Imagem longitudinal in Vivo e quantificação de células hospedeiras pancreáticas humanas na câmara de olho anterior

O ACE é uma visão de imagem ideal. Ele suporta repeti-lo em imagens in vivo de longo prazo de células ilhotas, a fim de estudar sua função e viabilidade em uma situação de enxerto. Também pode ser estendido para estudar outros aspectos em condições fisiológicas e patológicas em tempo real.

A vantagem da técnica ACE reside no fato de que as mesmas ilhotas pancreáticas humanas individuais podem ser seguidas não invasivamente com resolução subcelular por um longo período de tempo. As taxas de sucesso da terapia de substituição de células beta continuam a melhorar. No entanto, avaliar a eficiência do enxerto de ilhotas e a sobrevivência in vivo, ainda é desafiador.

Esse método poderia ajudar a avaliar e otimizar os resultados dos transplantes de ilhotas. Esta abordagem não se restringe apenas às ilhotas pancreáticas. Também é adequado para estudar tecidos afetados.

Por exemplo, em complicações diabéticas, como glomeruli renal ou pedaços de fígado, apenas para citar alguns. Para começar coloque o mouse em uma almofada de aquecimento quente posicione-o no porta-cabeça e coloque a máscara do nariz. Use o polegar e o dedo indicador para levantar ligeiramente a cabeça.

Aperte-o com as peças metálicas nas laterais. Certificando-se de que os pedaços da orelha fixam a cabeça diretamente abaixo das orelhas. Injete subcutâneamente a solução de buprenorfina na parte de trás do mouse.

Retraia suavemente as pálpebras do olho para serem transplantadas usando fórceps contundentes. Coloque o olho para fora e fixe-o livremente com um par de pinças cobertas com um tubo de polietileno. Depois de transferir as pálpebras para uma placa de Petri com PBS, pegue aproximadamente 20 a 30 ilhotas no cannular dos olhos.

Usando um nível de agulha de 25 medidor para cima, insira cuidadosamente a ponta na córnea e faça uma única incisão lateral. Levante cuidadosamente a córnea com a cânula pré-carregada com ilhotas e solte lentamente as ilhotas no olho. Retraia lentamente a cânula e aplique gel ocular no olho.

Após 10 minutos, retire as fórceps, segurando a pálpebra e coloque o olho de volta à sua posição normal. Para a imagem de ilhotas humanas implantadas com duas microscopia de fótons, coloque a plataforma do porta-cabeça sob o microscópio e administre gel ocular no olho como um líquido de imersão entre a córnea e a lente. Posicione o olho sob o objetivo e a imagem das ilhotas humanas implantadas, conforme descrito no manuscrito do texto.

Para remover a autofluorescência, vá para a guia de processamento de imagens, escolha aritmética do canal e digite o canal um menos o canal dois. Isso cria um novo canal quatro. Renomeie-o vasculatura.

Repita este processo e digite o canal três menos canal dois para criar um novo canal cinco e renomeá-lo para todos. Para definir a ilhota crie manualmente uma nova superfície e escolha editar manualmente no assistente. Mantenha o ponteiro no modo seleto e na exibição 3D.

E clique em volume para visualizar seções. Na guia de desenho escolha contorno e clique em desenhar para começar a desenhar contornos ao redor da borda da ilhota, começando na posição de fatia um. Em seguida, mova-se para uma nova posição de fatia e repita contornos de desenho.

Finalize com a última fatia na parte superior da ilhota e finalize clicando na guia de superfície de criação. Próximo segmento, vasculatura de ilhota e fluorescência de tomate ilhota usando máscara de ilhota. Escolha o objeto da máscara de ilhota previamente definido, vá para a guia de edição e clique na guia máscara all, que abre uma nova janela.

Escolha o canal vasculatura no menu suspenso de seleção do canal e ative as opções de canal duplicado antes de aplicar máscara. Constante por dentro, fora e definir voxels fora da superfície para 0.000 que cria um novo canal seis. Renomeie esta vasculatura ilhota do canal.

Repita as etapas anteriores e escolha o tomate tudo no menu suspenso da seleção do canal, para criar o novo canal, renomeá-lo, tomate ilhota. Em seguida, crie uma nova superfície no menu de cena e escolha a criação automática no assistente. Defina o canal de origem para a vasculatura de ilhota criada anteriormente e escolha subtração de fundo.

Opcionalmente, use filtros. Por exemplo, escolha o volume e ajuste o filtro na janela, que pode remover objetos de serviço selecionados. Termine o assistente e nomeie o novo objeto de superfície, vasculatura de ilhota.

Na islet vasculatura objeto de serviço vá para a guia de edição e clique na guia máscara all, que abre uma nova janela. Escolha o canal de tomate ilhota no menu suspenso da seleção do canal e defina voxels fora da superfície para 10.000, o que cria um novo canal. Renomeie este canal ilhota vasculatura de tomate.

Para segmentar o sinal fluorescente da cápsula de tomate escolha aritmética do canal na guia de processamento de imagem e digite o canal sete menos canal oito criando o novo canal. Renomeie a cápsula de tomate. Crie uma nova superfície como descrito anteriormente e escolha canais de origem, vasculatura de tomate ilhota ou cápsula de tomate no assistente.

Em seguida, execute a subtração de fundo. Abra o arquivo backscatter da ilhota e crie uma nova superfície. No assistente, escolha a criação automática e defina região de interesse.

Se necessário, ajuste o limiar em intensidade absoluta. O objeto de superfície pode ser clicado dentro ou fora, para cruzar com a intensidade correspondente do canal. Quando terminar perto do feiticeiro.

Finalmente, realize a quantificação, selecione um objeto de superfície criado no menu de cena e vá para a guia estatísticas. Para recuperar dados detalhados de volume, escolha a guia detalhada e selecione valores e volumes específicos no menu suspenso. Para recuperar o valor total do volume, vá para a guia detalhada e escolha valores médios.

Este protocolo foi usado para transplantar ilhotas humanas não rotuladas na câmara interna do olho de camundongos receptores fluorescentes vermelhos de oito semanas. O software de imagem interativo foi então usado para extrair dados quantitativos das imagens. Em imagens de fluorescens in vivo, os enxertos de ilhotas humanas foram comprometidos por interferência significativa da autofluorescência tecidual que não foi observada em enxertos de ilhotas de camundongos.

Para melhorar a relação sinal/ruído, o canal de autofluorescência foi subtraído. Em seguida, o limite da ilhota chamado máscara de ilhota e os canais correspondentes foram definidos manualmente. Finalmente, utilizou-se a segmentação do sinal de tomate na vasculatura das pálpebras e na cápsula das pálpebras e na renderização final da superfície para extrair dados quantitativos.

Aqui como representante da sessão de imagem longitudinal do mesmo enxerto de ilhota humana em duas semanas, dois meses, cinco meses e oito meses após o transplante. Imagens MIP de dados brutos gravados originalmente, imagens processadas após a remoção da autofluorescência da ilhota e objetos de ilhotas segmentados são mostrados. Ao realizar a injeção das pálpebras, certifique-se de pré-carregar as ilhotas em um pequeno volume e usar braços de luz dupla flexíveis no microscópio estéreo, para destacar o espaço da câmara ocular para injetar com sucesso as ilhotas no ACE.

Após a imagem in vivo, os olhos podem ser fixos e ainda mais investigados por manchas de anticorpos e histologia convencional. Esta técnica é muito útil para estudos funcionais de ilhotas humanas individuais em tempo real e em condições fisiológicas, especialmente no contexto de vascularização, viabilidade e estudos metabólicos.