Name: Ensaio melhorado de fecundidade e fertilidade para a Aedes aegypti usando 24 placas de cultura de tecido poço (placas EAgaL) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Aprenda a avaliar a aptidão reprodutiva individual de Aedes aegypti usando placas de 24 poços. Este método reduz tempo, espaço e trabalho em ensaios de fecundidade e fertilidade, acelerando pesquisas em biologia de vetores.

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Agradecemos ao Programa de Subvenção de Doenças Vetoriadas de Insetos da Texas A&M Agrilife Research pelo financiamento. Agradecemos também aos membros do laboratório Adelman pela ajuda no desenvolvimento deste método e sugestões na elaboração do manuscrito, bem como aos membros do laboratório de Kevin Myles. Agradecemos também aos revisores e editores por sua ajuda para tornar este manuscrito melhor.

1. Preparação da placa
<ol><li>Furos em 24 tampas de placa de cultura de tecido bem (4-6 furos por poço) usando uma broca doméstica com um bit ~1,6 mm (1/16 in)(Figura 2). NOTA: Esses orifícios evitam que a condensação da água se acumule na tampa, onde os mosquitos podem colocar ovos. O tamanho padrão do Ae. aegypti feminino (estirpe "Liverpool") é ~3,11 mm de envergadura. A redução do tamanho dos orifícios é recomendada ao usar mosquitos menores para evitar escapar da placa.</li>
	<li>No dia anterior ao experimento de oviposição, lave e enxágue as placas completamente e mergulhe-as em 1-5% de alvejante por 30-60 min em temperatura ambiente. Enxágüe bem em água desionizada e seque-as. NOTA: Este processo reduz a chance de fungos e bactérias crescerem em agarose.</li>
	<li>O derretimento surgiu em 2% em água deionizada e imediatamente adiciona 500 μL da agarose derretida a cada poço das 24 placas do poço usando uma pipeta de 1.000 μL(Figura 3A,B). Quando a agarose começar a esfriar e entupir a ponta da pipeta, reaqueça a agarose e use uma nova ponta de pipeta. NOTA: Evite tocar nas paredes do poço com a ponta da pipeta, pois pode deixar um pedaço de agarose na parede onde uma fêmea pode colocar ovos, complicando o processo de imagem e contagem.</li>
	<li>Antes de usar, seque qualquer condensação nas paredes do poço durante a noite em um banco de laboratório(Figura 3C,D). NOTA: A linha do tempo do ensaio da placa EAgaL desde a alimentação sanguínea até a imagem larval é retratada na Figura 4, que é para mosquitos colônias(Ae. aegypti "Liverpool" criado sob luz de 14 h:ciclo de luz escura, 27 °C, 80% de umidade relativa, 500 larvas em uma bandeja de 49,5 cm x 29,2 cm x 9,5 cm com 2 L de água), em condições insetívias. Recomenda-se que cada laboratório teste a placa EAgaL com os mosquitos sendo utilizados, especialmente quando se utiliza diferentes cepas, diferentes espécies de mosquitos, bem como diferentes protocolos de criação.</li>
</ol>2. Alimentação de mosquitos
NOTA: É fundamental o uso de mosquitos criados em condições uniformes para todos os grupos de tratamento e grupos de controle, pois a nutrição larval tem impacto nos parâmetros de aptidão do mosquito10,11. Larvas traseiras em condições despovoadas com alimentos suficientes. Deixe que os mosquitos fêmeas se eclosem na presença de machos para que o acasalamento seja assegurado e maduro por pelo menos 3 dias.
<ol><li>Remova qualquer fonte de água e/ou açúcar dos mosquitos do sexo feminino pelo menos 16 h antes da alimentação sanguínea, a fim de melhorar a alimentação sanguínea.</li>
	<li>Aqueça um circulador de água para alimentação artificial a 37 °C e alimente mosquitos fêmeas usando sangue vertebrado colocado em alimentadores artificiais por 15-30 min (Figura 5A).</li>
	<li>Anestesiar mosquitos com CO2 ou no gelo, transferi-los para um prato de vidro no gelo e selecionar aqueles que são engorgados com sangue(Figura 5B) em um recipiente fornecido com 30% de água de sacarose por mais de 72 h, quando as fêmeas terminam a excreção e o desenvolvimento de ovos. NOTA: Se as fêmeas forem fornecidas com uma menor concentração de água de sacarose, remova a água de sacarose e quaisquer superfícies úmidas após 48 h para evitar que as fêmeas oviposis.</li>
</ol>3. Oviposition
<ol><li>Cerca de 1 h antes de transferir mosquitos para as placas, adicione 2−3 gotas (~80-120 μL) de água em cada poço de placa usando uma pipeta de transferência.</li>
	<li>Pelo menos 72 horas após a alimentação sanguínea, mosquitos derrubados com CO2 ou no gelo, transfira-os para um prato de vidro no gelo, e coloque individualmente cada mosquito em uma tampa invertida da placa de poço 24 no gelo(Figura 6A). NOTA: Este procedimento foi aplicado a partir de Ioshino et al.9.</li>
	<li>Uma vez colocados todos os 24 mosquitos, cubra a tampa com um fundo de placa invertido(Figura 6B),fixe a tampa e a placa com um novo elástico e coloque em uma câmara ambiental (ou sala de criação)(Figura 6C)até que os mosquitos se recuperem (~10-15 min) e vire a placa para cima(Figura 6D).</li>
	<li>Deixe as fêmeas mosquitos oviposit por 24-48 h e remova as fêmeas liberando-as das placas em uma gaiola grande. NOTA: Se é importante acompanhar as fêmeas individuais, anestesia-as resfriando as placas e removê-las individualmente no gelo. Oviposition atrasada e excreções escuras que interferem na contagem de ovos foram observadas quando as fêmeas foram transferidas para os pratos antes de 72 h pós-refeição sanguínea (PBM) (Figura 7D).</li>
</ol>4. Contagem de ovos
<ol><li>Verifique cada poço da placa de 24 poços, pois às vezes os mosquitos colocam ovos na parede dos poços e à margem da superfície agarose/plástico, onde são difíceis de resolver em fotografias. Usando uma escova de tinta molhada, mova os ovos colocados na parede e borda da agarose para a superfície plana da agarose para que todos os ovos estejam em um plano uniforme e não se sobreponham uns aos outros. NOTA: A borda da agarose é tipicamente fora do plano focal da câmera devido à tensão superficial da solução agarose.</li>
	<li>Usando fórceps, remova quaisquer pernas, asas e outras partículas quebradas nos poços que possam interferir com ovos de imagem(Figura 7C).</li>
	<li>Insira papel branco sob a placa para aumentar o contraste com ovos de mosquito escuros antes da imagem usando um iluminador estereomicroscope(Figura 7A).</li>
	<li>Tire uma imagem de cada poço usando uma câmera digital compacta no modo microscópio, o que permite ao usuário focar em objetos tão próximos quanto 1 cm. Essa capacidade permite que a câmera seja colocada diretamente na placa para imagem de ovos sem um tripé ou um suporte(Figura 7A). Para distinguir ovos individuais colocados em aglomerados, use o modo fino ou super fino para capturar imagens de alta resolução para que detalhes de close-up possam ser vistos. NOTA: Limpe o cartão de memória da câmera antes de usar para evitar confusão entre imagens novas e antigas.</li>
	<li>Depois de fotografar cada poço de uma placa, tire uma imagem de toda a placa com um rótulo de ordem de imagem para distinguir cada placa mais tarde(Figura 7E).</li>
	<li>Adicione uma camada fina ~5 gotas de água (~200 μL) com uma pipeta de transferência para cada poço para evitar que seu plugue de agarose e os ovos sequem e induzam o desenvolvimento e a eclosão de embriões. Preste atenção aos níveis de água nas primeiras horas e verifique todos os dias, pois pode haver perda de água devido à absorção pela agarose ou evaporação. Adicione água quando seu nível estiver muito baixo para as larvas chocarem. NOTA: A evaporação da água ocorre de forma não uniforme dentro de uma placa e dentro de uma pilha de placas. Observou-se que a secagem ocorre na seguinte ordem: 1) poços de canto (A1, A6, D1, D6) secam o mais rápido; seguido por 2) poços na borda externa da placa (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); e últimos 3) poços dentro. Quando as placas são empilhadas, a placa superior seca mais rápido.</li>
	<li>Transfira as imagens para um computador com ImageJ (Fiji) e renomeie os arquivos para uma organização mais fácil, como "[iD de placa]_[bem ID].jpg"(Figura 8A,B).</li>
	<li>Crie um arquivo de planilha para registrar números de ovos (ou seja, fecundidade) e números larvais e calcular a taxa de escotilha (ou seja, fertilidade)(Figura 9E).</li>
	<li>Abra as imagens com ImageJ (Fiji)12 e use a ferramenta "multi-point" para marcar cada ovo (Figura 9A−C); zoom-in ou zoom-out usando "+" ou "-" chave para contar os ovos em aglomerados. Depois de marcar todos os ovos, clique duas vezes no ícone de vários pontos para aumentar o número de marcas(Figura 9D). Regissua os resultados em uma planilha.</li>
</ol>5. Avaliação da fertilidade
NOTA: Em 2 dias, as primeiras larvas instar podem começar a se escoar nos poços. Aguarde mais 3-5 dias antes da imagem/contagem para garantir que todos os ovos viáveis eclodam.
<ol><li>Prepare alimentos larvais misturando 1/16 colheres de sopa (~168 mg) de alimentos para peixes moídos (ou seja, dieta normal de larvas de mosquito) em 20 mL de água e esperando que grandes partículas sólidas se instalem(Figura 10A-D). Comece a adicionar alimentos (o supernasce) aos poços que contêm larvas eclodidas assim que elas aparecem, pois elas não sobrevivem por muito tempo sem comida. NOTA: O excesso de adição de partículas alimentares pode interferir na imagem e na contagem de larvas eclodidas.</li>
	<li>Aproximadamente 5-8 dias após a adição de água aos poços, esfrie a placa cobrindo com gelo esmagado por 15-20 min para anestesiar larvas.</li>
	<li>Tire imagens de cada poço enquanto mantém as placas no gelo como foi feito com os ovos. Para imagens larvais, forneça um fundo escuro inserindo um material preto sob a placa para ajudar a melhorar o contraste. Depois de fotografar cada poço de uma placa, tire uma imagem de toda a placa com um rótulo de ordem de imagem para distinguir cada placa mais tarde. NOTA: As imagens são tiradas enquanto as placas estão no gelo porque o movimento larval pode comprometer a contagem. As placas são reutilizáveis; congelar e remover os mosquitos e agarose para limpar para o próximo uso. A placa EAgaL não é adequada para criar larvas em estágios avançados.</li>
	<li>Abra imagens com ImageJ (Fiji) e use a ferramenta "multi-point" para contar clicando em cada larva. Durante o período de 3 a 5 dias algumas larvas podem ter se fundido, especialmente em poços com baixo número de larvas. Portanto, ao contar, exclua as cutículas do galpão (ou seja, exuviae), que parecem larvas somente para a cabeça com um pouco de corpo, ou larvas encolhidas(Figura 10E). Regissos resultados na planilha.</li>
</ol>6. Realizar análises
<ol><li>Tendo coletado todos os dados necessários para a análise de fecundidade e fertilidade, realize análises estatísticas adequadas e crie gráficos utilizando software preferencial.</li>
</ol>

<ol><li>Bond, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+irradiation+dose+to+Aedes+aegypti+and+Ae.+albopictus+in+a+sterile+insect+technique+program%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program.</a> PLoS One. 14 (2), 0212520(2019).</li>
<li>Fernandes, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+larvae+treated+with+spinosad+produce+adults+with+damaged+midgut+and+reduced+fecundity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity.</a> Chemosphere. 221, 464-470 (2019).</li>
<li>Inocente, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticidal+and+Antifeedant+Activities+of+Malagasy+Medicinal+Plant+%28Cinnamosma+sp.%29+Extracts+and+Drimane-Type+Sesquiterpenes+against+Aedes+aegypti+Mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes.</a> Insects. 10 (11), 373(2019).</li>
<li>Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+transgenesis%3A+what+is+the+fitness+cost%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Mosquito transgenesis: what is the fitness cost.</a> Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).</li>
<li>da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+blood-free+diet+for+Anopheles+darlingi+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. , 217(2019).</li>
<li>Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+serum+and+BSA%2C+but+neither+red+blood+cells+nor+hemoglobin+can+support+vitellogenesis+and+egg+production+in+the+dengue+vector+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti.</a> PeerJ. 3, 938(2015).</li>
<li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+SkitoSnack%2C+an+Artificial+Blood+Meal+Replacement%2C+on+Aedes+aegypti+Life+History+Traits+and+Gut+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11023(2018).</li>
<li>Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Candidate+Iron+Transporters+From+the+ZIP%2FZnT+Gene+Families+in+the+Mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti.</a> Frontiers in Physiology. 9, 380(2018).</li>
<li>Ioshino, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviplate%3A+A+Convenient+and+Space-Saving+Method+to+Perform+Individual+Oviposition+Assays+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti.</a> Insects. 9 (3), 103(2018).</li>
<li>Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+mosquitoes%2C+large+implications%3A+crowding+and+starvation+affects+gene+expression+and+nutrient+accumulation+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti.</a> Parasites & Vectors. 8, 252(2015).</li>
<li>Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+vector+arthropod+culture%3A+an+example+using+the+African+malaria+mosquito%2C+Anopheles+gambiae+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae).</a> Malaria Journal. 15 (1), 262(2016).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse para este estudo.

A placa EAgaL reduz drasticamente o trabalho, o tempo e o espaço para realizar ensaios individuais de fecundidade e fertilidade no Aedes aegypti quando comparado com o método FT. A comparação preliminar entre o método FT e a placa EAgaL resultou em tempos mais curtos para todas as etapas (a técnica de imagem foi aplicada ao método FT) (Tabela 1). Como referência, uma estimativa de inicialização e por ensaio (uma placa EAgaL de 24 poços versus 24 FTs) são fornecidas na Tabela 2</...

O controle de mosquitos para proteger os humanos de patógenos transportados por vetores é um importante objetivo de saúde pública, principalmente devido à falta de vacinas eficazes para a maioria dos patógenos transportados por mosquitos. Muitos estudos visam reduzir o condicionamento físico do mosquito em conjunto com uma estratégia de redução populacional aplicável em campo1,2,3. Isso inclui estudos extensivos para criar mosquitos transgênicos e/ou linhas de nocaute CRISPR/Cas9. Tais abordagens de modificação populacional requerem uma avaliação detalhada dos parâmetros de aptidão individual4. Técnicas laboratoriais convencionais para avaliar a aptidão dos mosquitos fêmeas incluem a contenção individual de mosquitos fêmeas acasaladas e alimentadas pelo sangue em recipientes de 100 mL5,tubos consíquicos modificados de 50 mL ou tubos para criação de Drosophila modificados fornecendo superfícies úmidas usando papel de algodão úmido e filtro para oviposição (ou seja, papéis de ovo)1,2,6,7. Tais métodos requerem um espaço relativamente grande (por exemplo, 30 cm x 30 cm x 10 cm: W x L x H para até 100 tubos de Drosophila) (Figura 1), e a manipulação de papéis individuais de ovos para contagem de ovos e larvas de eclosão, que podem ser trabalhosas intensivas. Este manuscrito apresenta um método para contar ovos de mosquito e determinar as taxas de escotilha usando 24 placas de poço e surgiu como uma superfície de oviposição para contornar essas questões8.
Simultaneamente, Ioshino et al.9 descreveram um método detalhado usando 12 e 24 placas de poço para realizar a contagem de óvulos obtidas de fêmeas individuais. Seu protocolo representou uma melhoria significativa dos métodos convencionais na economia de tempo e espaço9. No entanto, o protocolo que eles descreveram continua a usar papel filtro molhado como uma superfície para oviposição, o que requer o desdobramento de cada papel individual para obter contagem, pois os ovos são frequentemente encontrados por baixo ou em dobras. Seu protocolo também não incluía o uso de tecnologias de imagem ou um método para contagem de larvas.
Apresentado é um método aprimorado para realizar ensaios de aptidão para o número de óvulos (ou seja, fecundidade) e taxa de escotilha (ou seja, fertilidade) usando agarose como superfície oviposition em um formato de placa de cultura de tecido de 24 poços para Ae. aegypti que oviposit em superfícies úmidas. Estas placas foram nomeadas placas "EAgaL", de Egg, Agarose, e Larva. Essas 24 placas de poço fornecem aos mosquitos individuais uma superfície mínima para colocar ovos, simplificando e reduzindo drasticamente o tempo e esforço necessários para contar e manter ovos e larvas eclodidas por alguns dias. A placa EAgaL usa agarose translúcida para a superfície de oviposition, o que elimina a necessidade de manusear papéis de ovo e encontrar os ovos e larvas quando eclodido; fotografar cada poço estabelece um registro arquivado de longo prazo dos resultados e separa o processo de contagem em tempo e espaço do processo de criação/manuseio, onde o tempo é muitas vezes limitado.

<table><tbody><tr><td>1,6 mm &Phi; broca</td><td></td><td></td><td>alternativamente pregos aquecidos podem ser usados</td></tr><tr><td>1000 &mu; Pontas de pipeta L (longas)</td><td>Plásticos Olympus</td><td>24-165RL</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 24 poços</td><td>Thermo Scientific</td><td>930186</td><td>transparente, fundo plano com placas de tampa em anel</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>0710-500G</td><td></td></tr><tr><td>Câmara digital compacta</td><td>Olympus</td><td>TG-5/TG-6</td><td></td></tr><tr><td>Computador (Windows, Mac ou Linux)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água deionizada</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji (imageJ) download do software</td><td></td><td></td><td>de: https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>Fórceps</td><td>Dumont</td><td></td><td>fórceps afiado pode quebrar o corpo do mosquito</td></tr><tr><td>Placas de Petri de vidro</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alvejante</td><td></td><td></td><td></td>doméstico</tr><tr><td>Iluminador de broca</td><td></td><td></td><td></td>elétrica doméstica</tr><tr><td>para estereomicroscópio (pescoço de ganso)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>P-1000 pipeta</td><td>Pincéis Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de borracha Cartão</td><td></td><td></td> SD <td>para gravar imagens de câmeras digitais (DSHC, SDXC deve ser melhor)</td></tr> <tr><td>Software de planilha (Microsoft Excel)</td> <td>Microsoft</td><td></td><td>Qualquer software de planilha funciona</td></tr><tr><td>TetraMin comida para peixe</td><td>Tetra</td><td></td><td>moída com moedor de café, liquidificador ou argamassa e pilão</td></tr><tr><td>Pipetas de transferência</td><td>VWR</td><td>16011-188</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio melhorado de fecundidade e fertilidade para a aedes aegypti usando 24 placas de cultura de tecido poço (placas eagal)

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Os mosquitos representam um problema significativo de saúde pública como vetores de vários patógenos. Para aqueles estudos que exigem uma avaliação dos parâmetros de aptidão do mosquito, em particular a produção de ovos e as taxas de escotilha no nível individual, os métodos convencionais têm colocado uma carga substancial sobre os pesquisadores devido à alta intensidade de trabalho e aos requisitos de espaço laboratorial. Descrito é um método simples usando 24 placas de cultura de tecido de poço com agarose em cada poço e imagem digital de cada poço para determinar números de ovos e taxas de escotilha em um nível individual com requisitos de tempo e espaço substancialmente reduzidos.

Os mosquitos foram injetados com dsRNA visando um transportador de ferro candidato (FeT) ou gene de controle (EGFP), alimentado por sangue, e medidos para fecundidade e produção de fertilidade usando o método de placa EAgaL, seguindo o procedimento descrito acima.
Mosquitos em que a expressão fet foi silenciada após a injeção de dsRNA apresentaram uma redução significativa tanto no número de ovos quanto na taxa de escotilha (Figura 11A−C). Todos o...

Descrito é um método de economia de tempo e espaço para contar ovos e determinar as taxas de escotilha de mosquitos individuais usando 24 placas de cultura de tecido de poço, o que pode aumentar substancialmente a escala e a velocidade dos ensaios de fecundidade e fertilidade.

Ensaio melhorado de fecundidade e fertilidade para a Aedes aegypti usando 24 placas de cultura de tecido poço (placas EAgaL)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

Este procedimento permite que os pesquisadores de mosquitos abdorem facilmente a aptidão reprodutiva de seus mosquitos no nível individual. Em comparação com os métodos convencionais, este protocolo reduz significativamente o tempo, o espaço e o trabalho necessários para testar a fecundidade e fertilidade dos mosquitos no nível individual. Comece preparando placas para o experimento de oviposition.Faça de quatro a seis furos por poço na tampa de uma placa de cultura de 24 poços usando uma broca doméstica com um bit de 1,6 milímetros. Um dia antes do experimento, lave e enxágue as placas e mergulhe-as em 1%a 5% de alvejante por 30 a 60 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, enxágue as placas completamente sob água deionizada e seque-as.Derreta 2% de agarose em água deionizada e adicione imediatamente 500 microliters da agarose derretida a cada poço de uma placa de 24 poços. Deixe as placas no banco do laboratório durante a noite para secar qualquer condensação. Pelo menos 16 horas antes da alimentação sanguínea, remova qualquer fonte de água ou açúcar das fêmeas mosquitos.No dia da alimentação, aqueça um circulador de água a 37 graus Celsius e alimente os mosquitos com sangue

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A técnica de insetos estéreis (SIT) é usada para controlar populações específicas de mosquitos clinicamente importantes que podem ser resistentes a controles químicos. Aqui, descrevemos um método de criação em massa e preparação de mosquitos machos estéreis para liberação em um programa operacional de SIT visando o mosquito Aedes aegypti .

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Os micróbios intestinais podem impactar positiva ou negativamente a saúde de seu hospedeiro por meio de mecanismos específicos ou conservados. Caenorhabditis elegans é uma plataforma conveniente para rastrear esses micróbios. O presente protocolo descreve a triagem de alto rendimento de 48 isolados bacterianos quanto ao impacto na resistência ao estresse dos nematoides, usados como um proxy para a saúde dos vermes.

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Aqui, apresentamos um método geral para determinar a viabilidade embrionária e o número total de embriões produzidos (ninhada) usando o organismo modelo C. elegans.

Mensuração da Viabilidade Embrionária e do Tamanho da Ninhada em Caenorhabditis elegans

O presente protocolo descreve como medir dados de parâmetros de vida comuns em mosquitos Aedes aegypti , incluindo fecundidade, tamanho da asa, fertilidade, proporção sexual, viabilidade, tempos de desenvolvimento, contribuição masculina e longevidade adulta. Essas medições podem ser usadas para avaliar a aptidão de mosquitos transgênicos.

Quantificando os custos de aptidão em mosquitos Aedes aegypti transgênicos

Este estudo apresenta uma plataforma flexível e padronizada de ensaios de eclosão de ovos em Caenorhabditis elegans , que integra múltiplos formatos experimentais. A abordagem aprimora a reprodutibilidade, escalabilidade e acessibilidade, permitindo uma avaliação robusta dos efeitos dos medicamentos e processos de desenvolvimento, mantendo-se econômica e facilmente adaptável tanto para aplicações de pesquisa quanto para ambientes educacionais.

Ensaios simples e acessíveis para eclosão de ovos em Caenorhabditis elegans: Formatos Adaptáveis para Testes de Drogas

Aprenda a avaliar a aptidão reprodutiva individual de Aedes aegypti usando placas de 24 poços. Este método reduz tempo, espaço e trabalho em ensaios de fecundidade e fertilidade, acelerando pesquisas em biologia de vetores.

Ensaio melhorado de fecundidade e fertilidade para a Aedes aegypti usando 24 placas de cultura de tecido poço (placas EAgaL)

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