Name: Ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado para estudar m5C modificação em Arabidopsis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprenda o ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado (MeRIP) para identificar modificações m5C em Arabidopsis. Esta técnica enriquece fragmentos de RNA metilados sem tratamentos químicos agressivos.

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Este trabalho foi apoiado por um subsídio de doutorado do IMPRS à E.S, uma Bolsa de Longo Prazo da EMBO para v.P., e fundos internos do MPI-MPP para f.K. Parte deste trabalho também foi financiado através do PLAMORF, um projeto que recebeu financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC) sob o programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia (Grant Agreement No. Os autores gostariam de agradecer a Federico Apelt pela análise bioinformática e comentários sobre o manuscrito, e Mathieu Bahin e Amira Kramdi pela análise bioinformática.

1. Preparando o RNA
<ol><li>Triture 200 mg de tecido vegetal em pó em nitrogênio líquido, certificando-se de que o tecido permaneça congelado durante todo o procedimento.</li>
	<li>Extrair o RNA do tecido vegetal desejado seguindo um protocolo de extração de tiocianato-cloronato ácido guanidinium-phenol-clorofórmio. Para diminuir a possibilidade de contaminar o RNA com DNA durante a separação de fase, use 1-bromo-3-cloropropano em vez de clorofórmio.<ol>
<li>Adicione 1 mL de reagente de extração de RNA contendo tiocianato de guanidina e fenol ácido ao tecido vegetal moído (500 μL por tecido de 100 mgs). Misture bem invertendo e certifique-se de que todo o tecido está molhado. Incubar por 10 minutos à temperatura ambiente para dissociar os complexos ribonucleoproteínos.</li>
		<li>Centrifugar por 10 min a 12.000 x g a 4 °C e transferir o supernasal para um novo tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione 200 μL de 1-bromo-3-cloropropano (100 μL por 500 μL reagente de extração de RNA) e vórtice vigorosamente.</li>
		<li>Centrifugar por 15 min a 12.000 x g a 4 °C e transferir a fase aquosa superior (aproximadamente 500 μL) para um novo tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione 1 volume de isopropanol (500 μL) e 0,1 volume de acetato de sódio de 3 M pH 5,5 (50 μL), misture bem invertendo e precipitando 10 min a -20 °C. NOTA: Recomenda-se o uso de acetato de sódio (NaOAc) para aumentar a precipitação do RNA. O protocolo pode ser pausado neste momento prolongando a precipitação do RNA por algumas horas ou até mesmo durante a noite.</li>
		<li>Centrifugar por 30 min a 12.000 x g a 4 °C e descartar o supernaspe.</li>
		<li>Lave a pelota duas vezes com 500 μL de 80% EtOH, centrífuga por 5 min a 12.000 x g a 4 °C e descarte.</li>
		<li>Lave a pelota uma vez com 500 μL 99% EtOH, centrífuga por 5 min a 12.000 x g a 4 °C e descarte.</li>
		<li>Seque a pelota por 5-10 min e dissolva em 30 μL de H2O sem RNase. NOTA: Em vez disso, use qualquer protocolo de extração de RNA de escolha (por exemplo, um sistema baseado em colunas). Se uma digestão DNase estiver incluída no protocolo, pule-a na etapa seguinte (etapa 1.3).</li>
	</ol></li>
	<li>Meça a concentração de RNA (por exemplo, com o uso de um espectrofotômetro) e digerir 20 μg de RNA com DNase. NOTA: O DNA é rico em m5C e o anticorpo não distingue entre DNA e RNA.<ol>
<li>Em uma reação típica de DNase, trate 10 μg de RNA em uma reação de 50 μL. Misture os seguintes componentes e incubar a reação a 37 °C por 30 min: 10 μg de RNA x μL 10x Buffer DNase 5 μL DNase 1 μL (2 unidades) H2O sem rnase até 50 μL</li>
		<li>Remova a enzima adicionando um volume apropriado de reagente de inativação DNase (se estiver incluído no kit DNase e de acordo com as instruções do fabricante) ou realizando uma etapa de limpeza (por exemplo, purificação da coluna ou extração de fenol/clorofórmio).</li>
	</ol></li>
	<li>Verifique a qualidade e pureza do RNA isolado por eletroforese capilar e proceda se o número de integridade do RNA (RIN) for superior a 7, para garantir que as amostras sejam de boa qualidade.</li>
	<li>OPCIONAL: Remova o RNA ribossômico para enriquecer as amostras em conteúdo mRNA usando um kit de remoção de rRNA e de acordo com o protocolo do fabricante.<ol>
<li>Use o RNA tratado de DNase da etapa anterior para a reação de esgotamento do rRNA( s). Realize múltiplas reações se a quantidade de RNA total for superior à quantidade máxima sugerida para a reação.</li>
		<li>Observe que apenas 5-10% do valor de entrada será recuperado após o esgotamento do rRNA. Proceda com o RNA esgotado rRNA (quantidade igual para todas as amostras) e ignore os valores mencionados nas etapas seguintes, como se referem ao RNA total. NOTA: Para comparação e descrição dos métodos de esgotamento do rRNA disponíveis, consulte as referências 38,39,40. rRNA é a maior parte do RNA total e é m5C metilado em muitos organismos.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare com antecedência transcrições in vitro (IVT) para serem usadas como sequências de RNA de controle e adicione-as nas amostras.<ol>
<li>Produzir dois IVTs distintos usando um kit de transcrição in vitro, um com nucleosídeos não metilados e outro onde o rCTP é substituído por 5-metil-rCTP, para servir como controles negativos e positivos no MeRIP, respectivamente. As transcrições preparadas foram as da EGFP e renilla luciferase. NOTA: Os IVTs não devem existir no transcriptome do organismo que você está analisando. Se os IVTs forem do mesmo modelo (por exemplo, ambos EGFP), adicione o controle positivo e negativo em duas amostras diferentes. Se sua sequência for diferente (por exemplo, EGFP e Renilla), elas podem ser adicionadas à mesma amostra.</li>
		<li>Pico em cada amostra 0,1 ng IVT por 3 μg de RNA, como controles.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonicar o RNA para aproximadamente 100 fragmentos. NOTA: As condições para a cisalhamento de RNA devem ser ajustadas com antecedência e diferem para cada sonicator. Para o modelo utilizado aqui, a sônica é realizada com as seguintes condições: Pico de potência 174, Fator dever 10, Ciclos/estouro 200, 17 min.<ol>
<li>Sonicate a mesma quantidade de RNA para todas as amostras, pelo menos 12 μg RNA por amostra em 80 μL de volume total (min 60 μL, máximo 100 μL), preenchido com H2O sem RNase.</li>
	</ol></li>
	<li>Confirme a eficiência da sônica e a concentração das amostras de RNA por eletroforese capilar. O tamanho médio do RNA fragmentado deve ser de cerca de 100 nt.</li>
</ol>2. Imunoprecipitação de RNA metilada (MeRIP)
<ol><li>Em tubos de baixa ligação, adicione 9 μg de RNA sonicado e H2O sem RNase até 60 μL (ou mais, dependendo da concentração).</li>
	<li>Dissociar as estruturas secundárias aquecendo o RNA a 70 °C em um banho de água por 10 minutos e esfriando por mais 10 minutos em uma mistura de água gelada.</li>
	<li>Divida a amostra em três partes: um terço (20 μL, se 60 μL foram tomados na etapa 2.1) é salvo em um tubo separado a -80 °C como a amostra de entrada. Encha os 40 μL restantes com H2O sem RNase até 860 μL e depois divida em dois tubos de baixa ligação: um para IP e outro para o controle Mock (430 μL cada).</li>
	<li>Adicione aos dois tubos: 50 μL de tampão MeRIP 10x 10 μL do inibidor de RNase 10 μL de anticorpo α-m5C (10 μg) na amostra IP por 10 μL de H2O na amostra Mock NOTA: O clone de anticorpos usado anteriormente não está mais disponível comercialmente. No entanto, qualquer anticorpo monoclonal anti-5-metilcittosina deve funcionar da mesma forma. Os anticorpos devem ser testados para especificidade antes de utilizados para MeRIP11,23.</li>
	<li>Sele os tubos com parafilm e incubar por 12-14 horas a 4 °C, com rotação aérea.</li>
	<li>No dia seguinte, prepare as contas magnéticas da proteína G para a ligação.<ol>
<li>Para cada tubo (controle IP ou Mock), use 40 μL de contas. Adicione a quantidade total de contas (# de tubos x 40 μL, por exemplo, para 2 amostras de IP e 2 Simuladas, são necessários 160 μL de contas) em um tubo de 15 mL e lavar três vezes com 800 μL de 1x tampão MeRIP por amostra (# de tubos x 800 μL tampão, por exemplo, 3,2 mL para 2 amostras DE IP e 2 Simulações).</li>
		<li>Realizar lavagens em temperatura ambiente por 5 minutos com rotação aérea, coletar as contas com a ajuda de um rack magnético e descartar o tampão de lavagem. Após a terceira lavagem, resuspenque as contas no mesmo volume de 1x tampão MeRIP como o volume inicial de contas colhidas (# de tubos x 40 μL, por exemplo, 160 μL de 1x tampão MeRIP para 2 ip e 2 amostras simuladas). NOTA: A quantidade de proteínas G utilizadas é determinada pela capacidade de vinculação das contas para o tipo de anticorpo específico e a quantidade de anticorpos utilizados. Neste caso, as contas têm uma capacidade de ligação de aproximadamente 8 μg de IgG por mg de contas e concentração de 30 mg/mL. Portanto, 40 μL são suficientes para ligar aproximadamente 9,6 μg de anticorpo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 40 μL de contas resuspendadas a cada amostra IP e Mock e incubar por 2 horas adicionais a 4 °C, com rotação aérea.</li>
	<li>Coloque os tubos em um rack magnético por 1 min e descarte o supernatante ou salve-o como um controle (amostra de RNA não vinculada).</li>
	<li>Lave as contas 5 vezes por resuspending em 700 μL de 1x tampão MeRIP fornecido com 0,01% Tween 20 e incubação por 10 minutos em temperatura ambiente com rotação aérea.</li>
	<li>Resuspengue as contas lavadas em 200 μL de tampão de digestão Proteinase K e adicione 3,5 μL de Proteinase K. Incubar por 3 horas a 50 °C, tremendo a 800 rpm. Ocasionalmente, gire manualmente a parte inferior do tubo se um sedimento de contas estiver se formando durante a incubação.</li>
	<li>Extrair o RNA por adição de 800 μL de reagente de extração de RNA e seguindo um protocolo de extração de tiocianato-fenol-clorofórdo ácido de guanidinium, e continuar como na etapa 1.2. Para aumentar a visibilidade da pelota de RNA, um co-precipitante colorido pode ser adicionado em isopropanol na etapa de precipitação. Resuspenha a pelota em 20 μL de H2O sem RNase (ou igual ao volume de entrada mantido na etapa 2.3).</li>
</ol>3. Análise a jusante
<ol><li>Envie as amostras de Entrada e IP para sequência de extremidade única com 50 bases de comprimento de leitura (SE50).</li>
	<li>Corte os adaptadores finais de 3' usando cutadapt41 e descarte leituras mais curtas que 48 nt.</li>
	<li>Mapa aparado lê para o genoma arabidopsis (anotação TAIR10) usando STAR42 com um corte de 6% para incompatibilidades e tamanho máximo intron de 10 kb. Mantenha leituras exclusivamente mapeadas para análises posteriores.</li>
	<li>Identifique fragmentos de RNA enriquecidos em amostras de IP em comparação com a Entrada usando dois métodos distintos e considere aqueles que são encontrados significativamente enriquecidos por ambos.<ol>
<li>Primeiro, detecte picos de MeRIP-seq usando o pico MACS243 em IPs agrupados versus Entrada.</li>
		<li>Em segundo lugar, siga a análise para merip-seq peak chamada como descrito em Meyer et al.22 e Yang et al.17.<ol>
<li>Usando scripts R personalizados, divida o genoma em distintas janelas de 25 nt e conte o número de leituras mapeadas exclusivamente para cada janela com base na posição do último nucleotídeo mapeado (uma vez que as leituras se originam de fragmentos de RNA de 100 nt).</li>
			<li>Calcule janelas significativamente enriquecidas em amostras de IP em comparação com a entrada com o Teste Exato de Fisher. Use o procedimento Benjamini-Hochberg para corrigir para vários testes.</li>
			<li>Mantenha os picos significativamente enriquecidos que se estendem por pelo menos duas janelas consecutivas e descarte picos que cobrem apenas uma janela.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identificar regiões anotadas do genoma (transcrições) com picos significativamente enriquecidos encontrados por ambos os métodos.</li>
	<li>Alternativamente ou complementarmente, teste metas específicas de RNA para seu enriquecimento nas amostras de IP.<ol>
<li>Transcreva inversa o RNA (mesmo volume de amostras de Entrada, IP e Mock) com hexamers aleatórios.</li>
		<li>Execute pcr quantitativo em tempo real nos alvos escolhidos, comparando Entrada, IP e Simulação através do método ΔΔCt. NOTA: O produto gerado não deve ser superior a 100 bp, pois este é o tamanho médio da fragmentação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm conflito de interesses para divulgar.

O RNA carrega mais de cem modificações de base distintas4 que formam o epitranscriptome44. Essas modificações adicionam uma camada adicional de regulação da tradução e sinalização (revisada em5,6,8,20,45,46). Estudos iniciais foram capazes de detectar a presença de modificações pós-transcrição no RNA28,47, mas as RNAs modificadas específicas precisam ser identificadas para entender o papel da epitranscriptomia. O MeRIP foi projetado como um método para mapear os sites de metilação de RNA transcriptome-wide21,22. Pode ser adaptado a qualquer modificação, se um anticorpo específico estiver disponível.
A principal força deste protocolo é que é relativamente simples, seguro para o RNA e para o usuário (por exemplo, 5-azaC é altamente tóxico para plantas e seres humanos) e não requer sequência ou modificação de informações enzimáticas. Além disso, o enriquecimento de RNAs metiladas pelo PI aumenta as chances de baixa abundância de mRNAs serem detectados, ao contrário do sequenciamento de bisulfoto que não contém um passo de enriquecimento. Quando duas rodadas seriais de MeRIP são realizadas, o enriquecimento em fragmentos de RNA contendo locais de metilação aumenta ainda mais22. Uma das limitações do MeRIP, especialmente quando aplicado aos estudos de metilação de mRNA, é a alta quantidade de RNA necessária como insumo para o ensaio. A etapa de ribodepletion – ou poli(A) – reduzirá o fundo causado pelo RNA ribossômico fortemente modificado, mas remove mais de 90% do RNA total. O DNA também deve ser completamente removido, pois é rico em citosinas de 5 metilados. Outra desvantagem é a menor resolução da posição exata da metilação. A sônicação do RNA antes da incubação com o anticorpo ajuda nessa direção, reduzindo a região contendo a modificação para 100-200 nucleotídeos. Quando o MeRIP é combinado com sequenciamento profundo, a resolução da previsão do local m5C aumenta à medida que as leituras de sequenciamento formam uma distribuição gaussiana em torno do potencial local de metilação. Além disso, a especificidade do anticorpo precisa ser confirmada antes do ensaio (por exemplo, com ensaios de manchas de ponto RNA, realizadas com oligos sintetizados com nucleotídeos modificados), no entanto, até que ponto um anticorpo pode realmente distinguir entre modificações intimamente relacionadas (por exemplo, m6A e m6Am) é um ponto de discussão no campo48,49. Além disso, rnas altamente estruturadas podem interferir na interação anticorpo-antígeno, outra restrição que é abordada principalmente com fragmentação e desnaturação do RNA antes do PI. Pelo contrário, o sequenciamento de bisulfotos que também é afetado por estruturas secundárias, não inclui um passo de fragmentação e isso pode ser uma das razões que causa discrepância entre os locais m5C e mRNAs previstos pelo sequenciamento de bisulfoto16 e MeRIP-seq11,17. Outras modificações de citosina (por exemplo, hm5C) também são resistentes à deaminação mediada por bisulfato35.
As modificações do MeRIP-seq incluem uma etapa de crosslinking, seja com a introdução de um ribonucleoídeo fotoactivatable (foto-crosslinking assistido m6A-seq, PA-m6A-seq 50) ou usando luz UV para criar crosslinks anticorpo-RNA após o IP (miCLIP49, método diferente do miCLIP descrito introdução em30, mas também com resolução individual-nucleotide). No futuro, e à medida que o conhecimento sobre a metilação de RNA está se acumulando, abordagens mais direcionadas podem ser preferíveis, com base nas enzimas modificadoras e/ou nas sequências de consenso onde a metilação está aparecendo. A identificação de proteínas leitoras é essencial para a compreensão da função molecular e de sinalização das modificações pós-transcricionais. A tecnologia de sequenciamento de nanoporos já permite a identificação direta de nucleotídeos modificados sem tratamento prévio do RNA17, mas ainda há espaço para melhorias neste campo em relação à profundidade da sequência e à análise bioinformática. No geral, o MeRIP-seq é atualmente uma abordagem estabelecida, confiável e imparcial para identificar transcrições de RNA metiladas.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
to:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua 
3Biologie de l&#39;Ecole Normale Sup&#233;rieure (IBENS),&#160;Paris, France

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.

Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

Em todos os três reinos da vida, as espécies de RNA sofrem modificações pós-transcricionais e pesquisas sobre essas modificações bioquímicas funcionalmente relevantes são chamadas de "epitranscriptomia". Epitranscriptomia é um campo em crescimento e vários métodos estão sendo desenvolvidos para estudar e mapear as modificações nas moléculas de RNA (revisadas em1,2). Mais de cem modificações de RNA foram encontradas, detectadas em rRNAs, tRNAs, outros ncRNAs, bem como mRNAs3,4. Embora a presença e a função de modificações pós-transcricionais quimicamente diversas em tRNAs e rRNAs sejam extensivamente estudadas5,6,7,8, apenas recentemente foram caracterizadas modificações de mRNA. Nas plantas, muitas modificações de mRNA foram identificadas até o momento, incluindo m7G na estrutura da tampa9, m1A10, hm5C11,12, e uridylation13. No entanto, apenas m6A10,14,15, m5C11,16,17, e pseudouridina18 foram mapeados em arabidopsis. Modificações de base mRNA pós-transcrição estão envolvidas em vários processos de desenvolvimento19,20.
Uma das abordagens mais utilizadas na epitranscriptomia é a imunoprecipitação de RNA metilada aliada ao sequenciamento profundo (MeRIP-seq). O MeRIP-seq foi desenvolvido em 2012 para estudar m6A em células de mamíferos21,22. Requer o uso de um anticorpo para a modificação desejada e visa enriquecer para fragmentos de RNA que carregam o nucleotídeo modificado.s. Geralmente é seguido por sequenciamento profundo para identificar e mapear os fragmentos enriquecidos ou PCR quantitativo para verificar alvos específicos de RNA. A precisão do MeRIP baseia-se na especificidade do anticorpo para reconhecer o nucleotídeo modificado sobre modificações semelhantes (por exemplo, m5C e hm5C11,23). Além do m6A, o MeRIP-seq também foi aplicado para estudar m1A e m5C RNA metilação em diversos organismos11,17,23,24,25.
A metilação da citosina na quinta posição de carbono (m5C) é a modificação de DNA mais prevalente26,27 e uma das modificações mais comuns do RNA também3,4. Enquanto o m5C foi detectado em mRNAs eucarióticos em 197528, só recentemente tem estudos focados no mapeamento da modificação transcriptome-wide, em codificação e não codificação RNAs11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.
Métodos alternativos utilizados na pesquisa m5C RNA incluem conversão química de citosinas não metiladas em uracils (sequenciamento de bisulfo) e ensaios de imunoprecipitação baseados em uma ligação irreversível de um conhecido RNA citosina metiltransferase aos seus alvos de RNA (miCLIP, aza-IP). Em breve, o sequenciamento de bisulfato explora a característica de citosina 5-metilada para ser resistente ao tratamento de bisulfito de sódio que desamina cistilha cistão para uracil. O método foi desenvolvido pela primeira vez para o DNA, mas adaptado para RNA também e muitos estudos optaram por essa abordagem para detectar m5C em RNA16,23,29,32,34,35. Tanto o miCLIP quanto o aza-IP exigem conhecimento prévio da metiltransferase de citosina RNA e uso do respectivo anticorpo. No caso do miCLIP (metilação individual-nucleotídeo-resolução crosslinking e imunoprecipitação), o metiltransferase carrega uma única mutação de aminoácidos de modo que se liga ao substrato de RNA, mas não pode ser liberado30. Em aza-IP (imunoprecipitação de RNA mediada 5-azacytidine), a ligação irreversível é formada entre o nucleosídeo 5-azac e o RNA citosina metiltransferase quando exogenou 5-azaC é incorporada por polimerases de RNA em uma molécula de RNAalvo 31.
A principal vantagem desses três métodos é que eles permitem o mapeamento da resolução de nucleotídeos únicos de m5C. Além disso, o miCLIP e o aza-IP fornecem informações sobre os alvos específicos de um metiltransferase de citosina RNA selecionada, decifrando mais profundamente o mecanismo e o papel das modificações pós-transcrição do RNA. No entanto, a abordagem MeRIP-seq pode identificar regiões transcriptome-wide m5C sem qualquer conhecimento prévio necessário e evita condições químicas e de temperatura severas, como tratamento de bisulfato ou incubação com 5-azaC. Tanto o sequenciamento de MeRIP quanto o bisullfita podem ser inibidos pelas estruturas secundárias de RNA36. A etapa de fragmentação incluída no ensaio merip antes da imunoprecipitação visa facilitar a ligação de anticorpos e aumentar a resolução da identificação m5C.
Outro método que vale a pena mencionar é a espectrometria de massa (MS) dos nucleosídeos de RNA. A ESM pode detectar e distinguir qualquer tipo de modificação tanto no DNA quanto no RNA. Resumidamente, o RNA é extraído e dNase digerido, depois desalado e digerido para nucleosídeos únicos. Os nucleosídeos de RNA são analisados por um espectrômetro de massa. Este método pode ser usado para quantificar os níveis de cada modificação e não depende de um anticorpo ou de uma conversão química. No entanto, uma grande desvantagem é que ele fornece informações em massa sobre a presença de modificações de RNA. Para mapear as modificações, a EM precisa ser combinada com informações de digestão e sequenciamento de RNase sobre moléculas específicas de RNA, como no caso do tRNALeuhumano(CAA)37.
Aqui, descrevemos e discutimos o ensaio MeRIP usado para estudar a metilação m5C RNA em Arabidopsis17.

<table><tbody><tr><td>anticorpo anti-m5C</td><td>ZymoResearch</td><td>A3001 (descontinuado), A3002 disponível</td><td>Clone 10G4 (descontinuado), 7D21 disponível</td></tr><tr><td>Chip e reagentes para eletroforese capilar</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>RNA 6000 Nano kit</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td>TURBO kit sem DNA</td></tr><tr><td>Co-precipitante de ácidos nucléicos</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td>Glicoblue, 15 mg/mL</td></tr><tr><td>Kit de transcrição In vitro</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>T7 RiboMAX Sistema de produção de RNA em grande escala</td></tr><tr><td>Tubos de reação de baixa ligação</td><td>Kisker Biotech</td><td>G017</td><td>Tubos de microcentrífuga de 1,7 ml</td></tr><tr><td>Grânulos magnéticos de proteína G</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>Dynabeads Proteína G</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>Solução estoque de 20mg/mL, grau</td></tr> <tr>de RNA<td>Inibidor de RNase</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>RNasin Plus 40 U/&mu; l</td></tr><tr><td>kit de remoção de rRNA</td><td>Epicentro</td><td>RZPL11016</td><td>Kit de remoção de rRNA Ribo-Zero (folha vegetal)</td></tr> <tr><td>Tubos de sonicação</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>microtubo AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td></tr><tr><td>Reagente de extração de RNA</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td>reagente TRIzol</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillary electrophoresis machine</td><td>Sistema de Bioanalisador Agilent</td><td>G2939BA</td><td>2100</td></tr><tr><td>Rack magnético</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>descontinuado</td><td>modelo 5417R</td></tr><tr><td></td><td>Rotator Benchmark</td><td>R4040</td><td>RotoBot Mini</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td>S220 Espectrofotômetro</td></tr> <tr><td></td><td>de ultrassom focalizadoThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td>NanoDrop OneC</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>GFL</td><td>1012</td><td>1012 Banho de incubação</td></tr></tbody></table>

ensaio de imunoprecipitação de rna metilado para estudar m5c modificação em arabidopsis

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

Modificações de base secundárias no RNA, como o m5C, afetam a estrutura e a função das moléculas modificadas de RNA. Imunoprecipitação e sequenciamento de RNA metilado (MeRIP-seq) é um método que visa enriquecer para RNA metilado e, finalmente, identificar transcrições modificadas. Brevemente, o RNA sonicado é incubado com um anticorpo para citosinas de 5 metilados e precipitado com a ajuda de contas G proteicas. Os fragmentos enriquecidos são então sequenciados e os potenciais locais de metilação são mapeados com base na distribuição das leituras e detecção de pico. O MeRIP pode ser aplicado a qualquer organismo, pois não requer nenhuma sequência prévia ou modificação do conhecimento enzimante. Além da fragmentação, o RNA não está sujeito a nenhum outro tratamento químico ou de temperatura. No entanto, o MeRIP-seq não fornece previsão de nucleotídeo único do local de metilação como outros métodos fazem, embora a área metilada possa ser reduzida a alguns nucleotídeos. O uso de diferentes anticorpos específicos de modificação permite que o MeRIP seja ajustado para as diferentes modificações de base presentes no RNA, ampliando as possíveis aplicações deste método.

Um esquema do método é fornecido na Figura 1. Os primeiros passos críticos do protocolo são obter RNA de boa qualidade (RIN ≥ 7) e sonicá-lo para aproximadamente 100 fragmentos nt. A eficiência de ambas as etapas é examinada por uma máquina de eletroforese capilar baseada em chip. Na Figura 2A, uma execução representativa de uma boa amostra de RNA é mostrada. A amostra é diluída 1:10 antes de carregar no chip, a fim de ter uma concentração que está na faixa de detecção do kit utilizado (5-500 ng/μL). A mesma amostra também é executada após a sônica e é mostrada na Figura 2B. Observe que a presença de um pico uniforme deslocado para a esquerda do diagrama, em um tamanho de cerca de 100 nucleotídeos. A menor concentração é causada tanto pela perda de RNA durante a fragmentação, como também pelo aumento do volume das amostras (60-100 μL, etapa 1.7.1).
A qualidade das amostras IP e Mock pode ser avaliada por qRT-PCR. Para isso, os IVTs cravados servem como controles positivos e negativos: o IVT metilado, onde em todas as posições de citosina há m5C, deverá ser altamente enriquecido na amostra de IP; pelo contrário, o IVT não metilado não deve ter diferença entre IP e Mock. Os primers utilizados no ensaio qRT-PCR para os dois IVTs de controle(EGFP e Renilla luciferase) estão listados na Tabela 1. De fato, como mostrado na Figura 3,cerca de 80% do IVT metilado foi recuperado na amostra de IP, e apenas aproximadamente 2% no Mock. Para o controle não metilado, a recuperação foi inferior a 1% em amostras de IP e Mock. Isso verifica a eficiência do MeRIP de que fragmentos de RNA metilado foram precipitados e enriquecidos, e é um bom indicador de que as amostras podem ser usadas para análise a jusante. Além disso, o enriquecimento da dobra do IVT não metilado (razão IP para Mock) pode ser aplicado como um limiar para estimar a significância do enriquecimento nos ensaios qRT-PCR.
Após o alinhamento das leituras ao genoma(Figura 4),os algoritmos de chamada de pico descritos nas etapas 3.4.1 e 3.4.2 são aplicados para identificar as janelas estatisticamente significativas, enriquecidas nas amostras de IP em comparação com a Entrada. As sequências que correspondem a essas janelas podem ser utilizadas ainda mais, por exemplo, para procurar motivos conservados relacionados à metilação11,17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática do protocolo MeRIP-seq. As amostras de RNA são incubadas com um anticorpo para citosinas de 5 metilados e os complexos são puxados para baixo com contas magnéticas G proteínas que capturam os anticorpos juntamente com o RNA ligado. As amostras de RNA elucidas são analisadas por sequenciamento profundo e qRT-PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig02.jpg"> Figura 2: Resultados representativos da análise da qualidade das amostras de RNA. (A) Perfil representativo de uma amostra total qualificada da planta RNA. (B) Perfil representativo de uma amostra de RNA após a sônica para fragmentos de 100 nt. Arquivos de saída do software de eletroforese capilar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig03.jpg"> Figura 3: qRT-PCR análise de IVTs de controle. Transcrições in vitro metiladas e não metiladas foram utilizadas como controles positivos e negativos do ensaio MeRIP, respectivamente. Após a imunoprecipitação, o IVT metilado é altamente enriquecido na amostra IP (verde), mas não na amostra Mock (sem anticorpo anti-m5C; roxo). O IVT não metilado não mostrou enriquecimento e nenhuma diferença entre IP e Mock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig04.jpg"> Figura 4: Leia o alinhamento antes e depois do MeRIP em torno de uma transcrição representativa. Leituras alinhadas a uma transcrição específica na amostra de entrada (linha superior) e em duas réplicas IP (linha média e inferior). A caixa preta mostra uma janela de 50 nt de comprimento enriquecida identificada com base nas análises macs243 e MeRIP-seq22 peak-calling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Alvo</td>
			<td colspan="2">Par de primer</td>
			<td colspan="2">Sequência do produto</td>
			<td>Comprimento do produto</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">EGFP</td>
			<td colspan="2">Para: 5'- GGCAACTACAAGACCCGCGCC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAG GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC</td>
			<td rowspan="2">72 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Renilla luciferase</td>
			<td colspan="2">Para: 5'-GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACC ATGTTGCCATCAAAAAATCATGAGAA AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC</td>
			<td rowspan="2">75 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Informações sobre os primers e produtos gerados para a análise qRT-PCR.
Receitas tampão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/Buffer%20Recipes%20MeRIP.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

O ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado é um método à base de anticorpos usado para enriquecer para fragmentos de RNA metilado. Juntamente com sequenciamento profundo, leva à identificação de transcrições carregando a modificação m5C.

Ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado para estudar m5C modificação em Arabidopsis

Secondary base modifications on RNA, such as m5C, affect the structure and function of the modified RNA molecules. Methylated RNA Immunoprecipitation and ...

A imunoprecipitação de RNA metilado, também chamada de MeRIP, é um método projetado para identificar grupos metilados em transcriptomas inteiros. Pode ser adaptado a extratos de RNA de muitos organismos modelo. O método é simples, não requer nenhum tratamento químico agressivo e pode ser usado para mapear qualquer modificação de RNA, desde que seja uma variável específica.Para extrair a amostra de RNA, primeiro triture 200 miligramas da amostra de tecido vegetal de interesse em pó em nitrogênio líquido, cuidando para que o tecido permaneça congelado durante todo o procedimento. Em seguida, adicione um mililitro de reagente de extração de RNA contendo tiocianato de guanidina e fenol ácido ao tecido vegetal moído e misture bem por inversão, certificando-se de que todo o tecido esteja úmido. Após 10 minutos à temperatura ambiente, centrifugue as amostras e transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro.Adicione 200 microlitros de 1-bromo-3-cloropropano ao sobrenadante e vortex vigorosamente a amostra. Separe as fases por centrifugação e transfira aproximadamente 500 microlitros da fase aquosa superior para um novo tubo de 1,5 mililitro. Adicione 500 microlitros de isopropanol e 50 microlitros de acetato de sódio de três molares à amostra e misture bem por inversão.Incubar a amostra durante 10 minutos a menos 20 graus Celsius antes de precipitar o RNA por centrifugação. Depois de descartar o sobrenadante, lave o pellet duas vezes com 500 microlitros de etanol a 80% e uma vez com 500 microlitros de etanol a 99%. Após a última lavagem, seque o pellet por cinco a 10 minutos antes de se dissolver em 30 microlitros de água livre de RNase.Meça a concentração de RNA em um espectrofotômetro e digere 20 microgramas da amostra de RNA em uma solução de água e tampão DNase. Após uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius, use um volume apropriado de reagente de inativação de DNase para remover a enzima e verifique a qualidade e pureza do RNA isolado por eletroforese capilar de acordo com protocolos padrão. Se o número de integridade do RNA da amostra digerida pela DNase for superior a sete, adicionar pelo menos 12 microgramas de cada amostra de RNA a um novo tubo.Aumente 0,1 nanograma de cada transcrito in vitro previamente preparado, um metilado e um não metilado, por três microgramas de amostra de RNA e traga o volume final em cada tubo para 80 microlitros com água livre de RNase. Em seguida, sonicar todo o volume de cada amostra de RNA em tubos de sonicação individuais e confirmar a eficiência da sonicação e a concentração das amostras de RNA por eletroforese capilar. O tamanho médio do RNA fragmentado deve ser de cerca de 100 nucleotídeos.Para imunoprecipitação de RNA metilado, adicione nove microgramas de cada amostra de RNA sonicado e até 60 microlitros de água livre de RNase em novos tubos individuais de baixa ligação e aqueça o RNA a 70 graus Celsius em banho-maria por 10 minutos. No final da incubação, resfrie as amostras por 10 minutos em banho-maria gelado e transfira 20 microlitros de cada amostra para um novo tubo de baixa ligação para armazenamento de menos 80 graus Celsius como entrada. Adicione água livre de RNase aos 40 microlitros restantes de cada amostra até um volume final de 860 microlitros e divida cada amostra em um tubo de baixa ligação para imunoprecipitação e um tubo de baixa ligação como uma amostra simulada.Adicione 50 microlitros de tampão MeRIP 10X e 10 microlitros de inibidor de RNase a cada amostra. Em seguida, adicione 10 microlitros de anticorpo anti-M5C aos tubos de imunoprecipitação e 10 microlitros de água aos tubos simulados. Selar os tubos com parafilme e incubar as amostras durante 12 a 14 horas a quatro graus Celsius com rotação aérea.Na manhã seguinte, adicione 40 microlitros de contas a um tubo de 15 mililitros por amostra. Lave as esferas com três lavagens de cinco minutos com 800 microlitros de tampão MeRIP e rotação aérea por amostra por lavagem, coletando as esferas em um ímã após cada lavagem para permitir que o tampão seja descartado. Após a terceira lavagem, ressuspenda os grânulos em 40 microlitros de tampão MeRIP fresco por amostra e adicione 40 microlitros de grânulos ressuspensos à imunoprecipitação e simule os tubos de amostra para uma incubação de duas horas a quatro graus Celsius com rotação aérea.No final da incubação, coloque os tubos em um suporte magnético por um minuto antes de descartar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar as contas. Lave as esferas cinco vezes em 700 microlitros de tampão MeRIP suplementado com 0,01% Tween-20 por 10 minutos por lavagem em temperatura ambiente com rotação aérea. Após a última lavagem, ressuspenda as esferas em 200 microlitros de tampão de digestão de proteinase K e 3,5 microlitros de proteinase K para uma incubação de três horas a 50 graus Celsius com agitação a 800 rotações por minuto.Ao final da incubação, extrair o RNA com 800 microlitros de reagente de extração de RNA e o protocolo de extração de ácido tiocianato de guanidínio fenol clorofórmio conforme demonstrado. Após a extração, ressuspenda o pellet de RNA extraído em exatamente 20 microlitros de água livre de RNase. Nesta figura, é mostrada uma execução representativa de uma boa amostra de RNA.Na mesma amostra após a sonicação, pode-se observar a presença de um pico uniforme deslocado para a esquerda com um tamanho de cerca de 100 nucleotídeos. A menor concentração é causada tanto pela perda de RNA durante a fragmentação quanto pelo aumento do volume da amostra. A qualidade da imunoprecipitação e das amostras simuladas pode ser avaliada por PCR quantitativo da transcriptase reversa.Nesta análise representativa, cerca de 80% do transcrito metilado in vitro foi recuperado na amostra de imunoprecipitação, enquanto apenas aproximadamente 2% foram recuperados na amostra simulada. Para o controle não metilado, a recuperação foi inferior a 1% tanto na imunoprecipitação quanto nas amostras simuladas. Após o sequenciamento profundo e o alinhamento das leituras ao genoma, os algoritmos de chamada de pico podem ser aplicados para identificar as janelas estatisticamente significativas que são enriquecidas nas amostras de imunoprecipitação em comparação com a entrada.Usando os dados de sequenciamento, podemos identificar o motivo pelo qual a metilação do RNA ocorre com mais frequência e esse motivo pode servir como isca para puxar para baixo proteínas de ligação específicas.

methylated-rna-immunoprecipitation-assay-to-study-m5c-modification

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Imprinting é um fenômeno em plantas e da reprodução de mamíferos. Metilação do DNA desempenha um papel importante nos mecanismos de imprinting. Isolando endosperma e determinação do estatuto de metilação de genes imprinted...

Determinação de metilação de DNA de genes marcados em Arabidopsis Endosperma

Uma abordagem confiável e útil para detectar modificações das histonas em genes específicos de plantas é descrito. A abordagem combina cromatina imunoprecipitação (chip) e real-time PCR quantitativo. Ela permite a detecção de modificações das histonas em genes específicos, com um papel em diversos processos fisiológicos.

Detecção de histona Modificações nas folhas das plantas

Cromatina imunoprecipitação é uma técnica poderosa para a identificação de locais de Arabidopsis proteínas de ligação ao ADN in vivo. Este procedimento inclui a ligação cruzada da cromatina e fragmentação, imunoprecipitação com anticorpos selectivos contra a proteína de interesse, e análise de qPCR de DNA ligado. Nós descrevemos um ensaio ChIP simples otimizado para plantas de Arabidopsis.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina a identificação de Arabidopsis interações proteína-ADN<em&gt; In Vivo</em

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Um método para medir RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine modificações nas células e tecidos

Recém descoberto formas oxidadas de 5-metilcitosina (oxi-mCs), 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) pode representar modificações de DNA distintas com funções únicas funcionais. Aqui, um fluxo de trabalho semi-quantitativa para visualização da distribuição espacial de oxi-mCs, perfis de intensidade de sinal e colocalization é descrito.

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Aqui, um ensaio in vitro anticorpo-livre para a análise direta da atividade do metiltransferase no RNA transcrito sintético ou in vitro é descrito.

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Ensaio Dot Blot para Detectar Níveis Globais de Modificação do RNAN 6-metiladenosina

Esse protocolo fornece uma abordagem detalhada para avaliar os níveis de modificação m6Ade RNA específico usando MeRIP-qPCR.

Ensaio MeRIP-qPCR para Detecção de Níveis de Modificação M6Ade RNA Específico em Células de Osteossarcoma

Aprenda o ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado (MeRIP) para identificar modificações m5C em Arabidopsis. Esta técnica enriquece fragmentos de RNA metilados sem tratamentos químicos agressivos.

Ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado para estudar m⁵C modificação em Arabidopsis

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