Amplificação isotérmica mediada por loop para triagem de salmonela em alimentos animais e confirmando salmonela do isolamento cultural

Este método LAMP de Salmonella foi incorporado ao Manual Analítico Bacteriológico da FDA, tanto como método de triagem em alimentos para animais quanto como método de confirmação para quaisquer isolados de Salmonella presuntivos. O método é rápido, confiável e robusto. Em comparação com a PCR, suas principais vantagens incluem testes rápidos, instrumentação simples, baixa taxa de falsos negativos e fluxo de trabalho flexível.

A triagem rápida de patógenos como a salmonela desempenha um papel importante na detecção rápida de um produto potencialmente contaminado e pode prevenir doenças ou surtos em humanos e animais. Comece preparando modelos de DNA para o ensaio LAMP. Existem dois tipos de amostras usadas para fazer modelos de DNA.

Para preparar modelos a partir de amostras de alimentos para animais, pesar assepticamente 25 gramas de amostra de alimentos em um saco de filtro estéril. Adicione 225 mililitros de água peptonada tamponada estéril ao saco e incube-o a 35 graus Celsius por 24 horas. Após a incubação, transfira um mililitro do lado filtrado do saco para um tubo de microcentrífuga.

Centrifugar o tubo a 900 vezes G durante um minuto. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Centrifugar a amostra a 16 000 vezes G durante dois minutos.

E para descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 100 microlitros do reagente de preparação da amostra e aqueça-o a 100 graus Celsius por 10 minutos em um bloco de calor seco. Em seguida, resfrie a amostra à temperatura ambiente e armazene-a a 20 graus Celsius negativos. O segundo tipo de amostra para este ensaio LAMP vem diretamente de culturas presuntivas de salmonela.

Para preparar modelos de DNA, transfira 500 microlitros de uma cultura de salmonela durante a noite para um tubo de microcentrífuga e aqueça-o em um bloco de calor de 100 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, resfrie a amostra à temperatura ambiente e armazene-a a 20 graus Celsius negativos. Para evitar a contaminação cruzada, separe fisicamente as áreas usadas para preparar o LAMP Master Mix e adicionar os modelos de DNA.

Limpe as superfícies de trabalho com isopropanol e uma solução degradante de DNA e DNA. Em seguida, limpe as pipetas e os porta-tubos. Descongele o Master Mix isotérmico, o 10X Primer Mix, a água de grau molecular, o DNA de controle positivo e os modelos de DNA à temperatura ambiente.

Ligue o instrumento LAMP e insira as informações relevantes da amostra. Prepare o LAMP Master Mix de acordo com as instruções do manuscrito, vortex e centrifugue-o brevemente e distribua 23 microlitros do Master Mix em cada poço de uma tira de tubo. Vortex todos os modelos de DNA e centrifugue-os brevemente.

Em seguida, adicione dois microlitros de molde de DNA ao poço apropriado e tampe bem o poço. Remova a tira do tubo do suporte e agite-a para garantir que todos os reagentes se acumularam na parte inferior do tubo. Carregue a tira de tubo no instrumento LAMP e inicie a execução do LAMP.

Enquanto a reação LAMP estiver em andamento, toque nas guias Temperatura, Amplificação e Recozimento para ver as alterações dinâmicas de vários parâmetros durante a execução do LAMP. Os resultados do LAMP podem ser visualizados no painel de instrumentos do LAMP em tempo real ou usando o software LAMP. Para interpretar os resultados no painel de instrumentos, abra o percurso LAMP de interesse.

Observe as cinco guias associadas a cada execução. As guias Perfil e Temperatura mostram as temperaturas programadas e reais nos poços de amostra à medida que a reação LAMP prossegue. As guias Amplificação e Recozimento mostram leituras de fluorescência e alterações na fluorescência durante as fases de Amplificação e Recozimento, respectivamente.

A guia Resultados mostra a visualização tabular dos resultados do LAMP que podem ser interpretados de acordo com as instruções dos manuscritos. A segunda maneira de visualizar os resultados do LAMP é usando o software LAMP. Para interpretar os resultados com o software, clique no ícone Computador no painel esquerdo e navegue até o local do arquivo para carregar a execução do LAMP de interesse.

Observe as sete guias associadas a cada execução. As guias Perfil e Temperatura mostram as temperaturas programadas e reais nos poços de amostra à medida que a reação LAMP prossegue. As guias Amplificação e Taxa de amplificação mostram leituras de fluorescência e alterações na fluorescência durante a fase de amplificação.

As guias Recozimento e Recozimento Derivado mostram leituras de fluorescência e alterações na fluorescência durante a fase de Recozimento. A guia Resultados mostra uma exibição tabular dos resultados do LAMP. Existem quatro colunas intituladas Nome do gráfico, Número do poço, Nome do poço e Valor de pico.

O tempo de amplificador e os derivados de recozimento de todas as oito amostras são mostrados. Os resultados podem ser interpretados de acordo com as instruções dos manuscritos. O painel de instrumentos LAMP e o software LAMP podem ser usados para exibir os resultados do ensaio.

Nesta execução do LAMP, as amostras S1 a S6 são diluições seriais dez vezes maiores de Salmonella enterica sorovar Infantis ATCC 51741, variando de 1,1 milhão a 11 unidades formadoras de colônias por reação. O controle positivo, ou PC, é Salmonella enterica Serovar Typhimurium LT2 a 17.000 unidades formadoras de colônias por reação, e o controle sem molde, ou NTC, é água de grau molecular. O poço NTC tem um Tmax em branco e uma temperatura Aneal de aproximadamente 81 graus Celsius no painel de instrumentos LAMP, e um Tmax em branco e uma temperatura de recozimento em branco no software LAMP.

O poço de controle positivo tem um Tmax de sete minutos e 45 segundos e temperatura de recozimento de aproximadamente 90 graus Celsius em ambas as plataformas. As amostras S1 a S6 têm Tmax entre seis minutos e 30 segundos e 12 minutos e 15 segundos, e temperatura de recozimento de aproximadamente 90 graus Celsius, todos indicando uma detecção positiva. O LAMP é muito eficaz e gera uma grande quantidade de DNA.

Portanto, é fundamental que as melhores práticas laboratoriais sejam usadas para evitar a contaminação cruzada. Use práticas semelhantes ao fazer seus modelos de DNA, pois os enriquecimentos de alimentos de origem animal contaminados podem ter altos níveis de salmonela. A triagem de amostras de alimentos para animais positiva com LAMP deve ser confirmada por isolamento de cultura seguindo os procedimentos do Manual Analítico Bacteriológico da FDA.

Amostras negativas podem ser relatadas como tal. A incorporação deste método LAMP no Manual Analítico Bacteriológico da FDA abre caminho para uma aplicação mais ampla desta tecnologia rápida, robusta e fácil de usar em testes de segurança alimentar.