Ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado para estudar m5C modificação em Arabidopsis
14 de maio de 2020
O ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado é um método à base de anticorpos usado para enriquecer para fragmentos de RNA metilado. Juntamente com sequenciamento profundo, leva à identificação de transcrições carregando a modificação m5C.
A imunoprecipitação de RNA metilado, também chamada de MeRIP, é um método projetado para identificar grupos metilados em transcriptomas inteiros. Pode ser adaptado a extratos de RNA de muitos organismos modelo. O método é simples, não requer nenhum tratamento químico agressivo e pode ser usado para mapear qualquer modificação de RNA, desde que seja uma variável específica.
Para extrair a amostra de RNA, primeiro triture 200 miligramas da amostra de tecido vegetal de interesse em pó em nitrogênio líquido, cuidando para que o tecido permaneça congelado durante todo o procedimento. Em seguida, adicione um mililitro de reagente de extração de RNA contendo tiocianato de guanidina e fenol ácido ao tecido vegetal moído e misture bem por inversão, certificando-se de que todo o tecido esteja úmido. Após 10 minutos à temperatura ambiente, centrifugue as amostras e transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro.
Adicione 200 microlitros de 1-bromo-3-cloropropano ao sobrenadante e vortex vigorosamente a amostra. Separe as fases por centrifugação e transfira aproximadamente 500 microlitros da fase aquosa superior para um novo tubo de 1,5 mililitro. Adicione 500 microlitros de isopropanol e 50 microlitros de acetato de sódio de três molares à amostra e misture bem por inversão.
Incubar a amostra durante 10 minutos a menos 20 graus Celsius antes de precipitar o RNA por centrifugação. Depois de descartar o sobrenadante, lave o pellet duas vezes com 500 microlitros de etanol a 80% e uma vez com 500 microlitros de etanol a 99%. Após a última lavagem, seque o pellet por cinco a 10 minutos antes de se dissolver em 30 microlitros de água livre de RNase.
Meça a concentração de RNA em um espectrofotômetro e digere 20 microgramas da amostra de RNA em uma solução de água e tampão DNase. Após uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius, use um volume apropriado de reagente de inativação de DNase para remover a enzima e verifique a qualidade e pureza do RNA isolado por eletroforese capilar de acordo com protocolos padrão. Se o número de integridade do RNA da amostra digerida pela DNase for superior a sete, adicionar pelo menos 12 microgramas de cada amostra de RNA a um novo tubo.
Aumente 0,1 nanograma de cada transcrito in vitro previamente preparado, um metilado e um não metilado, por três microgramas de amostra de RNA e traga o volume final em cada tubo para 80 microlitros com água livre de RNase. Em seguida, sonicar todo o volume de cada amostra de RNA em tubos de sonicação individuais e confirmar a eficiência da sonicação e a concentração das amostras de RNA por eletroforese capilar. O tamanho médio do RNA fragmentado deve ser de cerca de 100 nucleotídeos.
Para imunoprecipitação de RNA metilado, adicione nove microgramas de cada amostra de RNA sonicado e até 60 microlitros de água livre de RNase em novos tubos individuais de baixa ligação e aqueça o RNA a 70 graus Celsius em banho-maria por 10 minutos. No final da incubação, resfrie as amostras por 10 minutos em banho-maria gelado e transfira 20 microlitros de cada amostra para um novo tubo de baixa ligação para armazenamento de menos 80 graus Celsius como entrada. Adicione água livre de RNase aos 40 microlitros restantes de cada amostra até um volume final de 860 microlitros e divida cada amostra em um tubo de baixa ligação para imunoprecipitação e um tubo de baixa ligação como uma amostra simulada.
Adicione 50 microlitros de tampão MeRIP 10X e 10 microlitros de inibidor de RNase a cada amostra. Em seguida, adicione 10 microlitros de anticorpo anti-M5C aos tubos de imunoprecipitação e 10 microlitros de água aos tubos simulados. Selar os tubos com parafilme e incubar as amostras durante 12 a 14 horas a quatro graus Celsius com rotação aérea.
Na manhã seguinte, adicione 40 microlitros de contas a um tubo de 15 mililitros por amostra. Lave as esferas com três lavagens de cinco minutos com 800 microlitros de tampão MeRIP e rotação aérea por amostra por lavagem, coletando as esferas em um ímã após cada lavagem para permitir que o tampão seja descartado. Após a terceira lavagem, ressuspenda os grânulos em 40 microlitros de tampão MeRIP fresco por amostra e adicione 40 microlitros de grânulos ressuspensos à imunoprecipitação e simule os tubos de amostra para uma incubação de duas horas a quatro graus Celsius com rotação aérea.
No final da incubação, coloque os tubos em um suporte magnético por um minuto antes de descartar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar as contas. Lave as esferas cinco vezes em 700 microlitros de tampão MeRIP suplementado com 0,01% Tween-20 por 10 minutos por lavagem em temperatura ambiente com rotação aérea. Após a última lavagem, ressuspenda as esferas em 200 microlitros de tampão de digestão de proteinase K e 3,5 microlitros de proteinase K para uma incubação de três horas a 50 graus Celsius com agitação a 800 rotações por minuto.
Ao final da incubação, extrair o RNA com 800 microlitros de reagente de extração de RNA e o protocolo de extração de ácido tiocianato de guanidínio fenol clorofórmio conforme demonstrado. Após a extração, ressuspenda o pellet de RNA extraído em exatamente 20 microlitros de água livre de RNase. Nesta figura, é mostrada uma execução representativa de uma boa amostra de RNA.
Na mesma amostra após a sonicação, pode-se observar a presença de um pico uniforme deslocado para a esquerda com um tamanho de cerca de 100 nucleotídeos. A menor concentração é causada tanto pela perda de RNA durante a fragmentação quanto pelo aumento do volume da amostra. A qualidade da imunoprecipitação e das amostras simuladas pode ser avaliada por PCR quantitativo da transcriptase reversa.
Nesta análise representativa, cerca de 80% do transcrito metilado in vitro foi recuperado na amostra de imunoprecipitação, enquanto apenas aproximadamente 2% foram recuperados na amostra simulada. Para o controle não metilado, a recuperação foi inferior a 1% tanto na imunoprecipitação quanto nas amostras simuladas. Após o sequenciamento profundo e o alinhamento das leituras ao genoma, os algoritmos de chamada de pico podem ser aplicados para identificar as janelas estatisticamente significativas que são enriquecidas nas amostras de imunoprecipitação em comparação com a entrada.
Usando os dados de sequenciamento, podemos identificar o motivo pelo qual a metilação do RNA ocorre com mais frequência e esse motivo pode servir como isca para puxar para baixo proteínas de ligação específicas.
Visão Geral
O ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado (MeRIP) é uma técnica poderosa para enriquecer fragmentos de RNA metilado a partir de transcriptomas completos. Este método, quando combinado com sequenciamento profundo, permite a identificação de transcritos que carregam a modificação m 5 C.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- bioquímica
- biologia molecular
Antecedentes
- MeRIP é projetado para identificar grupos metilados no RNA.
- O método é adaptável a diversos organismos modelo.
- Evita tratamentos químicos agressivos, tornando-o fácil de usar.
- Variáveis específicas permitem o mapeamento de qualquer modificação no RNA.
Objetivo do Estudo
- Para enriquecer fragmentos de RNA metilado.
- Para identificar transcritos com modificações m 5 C.
- Para facilitar o estudo de modificações de RNA em diversos contextos biológicos.
Métodos Utilizados
- Extração de RNA de tecido vegetal usando tiocianato de guanidina e fenol ácido.
- Sonicação para fragmentar o RNA em aproximadamente 100 nucleotídeos.
- Imunoprecipitação utilizando anticorpo anti-M5C.
- Sequenciamento profundo de amostras de RNA enriquecidas.
Resultados Principais
- Aproximadamente 80% dos transcritos metilados foram recuperados na amostra de imunoprecipitação.
- Menos de 2% dos transcritos metilados foram recuperados na amostra controle.
- Os controles não metilados apresentaram recuperação inferior a 1% em ambas as condições.
- Janelas estatisticamente significativas enriquecidas nas amostras de imunoprecipitação foram identificadas por meio de algoritmos de detecção de picos.
Conclusões
- MeRIP é um método eficaz para o estudo da metilação de RNA.
- A técnica fornece informações sobre modificações de RNA em diferentes organismos.
- O sequenciamento profundo aprimora a compreensão das modificações em todo o transcriptoma.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O MeRIP-seq permite o mapeamento em todo o transcriptoma de modificações nas bases do RNA, como m5C, sem exigir conhecimento prévio da sequência ou tratamentos químicos agressivos. Essa capacidade apoia a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta, associando alterações epitranscriptômicas a desfechos fenotípicos. O método fornece dados quantitativos e reproduzíveis de enriquecimento que podem orientar o desenvolvimento de ensaios e a preparação para triagem de inibidores ou moduladores de enzimas que modificam o RNA.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Analisa os padrões de modificações de RNA para esclarecer os papéis funcionais da m5C na regulação gênica e na atividade de vias metabólicas.
- Valor Operacional: Permite a desconsideração de riscos biológicos em proteínas que ligam RNA ou em alvos de metiltransferases por meio do enriquecimento direto de transcritos modificados.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao correlacionar o enriquecimento de m5C com leituras fenotípicas em sistemas relevantes para doenças.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera pools de RNA validados e enriquecidos em modificações para ensaios funcionais ou de ligação posteriores.
- Valor Operacional: Fornece entrada padronizada e quantitativa para normalização de ensaios e reprodutibilidade entre campanhas de triagem.
- Escalabilidade: Funciona com RNA fragmentado de diversos sistemas modelo, permitindo a validação cruzada de espécies de alvos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas em estágio inicial na epitranscriptômica a modelos pré-clínicos por meio de motivos de modificação conservados.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Delimita regiões metiladas a janelas de poucos nucleotídeos, facilitando a validação subsequente com métodos de resolução de base.
- Alinhamento de Biomarcadores: Identifica padrões de modificação que podem atuar como biomarcadores translacionais quando correlacionados à gravidade fenotípica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O MeRIP-seq insere-se no continuum de descoberta que vai da verificação de hipóteses direcionadas até a otimização de compostos líderes, especialmente quando se suspeita que modificações do RNA sejam fatores determinantes nos mecanismos de doenças ou na resposta a medicamentos.
- Biologia da Descoberta: Testa hipóteses sobre a função de proteínas escritoras/erasedoras/leitoras mediante a medição de alterações nos padrões de modificações do RNA.
- Triagem: Prepara frações de RNA modificadas para uso em ensaios de RIP, EMSA ou de ligação, a fim de avaliar os efeitos de compostos sobre a atividade enzimática.
- Análise: Gera escores de enriquecimento baseados em sequenciamento e identificação de picos que permitem comparações quantitativas entre diferentes condições ou origens genéticas.
- Pesquisa Translacional: Relaciona alterações em m5C com a atividade de vias em modelos de doença, quando apoiadas por dados fenotípicos ou genéticos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para investigar qualquer modificação do RNA com especificidade dependente de anticorpos, reduzindo esforços de re-desenvolvimento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista em redes regulatórias de RNA ao fornecer evidência direta do estado de modificação.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de imunoprecipitação padronizada e controles simulados rigorosos.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de avançar/não avançar ao reduzir riscos de alvos cujos efeitos fenotípicos são mediados por modificações de RNA.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na prevalência de modificações e enriquecimento funcional.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em manipulação de RNA, imunoprecipitação e preparação de bibliotecas para sequenciamento.
- Depende do acesso a equipamentos de sonicação, ferramentas de separação magnética e plataformas de PCR quantitativo ou sequenciamento.
- Necessita padronização entre equipes quanto à validação de anticorpos, bloqueio de microesferas e condições de rigidez.
- Deve levar em conta a variabilidade na eficiência de fragmentação de RNA e na acessibilidade de modificações entre diferentes tipos de amostras.
- Limita-se à mapeamento em nível de modificação, e não à resolução de nucleotídeo único, sem o uso de métodos complementares.
