Preparação e Co-imunoprecipitação de Caenorhabditis elegans

Este protocolo fornece um procedimento passo a passo para coleta de amostras, preparação de extratos e imunoprecipitação para a confirmação de um pull-down de proteína bem-sucedido e a detecção de proteínas co-imunoprecipitadas de interesse. A preparação do extrato de proteína pode ser realizada para até 24 amostras e é compatível com várias aplicações a jusante, incluindo experimentos de imunoprecipitação e extração de RNA. Este método pode ser adaptado para facilitar o teste de interações entre duas ou mais proteínas endógenas, marcadas endogenamente ou superexpressas em uma variedade de origens genéticas.

A demonstração visual deste protocolo destina-se a deixar os pesquisadores confortáveis com a preparação e imunoprecipitação de extratos de proteínas, encorajando aqueles que são novos nas técnicas a usá-las em suas pesquisas. Para coletar uma amostra de vermes, primeiro semeie vermes em estágio misto ou sincronizado em placas de meio de crescimento de nematóides sólidos na temperatura necessária e permita que os vermes cresçam até o estágio desejado. No final da incubação, use tampão M9 para lavar os vermes em um tubo cônico de 15 mililitros e peletizar os vermes por centrifugação.

No final da centrifugação, remover o sobrenadante e lavar os vermes mais três a cinco vezes em tampão M9 fresco por lavagem. Quando o sobrenadante não estiver mais turvo, faça uma lavagem final com água bidestilada e transfira o pellet de minhoca solto para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Pulverizar os vermes com uma centrifugação adicional e rejeitar o sobrenadante restante para obter um pellet de minhoca embalado.

Para preparar o extrato do pellet de minhoca coletado, adicione um volume igual de tampão de lise 2X gelado a um pellet de volume recomendado de 300 microlitros e misture vigorosamente a suspensão resultante. Gire a amostra para coletar a mistura no fundo do tubo e transfira o conteúdo do tubo para um tubo livre de RNAse de 1,5 mililitro contendo esferas de metal. Depois de tampar bem o tubo, coloque a amostra em um homogeneizador de moinho de esferas a quatro graus Celsius, tomando cuidado para que a amostra seja equilibrada dentro do homogeneizador.

Homogeneizar a amostra na velocidade mais alta por quatro minutos antes de transferi-la para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro sem esferas. Girar a amostra para clarificar o extracto proteico e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitros no gelo, sem transferir o precipitado turvo branco no topo da amostra. Reserve 10 microlitros do extrato clarificado para determinar a concentração total de proteína de acordo com os protocolos padrão e dilua imediatamente a amostra para cinco ou 10 miligramas de proteína por mililitro de tampão de lise 1X gelado no gelo.

Para imunoprecipitação da proteína de interesse, primeiro ressuspenda os grânulos magnéticos por inversão e transfira 150 microlitros da suspensão de grânulos 50X para um tubo de 1,5 mililitro. Magnetize as contas no gelo contra um suporte magnético por cerca de um minuto. Quando a solução estiver clara, descarte o sobrenadante.

Remova o tubo do suporte magnético e lave os grânulos com três volumes de 300 microlitros de tampão de lise 1X. Após a última lavagem, ressuspenda os grânulos em 150 microlitros de tampão de lise gelada e transfira 75 microlitros da pasta do grânulo para dois miligramas da amostra de extrato de proteína. Após uma incubação de uma hora a quatro graus Celsius com agitação suave, coloque o sample tubo no ímã sobre gelo por cerca de um minuto.

Quando as contas estiverem totalmente magnetizadas e a amostra estiver límpida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro sem perturbar as contas. Separe 10% da amostra para análise de Western blot e adicione 20 microgramas de anticorpo purificado por afinidade ao lisado pré-limpo para uma incubação de uma hora a quatro graus Celsius com agitação suave. No final da incubação, adicione os 75 microlitros restantes de suspensão de esferas pré-lavadas à mistura de lisado de anticorpos para uma incubação adicional de uma hora a quatro graus Celsius com agitação suave.

No final da incubação, coloque a amostra de volta no ímã por cerca de um minuto. Quando os grânulos estiverem totalmente magnetizados e a amostra estiver clara, lave os grânulos contendo o imunoprecipitado três vezes em 450 microlitros de tampão de lavagem no gelo. Após a última lavagem, ressuspenda o grânulo em 20 microlitros de tampão de carga de gel de proteína beta-mercaptoetanol 2X SDS e ferva a amostra a 95 graus Celsius por cinco minutos.

Para detecção das proteínas imunoprecipitadas por análise de Western blot, carregue a amostra de proteína desnaturada em um gel SDS-PAGE sem transferir os grânulos e execute a análise de Western blot de acordo com protocolos padrão usando os anticorpos apropriados para as proteínas de interesse e, em seguida, detecte as bandas usando quimioluminescência à base de peroxidase de rábano. O protocolo de homogeneizador de moinho de esferas demonstrado é comparável na extração total de proteínas a métodos baseados em dounce para a extração eficiente de proteínas nucleares e citoplasmáticas. Nesta análise, determinou-se que as proteínas Argonautas interagem com membros da família de proteínas GW182 formando os complexos de silenciamento induzidos por microRNA que se ligam aos RNAs mensageiros alvo e reprimem sua expressão.

Os protocolos de extrato e imunoprecipitação demonstrados também podem ser usados para recuperar com sucesso co-imunoprecipitados específicos de ALG-1 e HRPK-1. Além disso, o teste da interação ALG-1:AIN-1 em uma variedade de fundos genéticos revelou que HRPK-1 é desnecessário para a montagem do complexo de silenciamento induzido por microRNA ALG-1:AIN-1. É importante certificar-se de que a extração de proteínas e a imunoprecipitação sejam realizadas a quatro graus Celsius ou em gelo para manter a estabilidade das amostras.

Esta preparação de extrato de proteína total é compatível com experimentos de imunoprecipitação de proteínas e extração de microRNA usando um oligonucleotídeo complementar de microRNA e facilita a coleta a jusante de componentes de proteína e RNA.