Name: Amplificação isotérmica mediada por loop para triagem de salmonela em alimentos animais e confirmando salmonela do isolamento cultural (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprenda a técnica de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) para detecção rápida de Salmonella em alimentos animais. Este método validado oferece resultados mais rápidos que a PCR tradicional, com baixa taxa de falsos negativos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem aos membros do Subcomitê de Validação de Métodos de Microbiologia da FDA (MMVS) e do Bacteriological Analytical Manual (BAM) Council por revisar criticamente os estudos de validação do método Salmonella LAMP.

<ol><li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Research. 28 (12), 63(2000).</li>
<li>Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+loop-mediated+isothermal+amplification+to+a+culture+medium+and+biological+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).</li>
<li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li>
<li>Yang, Q., Wang, F., Prinyawiwatkul, W., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+Salmonella+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+food+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications.</a> Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).</li>
<li>Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+using+a+nondenatured+template%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template.</a> Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).</li>
<li>Zhang, X., Lowe, S. B., Gooding, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+review+of+monitoring+methods+for+loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP).</a> Biosensors & Bioelectronics. 61, 491-499 (2014).</li>
<li>Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+reaction+by+loop-mediated+isothermal+amplification+using+loop+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers.</a> Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).</li>
<li>Yang, Q., Domesle, K. J., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+for+Salmonella+detection+in+food+and+feed%3A+Current+applications+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Foodborne+Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: Current applications and future directions.</a> Foodborne Pathogens and Disease. 15 (6), 309-331 (2018).</li>
<li>Mori, Y., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+Expansion+of+its+practical+application+as+a+tool+to+achieve+universal+health+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Expansion of its practical application as a tool to achieve universal health coverage.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 26 (1), 13-17 (2020).</li>
<li>Mansour, S. M., Ali, H., Chase, C. C., Cepica, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+for+diagnosis+of+18+World+Organization+for+Animal+Health+%28OIE%29+notifiable+viral+diseases+of+ruminants%2C+swine+and+poultry%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Health+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of 18 World Organization for Animal Health (OIE) notifiable viral diseases of ruminants, swine and poultry.</a> Animal Health Research Reviews. 16 (2), 89-106 (2015).</li>
<li>Kumar, Y., Bansal, S., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+A+rapid+and+sensitive+tool+for+quality+assessment+of+meat+products%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Reviews+in+Food+Science+and+Food+Safety%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products.</a> Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (6), 1359-1378 (2017).</li>
<li>WHO. The use of loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: policy guidance. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/tb/publications/lamp-diagnosis-molecular/en">http://www.who.int/tb/publications/lamp-diagnosis-molecular/en</a> (2016).</li>
<li>Kundapur, R. R., Nema, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification%3A+Beyond+microbial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Cogent+Biology%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification: Beyond microbial identification.</a> Cogent Biology. 2, 1137110(2016).</li>
<li>WHO. Salmonella (non-typhoidal) fact sheet. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en</a> (2018).</li>
<li>FAO/WHO. Executive summary report of the joint FAO/WHO expert meeting on hazards associated with animal feed. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fao.org/3/a-az851e.pdf">http://www.fao.org/3/a-az851e.pdf</a> (2015).</li>
<li>FDA. Compliance Policy Guide Sec. 690.800 Salmonella in Food for Animals. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf">https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf</a> (2013).</li>
<li>Bird, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+3M+molecular+detection+assay+%28MDA%29+2+-+Salmonella+for+the+detection+of+Salmonella+spp.+in+select+foods+and+environmental+surfaces%3A+collaborative+study%2C+first+action+2016.01%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+AOAC+International%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the 3M molecular detection assay (MDA) 2 - Salmonella for the detection of Salmonella spp. in select foods and environmental surfaces: collaborative study, first action 2016.01.</a> Journal of AOAC International. 99 (4), 980-997 (2016).</li>
<li>D'Agostino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+loop-mediated+amplification%2FISO+6579-based+method+for+analysing+soya+meal+for+the+presence+of+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation of a loop-mediated amplification/ISO 6579-based method for analysing soya meal for the presence of Salmonella enterica.</a> Food Analytical Methods. 9 (11), 2979-2985 (2016).</li>
<li>Ge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-laboratory+validation+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+method+for+screening+Salmonella+in+animal+food%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multi-laboratory validation of a loop-mediated isothermal amplification method for screening Salmonella in animal food.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 562(2019).</li>
<li>D'Agostino, M., Diez-Valcarce, M., Robles, S., Losilla-Garcia, B., Cook, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+loop-mediated+isothermal+amplification-based+method+for+analysing+animal+feed+for+the+presence+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A loop-mediated isothermal amplification-based method for analysing animal feed for the presence of Salmonella.</a> Food Analytical Methods. 8 (10), 2409-2416 (2015).</li>
<li>Galan, J. E., Ginocchio, C., Costeas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characterization+of+the+Salmonella+invasion+gene+invA%3A+homology+of+InvA+to+members+of+a+new+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family.</a> Journal of Bacteriology. 174 (13), 4338-4349 (1992).</li>
<li>Chen, S., Wang, F., Beaulieu, J. C., Stein, R. E., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+viable+salmonellae+in+produce+by+coupling+propidium+monoazide+with+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4008-4016 (2011).</li>
<li>Yang, Q., Chen, S., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Salmonella+serovars+in+shell+eggs+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Detecting Salmonella serovars in shell eggs by loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Food Protection. 76 (10), 1790-1796 (2013).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+loop-mediated+isothermal+amplification+for+the+rapid%2C+reliable%2C+and+robust+detection+of+Salmonella+in+produce%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce.</a> Food Microbiology. 46, 485-493 (2015).</li>
<li>Yang, Q., Domesle, K. J., Wang, F., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Salmonella+in+food+and+feed+by+coupling+loop-mediated+isothermal+amplification+with+bioluminescent+assay+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 112(2016).</li>
<li>Domesle, K. J., Yang, Q., Hammack, T. S., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Salmonella+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+in+animal+food%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Validation of a Salmonella loop-mediated isothermal amplification assay in animal food.</a> International Journal of Food Microbiology. 264, 63-76 (2018).</li>
<li>Andrews, W. H., Jacobson, A., Hammack, T. S. Bacteriological Analytical Manual. Chapter 5: Salmonella. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm">http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm</a> (2020).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. As opiniões expressas neste manuscrito são dos autores e não refletem necessariamente a política oficial do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, da Administração de Alimentos e Medicamentos dos EUA ou do Governo dos EUA. A referência a quaisquer materiais comerciais, equipamentos ou processos não constitui de forma alguma aprovação, endosso ou recomendação da Food and Drug Administration.

Apresentamos aqui um método lâmpada simples, rápido, específico e sensível para triagem e confirmação de Salmonella em alimentos animais e cultura pura, respectivamente. Com a conveniência de uma mistura isotemal mestre que contém quatro reagentes-chave, e uma mistura de primer pronta para uso, em casa, a montagem de uma reação LAMP requer apenas alguns passos de pipetação(Figura 1). O tempo total de execução, incluindo fases de amplificação e anneal, é inferior a 38 min (Figura 2A,B e Figura 3A,B). Os resultados positivos são monitorados via fluorescência em tempo real (Figura 2C e Figura 3C,D) e podem ser detectados a partir de 5 min26. A fase anneal serve como uma confirmação extra da especificidade da LÂMPADA, uma vez que apenas amostras com Tm correto (em torno de 90 °C) são relatadas como positivas (Figura 2D,E e Figura 3E−G). Sensibilidades de 1 célula salmonela em cultura pura e < 1 UFC/25 g em alimentos de origem animal foram relatadas anteriormente26.
Como a LÂMPADA é bastante eficaz e gera uma grande quantidade de DNA1,é fundamental que as melhores práticas laboratoriais sejam usadas para evitar a contaminação cruzada, o que pode incluir separar fisicamente as áreas para preparar a mistura mestre da LÂMPADA e adicionar modelos de DNA, evitar gerar aerossóis, usar pontas de pipeta de filtro, trocar luvas com frequência e abster-se de abrir tubos de reação lampião após a amplificação.
A especificidade deste método Salmonella LAMP foi previamente testada utilizando 300 cepas bacterianas (247 Salmonella de 185 serovars e 53 não-Salmonella ) e demonstrou ser 100% específica26. Notavelmente, foram observadas diferenças significativas em Tmax entre as duas espécies Salmonella, S. enterica e Salmonella bongori, e entre as subespécies de S. enterica, especialmente subsp. arizonae (IIIa)26. No entanto, estes ainda foram resultados positivos válidos de acordo com as regras de interpretação dos resultados da LÂMPADA. Em nosso estudo colaborativo multi-laboratorial em alimentos para cães secos que envolveu 14 analistas19, amostras com resultados inconsistentes em corridas duplicadas de LÂMPADAs foram ocasionalmente observadas. Estas geralmente envolviam amostras com resultados positivos atrasados (Tmax > 15 min). Repetir ambas as corridas de forma independente geralmente resolveu o problema. Mais raramente, observamos amostras com valores corretos de Tm, mas não ou valoresmáximos Tirregulares (< 5 min). Isso geralmente era causado por bolhas de ar no tubo de reação.
Ao longo do ciclo de vida do desenvolvimento do método LAMP, avaliação, estudo pré-colaborativo e validação multi-laboratorial, observamos alta tolerância da LÂMPADA aos inibidores em diversos alimentos animais ou matrizes alimentares e mídia cultural4,19,22,23,24, destacando a robustez do método e colaborando inúmeros outros estudos em escala global8. Isso é superior em comparação com PCR ou PCR em tempo real, que geralmente requer um controle de amplificação interna para garantir que os resultados negativos não sejam devido à inibição matricial28. Além disso, lamp demonstrou especificidade e sensibilidade semelhantes (ou superiores) em comparação com PCR ou PCR em tempo real na grande maioria dos estudos8. O custo dos reagentes LAMP é de cerca de US $ 1 por reação. Os instrumentos LAMP utilizados neste protocolo são pequenos, de baixa manutenção e portáteis. Eles podem lidar com qualquer método de amplificação isoteérmica que emprega detecção de alvo por medição de fluorescência, lamp incluído. Usando o software LAMP, relatórios abrangentes podem ser gerados em vários formatos (pdf, texto e imagem).
A validação do método é um passo crítico antes que um novo método possa ser adotado para uso rotineiro. Vale ressaltar que o protocolo LAMP aqui relatado concluiu com sucesso a validação multi-laboratorial19. Com a recente incorporação deste protocolo LAMP no BAM Capítulo 5 Salmonella27da FDA dos EUA, espera-se que o método ganhe um uso muito mais amplo, tanto como um método de triagem rápida em alimentos animais quanto como um método de confirmação confiável para os presuntivos isolados salmonella de todas as categorias alimentares.

Amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) é um novo teste isotémico de amplificação de ácido nucleico (iNAAT) inventado em 2000 por um grupo de cientistas japoneses1. Através da formação de uma estrutura de DNA específica para o alvo durante as etapas iniciais, a LAMP usa uma polimerase de DNA deslocada para amplificar eficientemente este material inicial quase exponencialmente, resultando em 109 cópias do alvo em menos de 1 h1. Comparado com a reação em cadeia de polimerase (PCR), um NAAT amplamente utilizado, o LAMP possui várias vantagens. Em primeiro lugar, as reações lampiães são realizadas em condições istermais. Isso evita a necessidade de um sofisticado instrumento de ciclismo térmico. Em segundo lugar, o LAMP é altamente tolerante à mídia cultural e às substâncias biológicas2 com robustez demonstrada tanto para aplicações clínicas quanto alimentares3,4. Isso simplifica a preparação da amostra e minimiza os resultados negativos falsos5. Em terceiro lugar, o LAMP é amenável a múltiplas plataformas de detecção, como turbidez, colorimetria, bioluminescência, fluorescência e microfluidos6. Em quarto lugar, o LAMP é altamente específico, pois usa de quatro a seis primers especialmente projetados para atingir de seis a oito regiões específicas1,7. Em quinto lugar, lamp é ultrasensível e inúmeros estudos relataram sua sensibilidade superior ao PCR ou PCR8em tempo real . Finalmente, o LAMP é mais rápido com muitos ensaios agora adotando um tempo de execução padrão de 30 minutos, enquanto os ensaios do tipo PCR geralmente levam 1−2 h8.
Essas características atraentes alimentaram a aplicação de LÂMPADA em amplas áreas de detecção de patógenos, incluindo diagnóstico in vitro 9, diagnóstico de doenças animais10e testes alimentares e ambientais11. Notavelmente, uma LÂMPADA de TB (LAMP for Mycobacterium tuberculosis)tem sido recomendada pela OMS como um teste de substituição válido para microscopia de esfutum-difamação para diagnósticos de tuberculose pulmonar em ambientes periféricos12. A aplicação de LÂMPADAs também se expande além da identificação microbiana para incluir a detecção de alérgenos, espécies animais, resistência a medicamentos, organismos geneticamente modificados e pesticidas13.
A Salmonella Não ticidal é um patógeno zoonótico de preocupação substancial com segurança alimentar e saúde pública em todo o mundo14. Também foi identificado como um importante risco microbiano em alimentos para animais (ou seja, alimentos de animais)15,16. Para prevenir doenças/surtos de Salmonella de alimentos humanos e animais contaminados, é imperativo ter métodos rápidos, confiáveis e robustos para testar Salmonella em uma variedade de matrizes. Na última década, esforços consideráveis foram feitos internacionalmente no desenvolvimento e aplicação de ensaios salmonella LAMP em uma ampla gama de matrizes alimentares, como recentemente resumido em uma extensa revisão8. Vários ensaios da Salmonella LAMP, incluindo o apresentado aqui, concluíram com sucesso a validação multi-laboratorial seguindo diretrizes internacionais bem estabelecidas17,18,19,20.
Nosso ensaio Salmonella LAMP tem como alvo especificamente o gene de invasão salmonela invA (número de adesão do GenBank M90846)21 e é rápido, confiável e robusto em múltiplas matrizes alimentares4,22,23,24,25,26. O método foi validado em seis matrizes de alimentos de origem animal em um estudo pré-colaborativo26 e em alimentos para cães secos em um estudo colaborativo multi-laboratorial19. Como resultado, o método Salmonella LAMP apresentado aqui foi recentemente incorporado à Food and Drug Administration (FDA) do Manual Analítico Bacteriológico (BAM) Capítulo 5 Salmonella27 para servir a dois propósitos, um como método de triagem rápida para a presença de Salmonella em alimentos animais e dois como um método de confirmação confiável para a salmonela isolada de todos os alimentos.

<table><tbody><tr><td>Caldo de infusão cérebro-coração (BHI)</td><td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td><td>299070</td><td>Meio de crescimento líquido usado no cultivo de Salmonella.</td></tr><tr><td>Água peptonada tamponada (BPW)</td> <td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td><td>218105</td><td>meio de pré-enriquecimento para a recuperação de Salmonella de amostras de alimentos para animais.</td></tr><tr><td>DNA AWAY</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>7010</td><td>Elimina DNA e DNase indesejados de bancada de laboratório, vidraria e plástico sem afetar as amostras de DNA subsequentes.</td></tr><tr><td>Software Genie Explorer</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, Reino Unido</td><td>Versão 2.0.6.3</td><td>Suporta operação remota de instrumentos Genie, incluindo execuções LAMP e análise de dados.</td></tr><tr><td>Genie II ou Genie III (instrumento LAMP)</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, Reino Unido</td><td>GEN2-02 ou GEN3-02</td><td>Um pequeno instrumento capaz de controlar a temperatura até 100 > C com &plusmn; 0,1 &deg; C e detecção simultânea de fluorescência através do canal FAM. O Genie II tem 2 blocos (A e B) com 8 amostras em cada bloco. O Genie III possui um único bloco que acomoda 8 amostras.</td></tr><tr><td>Tira Genie</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, Reino Unido</td><td>OP-0008</td><td>Tiras de microtubos de 8 poços com tampas de travamento integradas e um volume de trabalho de 10 a 150 &micro;l.</td></tr><tr><td>Suporte de tira Genie</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, Reino Unido</td><td>GBLOCK</td><td>Usado para segurar tiras Genie ao configurar uma reação LAMP, o suporte de alumínio também pode ser usado como um bloco frio.</td></tr><tr><td>Solução de ácido clorídrico (HCl), 1 N</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>SA48-500</td><td>Ajusta o pH de amostras de alimentos de origem animal após a adição de BPW e antes do enriquecimento durante a noite.</td></tr><tr><td>Bloco de calor</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>88-860-022</td><td>Aquece amostras a 100 &plusmn; 1 oC para extração de DNA.</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>3960</td><td>Incubadora de laboratório padrão.</td></tr><tr><td>ISO-001 master mix isotérmico</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, Reino Unido</td><td>ISO-001</td><td>Um master mix otimizado para simplificar a montagem de uma reação LAMP, contendo um grande fragmento de DNA polimerase GspSSD de Geobacillus spp., pirofosfatase inorgânica termoestável, tampão de reação, MgSO4, dNTPs e um corante de ligação de DNA de fita dupla (canal de detecção FAM).</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>A416</td><td>Desinfeta superfícies de trabalho.</td></tr><tr><td>Primers LAMP</td><td>Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA</td><td>Primers LAMP personalizados</td><td>com informações detalhadas na Tabela 1.</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf North America, Hauppauge, NY</td><td>22620207</td><td>MiniSpin mais microcentrífuga pessoal.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>05-408-129</td><td>Tubos de microcentrífuga padrão.</td></tr><tr><td>Água de grau molecular</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>AM9938</td><td>Usado na fabricação de estoques de primer, mistura de primer e mistura de reação LAMP.</td></tr><tr><td>Solução de hidróxido de sódio (NaOH), 1 N</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>SS266-1</td><td>Ajusta o pH de amostras de alimentos para animais após a adição de BPW e antes do enriquecimento noturno.</td></tr><tr><td>Ágar não seletivo (por exemplo, ágar sangue, ágar nutriente e ágar tripticase soja)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>R01202</td><td>Meio de crescimento sólido usado no cultivo de Salmonella.</td></tr><tr>Sistemas de diagnóstico BD <td>de água peptona</td><td>, Sparks, MD</td><td>218071</td><td>Dilui culturas de Salmonella durante a noite para fazer DNA de controle positivo.</td></tr><tr><td>Pipetas e ponteiras</td><td>Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA</td><td>Pipet Lite Série LTS Pipetas</td><td>e ponteiras de laboratório padrão.</td></tr><tr><td>Reagente de preparação de amostras PrepMan Ultra</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>4318930</td><td>Um kit simples usado para a preparação rápida de modelos de DNA para uso em uma reação LAMP.</td></tr><tr><td>Cepa de referência de Salmonella LT2</td><td>ATCC, Manassas, VA</td><td>700720</td><td>Cepa de referência de Salmonella usada como controle positivo.</td></tr><tr><td>Caldo de soja tripticase (TSB)</td><td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td><td>211768</td><td>Meio de crescimento líquido usado no cultivo de Salmonella.</td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY</td><td>SI-0236</td><td>Misturador de vórtice de laboratório padrão.</td></tr><tr><td>Saco de filtro Whirl-pak</td><td>Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI</td><td>B01318</td><td>Sacos de filtro para armazenar amostras de alimentos de origem animal para pré-enriquecimento.</td></tr></tbody></table>

amplificação isotérmica mediada por loop para triagem de salmonela em alimentos animais e confirmando salmonela do isolamento cultural

Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

A amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) emergiu como um poderoso teste de amplificação de ácido nucleico para a rápida detecção de numerosos agentes bacterianos, fúngicos, parasitários e virais. Salmonela é um patógeno bacteriano da preocupação mundial com a segurança alimentar, incluindo alimentos para animais. Apresentado aqui é um protocolo salmonella LAMP validado em vários laboratórios que pode ser usado para rastrear rapidamente alimentos de origem animal para a presença de contaminação salmonela e também pode ser usado para confirmar os presuntivos isolados salmonella recuperados de todas as categorias alimentares. O ensaio LAMP tem como alvo especificamente o gene de invasão salmonela (invA)e é rápido, sensível e altamente específico. Modelo DNAs são preparados a partir de caldos de enriquecimento de alimentos de origem animal ou culturas puras de isolados de Salmonella presunçosos. A mistura de reagente LAMP é preparada combinando uma mistura isotemal mestre, primers, modelo de DNA e água. O ensaio LAMP funciona a uma temperatura constante de 65 °C por 30 min. Os resultados positivos são monitorados via fluorescência em tempo real e podem ser detectados em até 5 minutos. O ensaio LAMP exibe alta tolerância aos inibidores em alimentos ou meios de cultura animal, servindo como um método rápido, confiável, robusto, econômico e fácil de usar para triagem e confirmação de Salmonella. O método LAMP foi recentemente incorporado ao Manual Analítico Bacteriológico (BAM) da Administração de Alimentos e Medicamentos dos EUA, capítulo 5.

As figuras 2 e a figura 3 mostram gráficos/tabelas lampiões representativas exibidos em ambas as plataformas. Nesta execução da LÂMPADA, as amostras S1 a S6 são diluições seriais de S. enterica serovar Infantis ATCC 51741 variando de 1,1 x 106 UFC a 11 UFC por reação. Controle positivo é S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) a 1,7 x 104 UFC por reação e NTC é água de grau molecular.
Como mostrado na Figura 2E e Figura 3G,tanto os poços NTC quanto o PC são controles válidos. O poço NTC tem Tmax em branco enquanto Tm é &lt; 83 °C no painel de instrumentos LAMP e em branco no software LAMP, sugerindo um resultado negativo. O PC bem tem Tmax de 7 min 45 seg e Tm de ~ 90 °C em ambas as plataformas, sugerindo um resultado positivo. Amostras S1 a S6 têm Tmax entre 6 min 30 seg e 12 min 15 seg, todas sendo Salmonella-positivo.
Após as duplicatas do mesmo conjunto de amostras, os resultados finais da LÂMPADA são relatados para estas amostras. Esta execução de LÂMPADA representativa mostra que a LAMP detecta com sucesso Salmonella com uma ampla gama de concentrações nas amostras.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61239/61239fig2v2.jpg"> Figura 2: Resultados representativos da LÂMPADA exibidos no painel de instrumentos LAMP. (A) A guia Perfil mostra o perfil de temperatura programado. (B) A guia temperatura mostra temperaturas reais nos poços de amostra e a reação da LÂMPADA prossegue. (C) A guia Amplificação mostra leituras de fluorescência durante a amplificação da LÂMPADA. (D) A aba Anneal apresenta alterações na fluorescência (derivada) durante a fase anneal. (E) A guia Resultados mostra uma exibição tabular dos resultados da LÂMPADA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61239/61239fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61239/61239fig3v2.jpg"> Figura 3: Resultados de LÂMPADA representativos visualizados no software LAMP. (A) A guia Perfil mostra o perfil de temperatura programado. (B) A guia temperatura mostra temperaturas reais nos poços de amostra e a reação da LÂMPADA prossegue. (C) A guia Amplificação mostra leituras de fluorescência durante a amplificação da LÂMPADA. (D) A guia Taxa de Amplificação apresenta alterações na fluorescência (relação fluorescência) durante a amplificação da LÂMPADA. (E) A aba Anneal apresenta leituras de fluorescência durante a fase anneal. (F) A aba Derivada De Anneal apresenta alterações na fluorescência (derivada) durante a fase anneal. (G) A guia Resultado mostra uma exibição tabular dos resultados do LAMP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61239/61239fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) é um teste isotémico de amplificação de ácido nucleico (iNAAT) que tem atraído amplo interesse no campo de detecção de patógenos. Aqui, apresentamos um protocolo salmonella LAMP validado em vários laboratórios como um método rápido, confiável e robusto para a triagem de Salmonella em alimentos animais e confirmando salmonela presuntiva do isolamento cultural.

Amplificação isotérmica mediada por loop para triagem de salmonela em alimentos animais e confirmando salmonela do isolamento cultural

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has emerged as a powerful nucleic acid amplification test for the rapid detection of numerous bacterial, ...

Este método LAMP de Salmonella foi incorporado ao Manual Analítico Bacteriológico da FDA, tanto como método de triagem em alimentos para animais quanto como método de confirmação para quaisquer isolados de Salmonella presuntivos. O método é rápido, confiável e robusto. Em comparação com a PCR, suas principais vantagens incluem testes rápidos, instrumentação simples, baixa taxa de falsos negativos e fluxo de trabalho flexível.A triagem rápida de patógenos como a salmonela desempenha um papel importante na detecção rápida de um produto potencialmente contaminado e pode prevenir doenças ou surtos em humanos e animais. Comece preparando modelos de DNA para o ensaio LAMP. Existem dois tipos de amostras usadas para fazer modelos de DNA.Para preparar modelos a partir de amostras de alimentos para animais, pesar assepticamente 25 gramas de amostra de alimentos em um saco de filtro estéril. Adicione 225 mililitros de água peptonada tamponada estéril ao saco e incube-o a 35 graus Celsius por 24 horas. Após a incubação, transfira um mililitro do lado filtrado do saco para um tubo de microcentrífuga.Centrifugar o tubo a 900 vezes G durante um minuto. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Centrifugar a amostra a 16 000 vezes G durante dois minutos.E para descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 100 microlitros do reagente de preparação da amostra e aqueça-o a 100 graus Celsius por 10 minutos em um bloco de calor seco. Em seguida, resfrie a amostra à temperatura ambiente e armazene-a a 20 graus Celsius negativos. O segundo tipo de amostra para este ensaio LAMP vem diretamente de culturas presuntivas de salmonela.Para preparar modelos de DNA, transfira 500 microlitros de uma cultura de salmonela durante a noite para um tubo de microcentrífuga e aqueça-o em um bloco de calor de 100 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, resfrie a amostra à temperatura ambiente e armazene-a a 20 graus Celsius negativos. Para evitar a contaminação cruzada, separe fisicamente as áreas usadas para preparar o LAMP Master Mix e adicionar os modelos de DNA.Limpe as superfícies de trabalho com isopropanol e uma solução degradante de DNA e DNA. Em seguida, limpe as pipetas e os porta-tubos. Descongele o Master Mix isotérmico, o 10X Primer Mix, a água de grau molecular, o DNA de controle positivo e os modelos de DNA à temperatura ambiente.Ligue o instrumento LAMP e insira as informações relevantes da amostra. Prepare o LAMP Master Mix de acordo com as instruções do manuscrito, vortex e centrifugue-o brevemente e distribua 23 microlitros do Master Mix em cada poço de uma tira de tubo. Vortex todos os modelos de DNA e centrifugue-os brevemente.Em seguida, adicione dois microlitros de molde de DNA ao poço apropriado e tampe bem o poço. Remova a tira do tubo do suporte e agite-a para garantir que todos os reagentes se acumularam na parte inferior do tubo. Carregue a tira de tubo no instrumento LAMP e inicie a execução do LAMP.Enquanto a reação LAMP estiver em andamento, toque nas guias Temperatura, Amplificação e Recozimento para ver as alterações dinâmicas de vários parâmetros durante a execução do LAMP. Os resultados do LAMP podem ser visualizados no painel de instrumentos do LAMP em tempo real ou usando o software LAMP. Para interpretar os resultados no painel de instrumentos, abra o percurso LAMP de interesse.Observe as cinco guias associadas a cada execução. As guias Perfil e Temperatura mostram as temperaturas programadas e reais nos poços de amostra à medida que a reação LAMP prossegue. As guias Amplificação e Recozimento mostram leituras de fluorescência e alterações na fluorescência durante as fases de Amplificação e Recozimento, respectivamente.A guia Resultados mostra a visualização tabular dos resultados do LAMP que podem ser interpretados de acordo com as instruções dos manuscritos. A segunda maneira de visualizar os resultados do LAMP é usando o software LAMP. Para interpretar os resultados com o software, clique no ícone Computador no painel esquerdo e navegue até o local do arquivo para carregar a execução do LAMP de interesse.Observe as sete guias associadas a cada execução. As guias Perfil e Temperatura mostram as temperaturas programadas e reais nos poços de amostra à medida que a reação LAMP prossegue. As guias Amplificação e Taxa de amplificação mostram leituras de fluorescência e alterações na fluorescência durante a fase de amplificação.As guias Recozimento e Recozimento Derivado mostram leituras de fluorescência e alterações na fluorescência durante a fase de Recozimento. A guia Resultados mostra uma exibição tabular dos resultados do LAMP. Existem quatro colunas intituladas Nome do gráfico, Número do poço, Nome do poço e Valor de pico.O tempo de amplificador e os derivados de recozimento de todas as oito amostras são mostrados. Os resultados podem ser interpretados de acordo com as instruções dos manuscritos. O painel de instrumentos LAMP e o software LAMP podem ser usados para exibir os resultados do ensaio.Nesta execução do LAMP, as amostras S1 a S6 são diluições seriais dez vezes maiores de Salmonella enterica sorovar Infantis ATCC 51741, variando de 1,1 milhão a 11 unidades formadoras de colônias por reação. O controle positivo, ou PC, é Salmonella enterica Serovar Typhimurium LT2 a 17.000 unidades formadoras de colônias por reação, e o controle sem molde, ou NTC, é água de grau molecular. O poço NTC tem um Tmax em branco e uma temperatura Aneal de aproximadamente 81 graus Celsius no painel de instrumentos LAMP, e um Tmax em branco e uma temperatura de recozimento em branco no software LAMP.O poço de controle positivo tem um Tmax de sete minutos e 45 segundos e temperatura de recozimento de aproximadamente 90 graus Celsius em ambas as plataformas. As amostras S1 a S6 têm Tmax entre seis minutos e 30 segundos e 12 minutos e 15 segundos, e temperatura de recozimento de aproximadamente 90 graus Celsius, todos indicando uma detecção positiva. O LAMP é muito eficaz e gera uma grande quantidade de DNA.Portanto, é fundamental que as melhores práticas laboratoriais sejam usadas para evitar a contaminação cruzada. Use práticas semelhantes ao fazer seus modelos de DNA, pois os enriquecimentos de alimentos de origem animal contaminados podem ter altos níveis de salmonela. A triagem de amostras de alimentos para animais positiva com LAMP deve ser confirmada por isolamento de cultura seguindo os procedimentos do Manual Analítico Bacteriológico da FDA.Amostras negativas podem ser relatadas como tal. A incorporação deste método LAMP no Manual Analítico Bacteriológico da FDA abre caminho para uma aplicação mais ampla desta tecnologia rápida, robusta e fácil de usar em testes de segurança alimentar.

loop-mediated-isothermal-amplification-for-screening-salmonella

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve uma abordagem adesivo baseados em fita simples para amostragem de tomate e outras superfícies de produtos frescos, seguido por detecção rápida de células toda...

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

Nós descrevemos um multiplex PCR para a detecção rápida de Salmonella enterica sorotipos Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium. Sorovares de Salmonella específicos podem ser identificados por alvo um multiplex PCR para os genes e as seqüências exclusivas para o cluster biossíntese O antígeno-flagelina e de um sorovar dado. Sorovar é atribuída então a uma Salmonella isolar baseado na aparência de amplicons específicos, o tamanho (produto de PCR) correspondente ao alelo alvo.

Uma PCR Allelotyping para Identificar Salmonella enterica Sorovares Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium

Fonte: Domesle, K. J., et al. Amplificação isotérmica mediada por laços para triagem de Salmonella em alimentos de origem animal e confirmação de Salmonela por isolamento em cultura.  J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra a técnica de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) para detectar um gene bacteriano alvo amplificando o DNA a temperatura constante. A mistura de reação é preparada adicionando uma mistura mestre isotérmica, primers específicos para o gene-alvo e amostras contendo...

Amplificação isotérmica mediada por alça para detecção de genes bacterianos

Um protocolo baseado em PCR foi adaptado para detectar Cronobacter spp., Salmonella enterica e Listeria monocytogenes de superfícies corporais e canais alimentares de moscas capturadas na natureza. O objetivo deste protocolo é detectar e isolar patógenos bacterianos de insetos individuais coletados como parte de um programa de amostragem ambiental durante investigações de surtos de origem alimentar.

Detecção de Patógenos alimentares bacterianas de Flies Individual Filth

O diagnóstico de infecção por Eimeria em galinhas continua exigente. As abordagens baseadas na morfologia do parasita e na patologia do hospedeiro são comumente inconclusivas, enquanto as abordagens moleculares baseadas em PCR provaram ser exigentes em custo e experiência. O objetivo deste protocolo é estabelecer a amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP) como um diagnóstico molecular direto para infecção eimeriana.

Isothermal amplificação (lâmpada), Ensaios mediada por loop para detecção específica da espécie os de<em&gt; Eimeria</em&gt; Que infectam Galinhas

Este protocolo descreve a detecção de integrons de classe 1 e seus de genes associados em alimentos.

Triagem géneros alimentícios destinados a uma classe integrons e Gene Cassetes

Salmonella spp. /Shigella spp. são patógenos comuns atribuídos a diarreia. Aqui, descrevemos uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp. usando PCR em tempo real combinadas com cultura guiada.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar amostras de DNA de alimentos e ambiental microbiomes para detecção concertada e subtipos de salmonelas através do sequenciamento de quasimetagenomic. O uso combinado de enriquecimento da cultura, separação Fima (IMS) e vários deslocamento amplificação (MDA) permite a concentração eficaz de salmonelas de DNA genômico de amostras ambientais e alimentos.

Quasi-metagenomic análise de Salmonella de alimentos e amostras ambientais

Aqui apresentamos o princípio, a estrutura e a instrução do sistema inteligente de teste de sensibilidade antimicrobiana de alto rendimento/triagem de fagos. Sua aplicação é ilustrada usando Salmonella isolada de aves em Shandong, China, como exemplo. O índice Lar é calculado, e sua importância na avaliação da resistência antimicrobiana é discutida de forma abrangente.

Aplicação do Sistema Inteligente de Teste de Sensibilidade Antimicrobiana de Alto Rendimento/Phage Screening System e Índice Lar de Resistência Antimicrobiana

Quantificar com precisão a Salmonella em aves em níveis baixos é um desafio industrial e regulatório atual. Este protocolo descreve um ensaio MPN que permite a quantificação de Salmonella em produtos avícolas crus e prontos para cozinhar. Este método é rápido, sensível e se alinha com as diretrizes do FSIS, aumentando a segurança alimentar e apoiando os esforços de saúde pública.

Ensaio de número mais provável modificado para quantificar Salmonella em produtos de frango crus e prontos para cozinhar

Aprenda a técnica de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) para detecção rápida de Salmonella em alimentos animais. Este método validado oferece resultados mais rápidos que a PCR tradicional, com baixa taxa de falsos negativos.

Amplificação isotérmica mediada por loop para triagem de salmonela em alimentos animais e confirmando salmonela do isolamento cultural (Vídeo) | JoVE Journal

Amplificação isotérmica mediada por loop para triagem de salmonela em alimentos animais e confirmando salmonela do isolamento cultural

Explorar mais vídeos