Ensaio cinético de molécula única de alta produtividade paralela para decote de DNA específico do local

Este protocolo pode ser aplicado a qualquer processo que resulte em quebras duplas de DNA encalhados, produz dados quantitativos detalhados sobre cinética. Embora este método tenha resolução de molécula única, ele mede até 1000 DNAs em um único experimento, fornecendo assim boas estatísticas. A aplicação primária deste método é estudar os mecanismos envolvidos na vinculação e modificação do DNA.

Por exemplo, estamos interessados em estudar a busca de alvos de DNA, que é relevante para todas as proteínas de ligação de DNA. Ao tentar essa técnica pela primeira vez, lembre-se que as amarras de molécula única são delicadas, e uma vez forma, devem ser tratadas com cuidado. A proporção adequada de superfícies funcionalizadas é essencial.

Há alguns truques para fazer o fluxo assim. Além de trocar tubos de amostra durante a coleta de dados, a demonstração visual pode ajudar alguém que é novo nesse procedimento. Para lavar os deslizamentos de cobertura, coloque-os em potes de coloração e sonice-os com etanol por 30 minutos.

Enxágüe-os completamente com água desionizada e destilada, depois mergulhe-os em um hidróxido de potássio molar e sonicá-los por mais 30 minutos. Repita a sequência de lavagem, certificando-se de enxaguar os deslizamentos de cobertura com água após cada lavagem. Guarde as tampas limpas em frascos de coloração com água.

Use uma navalha limpa para cortar tubos de carregamento e saída de oito centímetros de comprimento e inseri-los em orifícios em uma lâmina de vidro limpa. Epóxi a tubulação e deixe a cura por cinco minutos para fixá-lo. Aplique fita dupla face pré-cortada com o padrão do canal nas lâminas de vidro e suavize-a com fórceps plásticos para obter uma boa vedação.

Retire a parte de baixo da fita e aplique um deslize de cobertura limpo, alisando-o com os fórceps. Em seguida, epóxi a borda da tampa escorregar para selar a célula de fluxo e deixá-la curar. Prepare o DNA rotulado para amarrar realizando PCR de acordo com as instruções do manuscrito.

Em seguida, purifique o produto PCR com um kit de limpeza PCR. Prepare 10 mililitros de tampão A, e desgas-lo em um desiccador de vácuo por pelo menos uma hora. Para funcionalizar a célula de fluxo, injete 25 microliters de anti-digoxigenina e fragmentos fab em PBS, no canal de fluxo, usando uma ponta de carregamento de gel para caber na tubulação PE60.

Incubar a célula de fluxo à temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação, puxe 0,5 mililitros de tampão A pelo canal com uma seringa, tomando o cuidado de não introduzir ar no canal. Então, mountain a célula de fluxo em um microscópio invertido.

Ligue o tubo de saída a uma bomba de seringa e coloque o tubo de entrada em um tubo de micro centrífuga contendo tampão A.Puxe manualmente pelo menos 0,5 mililitros de tampão A para lavar o sistema e preparar a bomba. Em seguida, deixe a bomba funcionar a 10 microliters por minuto por pelo menos cinco minutos para equilibrar o sistema. Vórtice a garrafa de estoque de contas, e pipeta 1,6 microliters das contas em 50 microliters de tampão A, em seguida, vórtice-los novamente.

Coloque as contas em um separador magnético e pipeta para fora do buffer. Suspendê-los em 50 microliters de tampão A e vórtice deles. Após a última lavagem, suspenda as contas em 100 microliters de tampão A para uma concentração final de 160 microgramas por mililitro.

Prepare 480 microliters de 0,5 picomolar rotulado substrato de DNA no buffer A, e pipeta 20 microliters de suspensão de contas no DNA diluído. Coloque a mistura em um rotador por três minutos. Após os três minutos, carregue imediatamente a amostra no canal a uma vazão de 10 microliters por minuto durante 15 minutos, ou até que seja observada a amarração suficiente da conta.

Lave o canal de todas as contas livres alternando o tubo de entrada para um tubo fresco de tampão A, e fluindo-o a 50 microliters por minuto por pelo menos 10 minutos ou até que não sejam observadas contas soltas. E é útil usar uma válvula inline para cortar o fluxo e trocar a tubulação. Comutação da tubulação em um movimento suave e certifique-se de que os níveis líquidos em tubos de amostra novos e antigos combinem para evitar o backflow.

Antes de coletar dados, prepare a concentração correta da enzima de decote de DNA e insira o tubo de entrada na amostra. Abaixe o ímã sobre a célula de fluxo. Coloque a bomba para injetar 80 microliters de amostra a 150 microliters por minuto e inicie a coleta de dados.

Um minuto na coleta de dados, ative a bomba. Mostrada aqui é uma imagem representativa das contas amarradas antes e depois da reação. A análise dos dados foi realizada para quantificar o número de contas que permanecem amarradas durante toda a reação do decote.

Esta técnica foi utilizada para medir as taxas específicas de decote de DNA do local de Nde1 para concentrações proteicas que variam de 0,25 a quatro unidades por mililitro, e duas concentrações diferentes de magnésio. Cada condição foi replicada pelo menos duas vezes, com alguns 100 a 1000 tethered DNA é por experimento. Em concentrações proteicas suficientemente baixas, a taxa é proporcional à proteína e independente do magnésio.

Para altas concentrações proteicas, a taxa depende do magnésio, mas independente da concentração proteica. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que bolhas de ar no canal de tubulação e fluxo podem executar o experimento. Certifique-se de não permitir qualquer ar nas linhas durante a troca de tubos e desgas todos os buffers antes de usar.

O método de amarração permite explorar o efeito da tensão no DNA na reação. Isso pode ser alcançado variando a força do ímã ou aplicando fluxo durante a coleta de dados.