Preparação de tecidos cardíacos projetados em forma de malha derivados de células iPS humanas para reparo de miocárdio in vivo
9 de junho de 2020
O presente protocolo gera tecidos cardíacos projetados em forma de malha contendo células cardiovasculares derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para permitir a investigação da terapia de implantação celular para doenças cardíacas.
Este protocolo descreve um método nobre e fácil para criar tecidos cardíacos projetados em forma de malha derivados de partes do corpo induzidas pelo homem e células-TRONCO derivadas de células. A flexibilidade da geometria tecidual e a escalabilidade da função tecidual preservada são as principais vantagens dessa técnica. Os ECTs de forma de malha implantados podem restaurar uma estrutura cardíaca e funcionar em um modelo de infarto do miocárdio de rato.
Confirmando sua viabilidade para uso em terapia regenerativa cardíaca. Essas técnicas requerem processamento de células STEM humanas reprodutíveis e habilidades de cultura tecidual para resultados consistentes. Comece cortando uma folha PDMS curada ao tamanho adequado para permitir que a folha seja ligada com adesivo de silicone para fabricar uma bandeja retangular de 21 por 20,5 milímetros com sete milímetros de largura e 2,5 milímetros de altura em posições retangulares escalonadas.
O espaçamento horizontal entre duas linhas de postes deve ser de 2,5 milímetros. Autoclave a bandeja a 120 graus Celsius por 20 minutos antes de revestir o molde com 1% Poloxamer 407 em PBS por uma hora. Em seguida, enxágue completamente o molde com PBS e coloque o molde em um poço de uma placa de seis poços.
Para análise de linhagem, combine as células do cardiomiócito mais protocolos de células mural endoteliais e vasculares. De modo que a concentração final de células mural é de 10 a 20% em um número celular total de seis vezes 10 para as seis células por construção. Misture 133 microliters de ácido solúvel Rat Tail solução tipo um e 17 microliters de Tampão alcalino a 17 microliters de 10X Mínimo Essencial Médio no gelo.
Em seguida, adicione 67 microliters de Basement Membrane Matrix à solução de colágeno. Em seguida, centrifugar as células e resuspensar a pelota em 167 microliters do Medium Essencial Mínimo de Alta Glicose Dulbecco complementado com soro bovino fetal e antibióticos. Misture as células na solução matricial no gelo.
Em seguida, despeje cuidadosamente 400 microliters da suspensão da matriz celular no molde de tecido PDMS revestido poloxamer 407. Incubar a mistura de matriz celular em uma incubadora de cultura celular padrão a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 60 minutos. Quando o tecido for formado, mergulhe cuidadosamente o molde com quatro mililitros de cultura ECT e devolva a placa à incubadora de cultura celular por 14 dias.
Antes da implantação da ECT, você esterilizasse fórceps finos para remover cuidadosamente o ECT dos postes de carregamento. Moldes de tecido podem ser fabricados com vários padrões, comprimentos postais e pós-espaçamento para gerar diferentes geometrias finais de ECT. Para esta análise, utilizou-se um molde com postes longos de sete milímetros com intervalos de 2,5 milímetros de largura.
Poloxamer 407 previne a adesão das células ao molde e permite a formação de uma estrutura de malha característica, após compactação rápida de gel em 14 dias. A estrutura é mantida mesmo após a liberação da ECT do molde. A construção de tecido fabricado tem aproximadamente 1,5 centímetros de largura e 0,5 milímetros de espessura.
E a largura de cada feixe na malha é de aproximadamente 0,5 milímetros em média. É possível gerar um ECT de malha de largura final de 3 centímetros contendo 24 milhões de células de um molde quatro vezes maior com o mesmo design de post escalonado. Esta malha maior ECT também pode ser facilmente removida do molde e gera um ato local de força equivalente à malha menor ECT.
É importante despejar a mistura da matriz celular uniformemente no molde do tecido sem gerar bolhas para evitar sentir defeitos no gel final. Caracterização funcional do contratante. e as relações de quarta frequência podem ser realizadas usando sistemas embutidos.
Nosso objetivo final é a tradução dos paradigmas da ECT em terapias clínicas que utilizam grandes estudos pré-clínicos animais.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método novo e simples para criar tecidos cardíacos engenheirizados em formato de malha derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas. A técnica permite a investigação da terapia com implante celular para doenças cardíacas, particularmente em um modelo de infarto do miocárdio em rato.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Engenharia de tecidos cardíacos
- Terapia com células-tronco
- Medicina regenerativa
Contexto
- Tecidos cardíacos engenheirados podem restaurar a estrutura e a função cardíacas.
- Células-tronco pluripotentes induzidas humanas são um recurso valioso para a obtenção de células cardíacas.
- A flexibilidade da geometria do tecido é crucial para um implante eficaz.
- A reprodutibilidade no processamento de células-tronco é essencial para resultados consistentes.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para criar tecidos cardíacos engenheirizados com formato de malha.
- Avaliar a viabilidade desses tecidos na terapia regenerativa cardíaca.
- Investigar a restauração da função cardíaca após o implante.
Métodos Utilizados
- Fabricação de uma bandeja retangular utilizando PDMS e adesivo de silicone.
- Criação de suportes para fixar os tecidos cardíacos engenheirados.
- Implante dos tecidos cardíacos engenheirados em um modelo de rato.
- Avaliação da restauração da estrutura e função cardíacas.
Principais Resultados
- Os tecidos cardíacos projetados em formato de malha restauraram com sucesso a função cardíaca.
- O método demonstrou escalabilidade e flexibilidade na geometria do tecido.
- Resultados consistentes foram obtidos por meio de processamento reprodutível de células-tronco.
- A técnica é viável para uso na terapia regenerativa cardíaca.
Conclusões
- Este protocolo fornece um método confiável para criar tecidos cardíacos engenheirizados.
- Tecidos com formato de malha podem restaurar efetivamente a função cardíaca em um modelo de infarto do miocárdio.
- A abordagem apresenta potencial para futuras terapias regenerativas cardíacas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a produção escalonável de tecidos cardíacos projetados em formato de malha a partir de células cardiovasculares derivadas de iPSCs humanos, oferecendo uma plataforma reprodutível para estratégias de reparo miocárdico. A abordagem suporta a avaliação pré-clínica da integração tecidual e da restauração funcional em modelos de lesão isquêmica, abordando uma lacuna crítica na cardiologia regenerativa. Ao fornecer um constructo geometricamente ajustável e escalonável, facilita a redução de riscos translacionais de terapias baseadas em células-tronco para insuficiência cardíaca.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a avaliação da integração estrutural e funcional de células cardíacas derivadas de hiPSCs in vivo.
- Valor Operacional: Fornece um formato tecidual padronizado e reprodutível para leituras pré-clínicas consistentes entre estudos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera métricas estruturais quantificáveis (por exemplo, alinhamento de feixes de miócitos, contração sincrônica) para o desenvolvimento de ensaios funcionais.
- Valor Operacional: Permite a escalabilidade para construtos maiores (até 3,0 cm), possibilitando testes de resposta à dose e de consistência entre lotes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Demonstra a viabilidade de restaurar a estrutura e a função cardíacas em um modelo de infarto do miocárdio em ratos, apoiando a desmistificação mecanicista.
- Valor Operacional: Conecta a descoberta à validação pré-clínica por meio de fluxos de trabalho padronizados de implantação e avaliação funcional.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método posiciona os ECTs em formato de malha como uma ponte entre descoberta e pré-clínico, permitindo testes de hipóteses na fase inicial de descoberta e validação funcional em estágios pré-clínicos por meio da produção escalável e reprodutível de tecidos.
- Biologia de Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos ao permitir a avaliação controlada da integração e função eletromecânica de células cardíacas derivadas de hiPSCs.
- Triagem: Fornece tecidos padronizados e prontos para ensaio com resultados quantificáveis (sincronia de batimentos, alinhamento) para comparação de compostos ou condições.
- Análises: Oferece parâmetros estruturais e funcionais (dimensões do constructo, diâmetro de miofibras, sincronia da contração) para permitir análises comparativas entre grupos experimentais.
- Pesquisa Translacional: Garante continuidade da maturação in vitro à restauração funcional in vivo, apoiando decisões de avanço com ajuste de risco.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma tecnologia de plataforma adaptável a diversas geometrias e escalas, promovendo reprodutibilidade entre projetos e eficiência de recursos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista no enxerto de células-tronco e na contribuição funcional para a reparação cardíaca.
- Valor Operacional: Garante padronização e escalabilidade por meio de proporções definidas de células, formulação da matriz e geometria do molde.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção ao fornecer dados reprodutíveis de eficácia pré-clínica, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos à regeneração cardíaca com base no desempenho tecidual validado e na escalabilidade.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em diferenciação de iPSCs humanas, especificação de linhagem cardiovascular e técnicas de cultivo de tecidos tridimensionais.
- Depende do acesso a equipamentos de moldagem de PDMS, capacidades de esterilização e manipulação precisa de fluidos para a mistura matriz-célula.
- Necessita padronização entre equipes no fornecimento celular, preparação da matriz e protocolos de incubação para garantir consistência entre lotes.
- Envolve considerações de adaptação ao escalar para construtos maiores ou geometrias alternativas, particularmente em relação à difusão de nutrientes e acoplamento elétrico.
- Limitado pela dependência atual em modelos de roedores para validação funcional, exigindo sistemas pré-clínicos maiores para a translação clínica.
