agent+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+brown+adipose+tissue+by+a+%CE%B23-adrenergic+receptor+agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).</li>
<li>Song, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-+and+high-thermogenic+brown+adipocyte+subpopulations+coexist+in+murine+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).</li>
<li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CL316%2C243+and+cold+stress+induce+heterogeneous+expression+of+UCP1+mRNA+and+protein+in+rodent+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+stress+induces+glycolytic+beige+fat+formation+via+a+myogenic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state.</a> Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PloS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Transcriptional+and+Epigenomic+Profiling+from+Specific+Cell+Types+within+Heterogeneous+Tissues+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nature Communications. 8, 14049(2017).</li>
<li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).</li>
<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+full-length+total+RNA+sequencing+uncovers+dynamics+of+recursive+splicing+and+enhancer+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs.</a> Nature Communications. 9 (1), 619(2018).</li>
<li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+chromatin+landscapes+of+human+immune+cell+development+and+intratumoral+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion.</a> Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li>
<li>Peterson, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+quantification+of+proteins+and+transcripts+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells.</a> Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Um método simples e robusto para isolar núcleos únicos e estudar a heterogeneidade do tecido adiposo é apresentado. Comparado ao sequenciamento de RNA de tecido inteiro, este fluxo de trabalho oferece uma visão imparcial da heterogeneidade celular e marcadores específicos da população. Isso é significativo e inovador para o avanço da biologia adipócito, metabolismo molecular e pesquisa sobre obesidade.
Este protocolo é particularmente otimizado para a aplicação a jusante de snRNA-seq. O passo ...

Estudos mostraram que o tecido adiposo marrom (BAT) tem uma capacidade notável de dissipar energia. Dois tipos de adipócitos termogênicos com características distintas do desenvolvimento existem tanto em roedores quanto em humanos: adipócitos bege e adipócitos marrons clássicos. Enquanto os adipócitos marrons clássicos estão localizados principalmente em depósitos de BAT interscapulares, adipócitos beges emergem esporadicamente em tecido adiposo branco (WAT) em resposta a certos sinais fisiológicos, como exposição ao frio crônico, um processo chamado de "browning" ou "beiging". Através do uso de imagens avançadas, agora está claro que os seres humanos adultos possuem depósitos substanciais de UCP1+ BAT, especialmente na região supraclavicular1,,2,,3,4. A quantidade de BAT humano adulto se correlaciona inversamente com adiposidade e pode ser aumentada por pistas externas, como exposição ao frio crônico5,,6 ou β3-adrenergic receptor agonista7. O gasto energético mediado pelo BAT pode oferecer uma abordagem viável para combater a obesidade.
Até recentemente, os adipócitos termogênicos têm sido considerados uma população homogênea. No entanto, estudos revelaram a existência de múltiplos subtipos ou subpopulações distintas em origem desenvolvimento, uso de substrato e transcriptome8,,9,,10. Por exemplo, um tipo de adipócito bege que usa preferencialmente glicose para termogênese, o adipócito g-bege, foi recentemente descrito10. A compreensão incompleta dos tipos celulares no tecido adiposo marrom e bege e a falta de marcadores específicos constituem uma barreira crítica para estudar suas funções biológicas.
Os métodos tradicionais para isolar subpopulações de células são baseados na expressão de apenas alguns genes marcadores conhecidos. Os recentes avanços na genômica unicelular permite o uso de dados globais de expressão genética de células únicas para fornecer uma estimativa imparcial do número de subpopulações em um tecido. O objetivo final deste protocolo é determinar todos os subtipos de tecido adiposo sob vários estímulos termogênicos em uma resolução unicelular. Em contraste com outros tecidos e tipos celulares, determinar subtipos celulares de tecido adiposo é desafiador devido à fragilidade dos adipócitos preenchidos com lipídios. Este artigo introduz um protocolo robusto para isolar núcleos únicos do tecido adiposo para aplicação a jusante ao sequenciamento snRNA. É importante ressaltar que a literatura recente comparando o sequenciamento de RNA uninuclei bem combinado (snRNA-seq) e os conjuntos de dados de sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) revelaram que o snRNA-seq é comparável ao scRNA-seq na detecção do tipo celular e superior na cobertura celular para um tecido complexo como o cérebro11. Este protocolo combina um método de centrifugação de gradiente de densidade otimizado para tecidos adiposos por Rosen et al.12 com um passo de "limpeza" de núcleos com um Sorter de Alta Velocidade MoFlo XDP. Como visto nos resultados representativos, uma análise de 7.500 núcleos únicos do tecido adiposo marrom interscapular do rato identificou vários tipos de células dentro de adipócitos marrons aparentemente homogêneos. No geral, este protocolo simples e robusto pode ser aplicado para estudar a organização de nível tecidual de adipócitos e células residentes de adiposos, identificação de genes marcadores específicos do subtipo e fenotipagem de desenvolvimento de camundongos eliminatórios/transgênicos adiposos.

<table><tbody><tr><td>Solução de Enxágue autoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>PBS com EDTA; filtro de</td></tr> célula <tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr> com filtro <tr><td>estéril 100 &mu; m</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Cell filter 40&mu; m</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics (30 &mu; m)</td> <td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Condessa II FL Contador de Células Automatizado</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (30 &micro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td>Filtros empilháveis</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>MoFloXDP Cell Sorter</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Protetor Inibidor de RNase</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher</td><td>S5-3</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento dos núcleos tecilódico adiposos para aplicações genômicas unicelulares

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

A gordura marrom e bege são tecidos adiposos especializados que dissipam energia para termogênese pela UCP1 (Uncoupling Protein-1) -dependent and independent pathways. Até recentemente, os adipócitos termogênicos eram considerados uma população homogênea. No entanto, estudos recentes indicaram que existem múltiplos subtipos ou subpopulações que são distintos na origem do desenvolvimento, uso de substrato e transcriptome. Apesar dos avanços na genômica unicelular, a decomposição imparcial dos tecidos adiposos em subtipos celulares tem sido desafiadora devido à natureza frágil dos adipócitos preenchidos com lipídios. O protocolo apresentado foi desenvolvido para contornar esses obstáculos pelo isolamento efetivo de núcleos únicos do tecido adiposo para aplicações a jusante, incluindo sequenciamento de RNA. A heterogeneidade celular pode então ser analisada por sequenciamento de RNA e análises bioinformáticas.

Núcleos adipócitos não variados contêm detritos e doublets que criam ruído e fundo alto no sequenciamento de RNA de célula única a jusante. A estratégia representativa do portão FACS é mostrada na Figura 1. Os núcleos foram selecionados primeiro com base na dispersão dianteira (FSC) e dispersão lateral (SSC) (A),depois, apenas singlets foram selecionados com base na combinação de largura e alturas de SSC (B). Finalmente, apen...

Esta publicação descreve um protocolo para o isolamento de núcleos de adipócitos maduros, purificação por classificação ativada por fluorescência e transcrição de nível unicelular.

Isolamento dos núcleos tecilódico adiposos para aplicações genômicas unicelulares

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

A decomposição do tecido adiposo em subtipos tem sido desafiadora porque a natureza frágil do adipócito. Este protocolo foi desenvolvido para superar isso pelo isolamento efetivo de núcleos únicos. Este fluxo de trabalho fornece núcleos únicos altamente purificados com agregados nucleares minimizados e detritos celulares.Isso é vantajoso para o perfil de transcrição de células únicas de milhares de células. Este protocolo simples e robusto pode ser aplicado para estudar a organização do nível de tecido de adipócito em suas células residentes adiposas. E, em particular, para o desenvolvimento de fenotipagem, nocaute adiposo e camundongos transgênicos.A demonstração visual deste protocolo é fundamental para que as pessoas que não têm muita experiência em lidar com adipócitos possam replicar e discernimento sobre a heterogeneidade adiposa. Depois de coletar tecido adiposo de camundongos, bata-o seco com uma toalha de papel, e coloque-o em um prato limpo. Adicione cloreto de cálcio ao tampão de digestão a uma concentração final de 10 mM.Em seguida, adicione um pequeno volume ao tecido e pique-o completamente. Adicione cerca de metade da quantidade de tampão de digestão preparado ao tecido picado. E use uma pipeta sorológica para transferir a amostra para um tubo de centrífuga de 50 mL.Lave o prato com o tampão restante e adicione-o ao tubo de 50 mL. Pipeta a amostra para cima e para baixo várias vezes. Em seguida, incuba-o por 12 a 15 minutos a 37 graus Celsius enquanto treme a 200 a 210 rpm.Após a incubação, adicione 0,5% de BSA à amostra em uma proporção de volume de 1 a 1 e misture bem por pipetação. Centrifugar a amostra a 300 xg por cinco minutos à temperatura ambiente para girar a fração estromovascular deixando a fração de adipócito em cima. Filtre a fração superior através de um filtro de célula de 400 m em um tubo de 50 mL.Em seguida, vire o filtro de cabeça para baixo sobre o tubo e transfira os adipócitos para um novo tubo usando 0,5% BSA para lavar o filtro reversa. Leve o volume total da BSA para 10 a 15 mL e pipeta a amostra para cima e para baixo com pipeta sorológica. Em seguida, centrifuá-lo novamente a 300 xg por cinco minutos em temperatura ambiente.Após a centrifugação, use uma ponta de pipeta larga para transferir cuidadosamente a camada superior da amostra para um filtro de célula de 100 m em cima de um novo tubo pré-refrigerado no gelo. Enxágüe o filtro com uma quantidade suficiente de tampão de preparação de núcleos e, em seguida, descarte-o. A partir deste passo em frente, mantenha uma amostra no gelo e trabalhe rapidamente.Deixe a amostra no gelo por até dois minutos invertendo intermitentemente o tubo para misturar. Em seguida, centrífuga a 1000 xg e 4 graus Celsius por 10 minutos. Remova o supernatante e resuspense a pelota em 1 mL de tampão de preparação de núcleos.Transfira a amostra para um tubo de microcentrifuuagem limpo, cuidando para evitar tocar nas paredes do tubo antigo. Adicione 0,6 unidades por inibidor L RNase e misture-o. Em seguida, centrifugar a amostra por mais 10 minutos.Remova o supernatante e resuspenja uma pelota e 1 mL de tampão de lavagem de núcleos. Filtre duas vezes a amostra em um tubo limpo usando filtros empilháveis de 30 m. Em seguida, lave os filtros com cerca de 300 L de tampão de lavagem de núcleos.Para confirmar o isolamento bem-sucedido de núcleos saudáveis, colori uma pequena alíquota da amostra com tripano e use um contador celular automatizado para avaliar o tamanho médio dos mortos e por cento das células mortas. Colora em uma pequena alíquota da amostra com DAPI e examine-a sob um microscópio com um objetivo de 20X ou superior. Os núcleos devem ser redondos e ter uma membrana nuclear intacta.Setas brancas indicam núcleos sem uma membrana intacta. Depois de limpar os núcleos com FACS, concentre esta amostra por centrifugação a 500 xg por cinco minutos a 4 graus Celsius. Em seguida, reconstitua-o em um volume apropriado de tampão de lavagem de núcleos.Para alcançar um 50 a 1500 núcleos por concentração de L e proceder com núcleos unicelulares RNA seq. Para remover detritos celulares e dobras, núcleos de adipócitos são classificados para tamanho e granularidade para excluir agregados nucleares e multiplets. E finalmente para eventos positivos da DAPI.Esta estratégia de classificação resulta em núcleos únicos altamente purificados com agregados mínimos e detritos. Quando inspecionados por microscopia, os núcleos classificados devem ser redondos e ter uma membrana intacta. A purificação bem sucedida dos núcleos também pode ser realizada com qRT-PCR em tempo real usando primers para ucp1 mRNA nascente, um gene marcador para adipócitos marrons.A plataforma de cromo determinou um transcriptome de 7500 núcleos de tecido adiposo marrom murine interscapular. Sete tipos diferentes de células foram revelados com redução de dimensionalidade t-SNE e agrupamento k-meio. Todos os clusters expressaram Fabp4, um gene de adipócito pan e um subconjunto expresso um alto nível de Ucp1 mRNA.Os núcleos se isolaram e confirmaram que este protocolo pode ser submetido a praticamente qualquer plataforma de expressão genética de nível de célula única, incluindo o Cromo de 10x Genômica.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Devido à conexão drástica e negativa entre a obesidade e outras comorbidades, a investigação sobre o papel adiposo desempenha na doença e na saúde global é garantido. Apresenta-se um protocolo para o isolamento e a excisão de depósitos adiposos que permitam o estudo de tecido adiposo usando in situ e in vitro.

Localização, identificação e excisão de Depots Murino adiposo

O isolamento de núcleos únicos depende da dissociação e da permeabilização baseada em detergente da membrana celular, passos que precisam de otimização e são propensos a introduzir artefatos técnicos. Demonstramos um protocolo detergente e sem enzimas para o rápido isolamento de núcleos intactos diretamente de todo o tecido, produzindo núcleos adequados para RNA-seq de núcleo único (snRNA-Seq) ou ATAC-seq.

Isolamento de núcleos de tecido inteiro usando um método detergente e sem enzimas

Este protocolo descreve a abordagem técnica para isolar subpopulações de células estromais adipogênicas e fibroinflamatórias de depósitos de tecido adiposo branco intra-abdominal murino (WAT) por classificação de células ativadas por fluorescência ou separação de esferas imunomagnéticas.

Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos

Este estudo descreve um novo método de isolamento de adipócitos marrons murinos para análise da expressão gênica e proteica.

Isolando Adipócitos Castanhos do Tecido Adiposo Castanho Interescapular Murino para Análise da Expressão Gênica e Proteica

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar núcleos de alta qualidade de rins de camundongos congelados que melhoram a representação de tipos de células renais medulares e evitam os artefatos de expressão gênica da dissociação do tecido enzimático.

Isolamento de Núcleos do Rim de Rato Adulto para Sequenciamento de RNA de Núcleo Único

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar núcleos de tecidos hepáticos arquivados congelados por flash para RNA-seq, ATAC-seq de núcleo único e multiômica articular (RNA-seq e ATAC-seq).

Isolamento de núcleos de tecido hepático congelado por flash para multiômica unicelular

Apresentamos um protocolo para ensaio de cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) especificamente em adipócitos usando classificação nuclear com tecidos adiposos isolados de camundongos repórteres transgênicos com marcação de fluorescência nuclear.

ATAC-Seq específico de adipócitos com tecido adiposo usando classificação de núcleo ativado por fluorescência

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a preparação de núcleos celulares. Após microdissecção e dissociação enzimática do tecido cardíaco em células únicas, as células progenitoras foram congeladas, seguidas pelo isolamento de células viáveis puras, que foram usadas para sequenciamento de RNA de núcleo único e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com análises de sequenciamento de alto rendimento.

Isolamento de Núcleos de Células Progenitoras Cardíacas de Camundongos para Perfil de Epigenoma e Expressão Gênica em Resolução Unicelular

O estudo descreve um protocolo simples, rápido e parcialmente automatizado para isolar núcleos de alta qualidade de tecidos congelados de mamíferos para sequenciamento de RNA de núcleo único a jusante.

Um Protocolo Simples, Rápido e Parcialmente Automatizado para o Isolamento de Núcleos Únicos de Tecidos Congelados de Mamíferos para Sequenciamento de Núcleo Único

A biologia do tecido adiposo intermuscular (MAT) é amplamente inexplorada devido à acessibilidade limitada do tecido humano. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para isolamento de núcleos e preparação de biblioteca de IMAT humano congelado para sequenciamento de RNA de núcleo único para identificar a composição celular deste depósito adiposo único.

Isolamento de Núcleos do Tecido Adiposo Intermuscular Humano e Sequenciamento de RNA de Núcleo Único a Jusante

Aprenda a isolar núcleos de adipócitos maduros para análise transcriptômica unicelular. Este protocolo minimiza agregados nucleares e detritos celulares, permitindo perfilamento de alta qualidade em milhares de células.

Isolamento dos núcleos tecilódico adiposos para aplicações genômicas unicelulares

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