Name: Preparação de tecidos cardíacos projetados em forma de malha derivados de células iPS humanas para reparo de miocárdio in vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Aprenda a criar tecidos cardíacos em malha derivados de células iPS humanas para engenharia de tecidos cardíacos. Este método demonstra viabilidade na restauração da função cardíaca em modelo de infarto do miocárdio em ratos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Programa de Pesquisa Cardíaca Pediátrica de Instituições de Caridade Kosair da Universidade de Louisville e pelo Projeto Organoide no RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. Os HiPSCs usados em nossos protocolos publicados foram fornecidos pelo Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Japan.

1. Manutenção de hiPSCs e diferenciação cardiovascular
<ol><li>Expandir e manter hiPSCs na matriz de membrana de porão de camada fina (fator de crescimento reduzido, diluição de 1:60) em meio condicionado extraído de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF-CM) com fator de crescimento do fibroblasto básico humano (hbFGF)4. NOTA: Usamos uma linha hiPSCs (4 fatores (Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc): 201B6). Adicione hbFGF na concentração apropriada para cada linha celular. Fragmento laminin-511 também pode ser usado para o revestimento do prato de cultura em vez de matriz de membrana porão. O meio comercialmente disponível projetado para a cultura livre de alimentador de hiPSCs pode ser usado como um substituto para o MEF-CM.</li>
	<li>Use versene (0,48 mM de ácido cinacético (EDTA) para desprender e dissociar células quando a confluência celular atingir 90\u2012100%. NOTA: Outros produtos disponíveis comercialmente para dissociação celular também podem ser usados.</li>
	<li>Células de placa a uma densidade de 10.000 células/mm2 em placas de cultura de células revestidas de matriz em MEF-CM com hbFGF e cultura por dois a três dias.</li>
	<li>Quando a cultura se tornar totalmente confluente, cubra as células com matriz (diluição de 1:60 com MEF-CM) por um dia.</li>
	<li>Substitua o MEF-CM pelo meio RPMI 1640 + B27. Adicione 100 ng/mL de Activin A e 100 ng/mL de Wnt3A ao meio por um dia. NOTA: Este é o dia 0 de diferenciação. Para aumentar a sinalização canônica Wnt, os inibidores GSK3β também podem ser usados em vez de Wnt3A.</li>
	<li>No primeiro dia de diferenciação, mude o médio para o novo RPMI 1640 + B27 com 10 ng/mL de BMP4 e 10 ng/mL de hbFGF. Células de cultura para dois (protocolo MC) ou quatro (protocolo CM+CE) dias sem alteração média5. NOTA: O protocolo CM+CE é otimizado para induzir simultaneamente cardiomiócitos (CMs) e células endoteliais vasculares (CES). O protocolo MC é otimizado para induzir preferencialmente células mural vascular (MCs).</li>
	<li>Protocolo CM+CE para indução de CMs e CEs (Figura 1A).<ol>
<li>Substitua o meio no dia 5 de diferenciação com RPMI 1640 + B27 complementado por 50 ng/mL de VEGF165.</li>
		<li>Mude o meio de cultura a cada 48 h até o dia 13\u201215 de diferenciação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Protocolo MC para a indução de células mural vascular (Figura 1B)<ol>
<li>Substitua o meio por RPMI1640 + 10% de soro bovino fetal (FBS) no dia 3 de diferenciação.</li>
		<li>Mude o meio de cultura a cada 48 h até o dia 13\u201215 de diferenciação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Análise de colheita celular e linhagem no dia da diferenciação 13\u201215
<ol><li>Lave as células com salina tamponada de fosfato livre Ca2+ e Mg2+ (PBS).</li>
	<li>Adicione a solução de dissociação celular (contendo proteases, colagens e DNAses) no prato de cultura celular para cobrir a placa. Incubar a placa por 5 min a 37 °C.</li>
	<li>Coletar e dissociar as células com meio de cultura usando uma pipeta após a incubação.</li>
	<li>Aloque 1 x 106 células para análise de linhagem com citometria de fluxo. Para eliminar células mortas, colorir as células com corante de viabilidade fixável.</li>
	<li>Manche as células com marcadores de superfície de membrana em PBS com 5% de FBS. Use as seguintes diluições de anticorpos na fluorescência ativado tampão de coloração celular (FACS): anti-PDGFRβ (1:100), cadherina anti-VE (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).</li>
	<li>Para proteínas intracelulares, resuspenque e fixe as células com 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS.</li>
	<li>Colorir as células com isoforme anti-cardíaca de Troponina T (cTnT) em PBS com 5% de FBS e 0,75% saponina, em seguida, rotular o anticorpo cTnT com 488 mouse IgG1 (diluição 1:50).</li>
	<li>Resuspend as células manchadas em PBS com 5% de FBS e coloque-as em tubos FACS com coador celular.</li>
	<li>Analise a composição celular das células manchadas de cada protocolo de diferenciação com citometria de fluxo para facilitar a geração de suspensões celulares com distribuições de linhagem definidas. NOTA: Durante a realização deste procedimento, a suspensão restante da célula para ECTs é preservada em um refrigerador de 4 °C.</li>
</ol>3. Fabricação de molde de tecido PDMS
<ol><li>Lance uma camada de 0,5 mm de espessura e mais de 30 mm x 30 mm de polidimtilsiloxano (PDMS) misturando a solução prepolímero e transfronteiriça a uma proporção de 10:1 e depois curar a 80 °C por 3 h.</li>
	<li>Corte a folha PDMS e uni-la com adesivo de silicone para fabricar uma bandeja retangular de 21 mm x 20,5 mm com 7 mm de comprimento, 0,5 mm de largura e 2,5 mm de altura em uma posição retangular escalonada. O espaçamento horizontal do poste entre duas linhas de postes é de 2,5 mm (Figura 2B).</li>
	<li>Autoclave a bandeja a 120 °C por 20 min.</li>
	<li>Cubra a bandeja com 1% de poloxamer 407 na PBS por 1h. Enxágüe o poloxamer 407 e enxágue o molde com PBS suficientemente antes de usar.</li>
</ol>4. Construção da ECT
<ol><li>Após a análise da linhagem celular, combine as células dos protocolos CM+CE e MC para que a concentração final de MCs seja de 10 a 20% em um número celular total de seis milhões de células por construção5.</li>
	<li>Suspender seis milhões de células em meio de cultura ECT (meio essencial mínimo alfa suplementado com 10% FBS, 50 μM 2-mercaptoetanol e 100 U/mL Penicilina-Streptomycina).</li>
	<li>Preparação da solução matricial<ol>
<li>Misture 133 μL de solução de colágeno de cauda de rato solúvel ácido (2 mg/mL, pH 3) com 17 μL de 10x mínimo essencial médio (MEM). Em seguida, misture a solução com 17 μL de tampão alcalino (0,2 M NaHCO3, 0,2 M HEPES e 0,1 M NaOH). NOTA: O colágeno deve ser mantido no gelo (4 °C). Verifique a cor do tampão e se o meio não ficar rosado quando todas as soluções estiverem misturadas, adicione tampão de álcali adicional ao meio. Os passos de mistura devem ser misturar colágeno I + 10x MEM e, em seguida, adicionar tampão alcalino. NÃO mude esta ordem. NÃO gere bolhas na mistura.</li>
		<li>Adicione 67 μL de matriz de membrana de porão à solução neutralizada de colágeno. NOTA: A solução mista deve ser mantida no gelo (4 °C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular preparada contendo seis milhões de células a 1.100 rpm (240 x g) por 5 min e resuspengar as células com 167 μL de DMEM de alta glicose + 20% FBS + 1% penicilina-estreptomicina (100x).</li>
	<li>Misture a suspensão celular e a solução matricial. O volume total da mistura celular/matriz para uma construção é de 400 μL. NOTA: A mistura celular/matriz deve ser não viscosa e uma cor rosada nesta etapa. Mantenha-o no gelo, pois o gel se solidificará à temperatura ambiente. A concentração final do colágeno tipo I é de 0,67 mg/mL.</li>
	<li>Despeje a mistura celular/matriz uniformemente sobre o poloxamer 407 revestido molde de tecido PDMS, que é colocado em uma placa de cultura de seis poços12. NOTA: Despeje a mistura cuidadosamente para evitar a geração de bolhas, a fim de evitar defeitos de enchimento no gel derramado.</li>
	<li>Incubar a mistura célula/matriz em uma incubadora padrão de CO2 (37C, 5 % DE CO2) por 60 min.</li>
	<li>Depois que o tecido for formado, mergulhe o molde de tecido com 4 mL de meio de cultura ECT. NOTA: Embora a célula/matriz esteja interligada em 60 minutos, a construção ainda é muito frágil. Adicione o meio suavemente para evitar danificá-lo.</li>
	<li>Cultura do tecido por 14 dias com mudança média todos os dias.</li>
	<li>Antes da implantação da ECT, remova o ECT dos postes de carregamento suavemente usando fórceps finos esterilizados. NOTA: As dimensões finais da ECT após a remoção do molde são inferiores ao molde original. Um molde de 2,1 cm x 2,05 cm gera um ECT liberado de aproximadamente 1,5 cm x 1,5 cm. Um molde maior de 3,9 cm x 4,05 cm gera um ECT de aproximadamente 3 cm x 3 cm. ECT descarregado mostra espancamento espontâneo intrínseco em meio de cultura quente. Embora inicialmente mantenha uma estrutura de malha, uma ECT descarregada encolhe e condensa ao longo do tempo. É possível segurar o tecido suavemente com fórceps finos e, em seguida, usar sutura de seda 7-0 para anexar o ECT ao epicárdio.</li>
</ol>

<ol><li>Sanganalmath, S. K., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+for+heart+failure%3A+A+comprehensive+overview+of+experimental+and+clinical+studies%2C+current+challenges%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions.</a> Circulation Research. 113, 810-834 (2013).</li>
<li>Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-Analysis+of+Cell+Therapy+Trials+for+Patients+With+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure.</a> Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).</li>
<li>Menasché, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiac+progenitors+for+severe+heart+failure+treatment%3A+first+clinical+case+report%3A+Figure+1%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1.</a> European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).</li>
<li>Masumoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-engineered+cardiac+tissue+sheets+with+cardiomyocytes+and+vascular+cells+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration.</a> Scientific Reports. 4, 6716(2014).</li>
<li>Masumoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myocardial+regenerative+potential+of+three-dimensional+engineered+cardiac+tissues+composed+of+multiple+human+iPS+cell-derived+cardiovascular+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages.</a> Scientific Reports. 6, 29933(2016).</li>
<li>Zimmermann, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+heart+tissue+grafts+improve+systolic+and+diastolic+function+in+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts.</a> Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).</li>
<li>Fujimoto, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+fetal+cardiac+graft+preserves+its+cardiomyocyte+proliferation+within+postinfarcted+myocardium+and+sustains+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function.</a> Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).</li>
<li>Lancaster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+treatment+for+heart+failure%3A+cell-based+therapy+with+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Vessel+Plus%22%5BJournal%5D)">Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue.</a> Vessel Plus. 2019, (2019).</li>
<li>Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+hydrogel+molding+to+control+the+3D+geometry+of+bioartificial+muscle+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues.</a> Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cardiac+patch+for+advanced+functional+maturation+of+human+ESC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes.</a> Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).</li>
<li>Christoforou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+progenitors+differentiate+to+cardiomyocytes+and+form+biosynthetic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues.</a> PloS one. 8, 65963(2013).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Cell+Composition+and+Geometry+on+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Engineered+Cardiac+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue.</a> Scientific Reports. 7, 45641(2017).</li>
<li>Kowalski, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Cardiomyocyte+Alignment+from+Three-Dimensional+%283D%29+Confocal+Microscopy+of+Engineered+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue.</a> Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos financeiros ou científicos para divulgar.

Após a conclusão de nossa investigação de um formato linear, o ECT5derivado do hiPSC, adaptamos o protocolo para misturar CMs, CEs e MCs derivados de hiPSC para facilitar a expansão in vitro de células vasculares dentro dos ECTs e posterior acoplamento vascular in vivo entre ECTs e miocárdio receptor.
Para facilitar a geração de geometrias ECT de malha maiores e implantáveis, utilizamos folhas PDMS finas para projetar os moldes 3D com postes de carregamento dispostos em...

Inúmeros estudos pré-clínicos e ensaios clínicos confirmaram a eficiência das terapias regenerativas cardíacas baseadas em células para corações falhando1,,2,3. Entre vários tipos de células, as células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs) são fontes celulares promissoras em virtude de sua capacidade proliferativa, potencial para gerar várias linhagens cardiovasculares4,,5e alergenicidade. Além disso, as tecnologias de engenharia de tecidos permitiram transferir milhões de células para um coração danificado5,,6,,7,8.
Anteriormente, relatamos a geração de tecidos cardíacos tridimensionais (3D) de engenharia linear (ECTs) a partir de linhagens cardiovasculares derivadas do hiPSC usando um sistema de cultura comercialmente disponível para tecidos bioartíficos 3D5,,7. Verificou-se que a coexistência de células endoteliais vasculares e células mural com cardiomiócitos dentro da ECT facilitou a maturação estrutural e eletrofisiológica do tecido. Além disso, validamos o potencial terapêutico de hiPSC-ECTs implantados em um modelo de infarto do miocárdio de rato tolerante imunológico para melhorar a função cardíaca, regenerar o miocárdio e melhorar a angiogênese5. No entanto, os ECTs lineares construídos por este método foram cilindros de 1 mm por 10 mm e, portanto, não são adequados para a implantação em estudos pré-clínicos com animais maiores ou uso clínico.
Com base no uso bem sucedido de moldes de tecido para gerar formação de tecido poroso projetado usando míbios esqueléticos de rato e cardiomiócitos9,cardiomiócitos derivados do ESC humano10 e iPSCs11,desenvolvemos um protocolo para gerar moldes implantáveis derivados de hiPSC escaláveis usando moldes polidimetiloxano (PDMS). Avaliamos uma série de geometrias de moldes para determinar as características mais eficazes do molde. Os ECTs em forma de malha com múltiplos feixes e junções apresentaram excelentes características na viabilidade celular, função tecidual e escalabilidade em comparação com formatos de folha simples ou lineares que não tinham poros ou junções. Implantamos o ECT em forma de malha em um modelo de infarto do miocárdio de rato e confirmamos seus efeitos terapêuticos semelhantes aos ECTs cilíndricos implantados12. Aqui descrevemos o protocolo para gerar um ECT em forma de malha derivado do hiPSC.

<table><tbody><tr><td>MaterialsPlacas de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>cultura de células estilo 100x20 mm</td><td>Falcon / Thomas scientific</td><td>9380C51</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50 / CS</td><td>Falcon / Thomas scientific</td><td>6902A01</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de elastômero de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AM-105</td><td></td></tr><tr><td>BMP4, recombinante (10&micro; g)</td><td>R& D</td><td>RSD-314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno, solução tipo I de cauda de rato</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Corning</td><td></td><td>reduzido por fator de crescimento 356231</td><td></td></tr><tr><td>VEGF humano (165) IS, grau premium</td><td>Miltenyi</td><td>130-109-385</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, 0.2 &micro; m filtrado (10% Solução em Água)</td><td>Sondas Moleculares</td><td>P-6866</td><td></td></tr><tr><td>Humano recombinante bFGF</td><td>WAKO</td><td>060-04543</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Humano/Mouse/Rato ActivinA (50&micro; g)</td><td>R& D</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>rh Wnt-3a (10&micro; g)</td><td>R& D</td><td>5036-WN</td><td></td></tr><tr><td>Solução Versene</td><td>Gibco</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Meio de cultura e suplementos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11430</td><td></td></tr><tr><td>2 Mercaptro Etanol</td><td>SIGMA</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento menos insulina</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>A1895601</tr><tr><td>DMEM, alto teor de glicose</td><td>Gibco</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (500ml)</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (500ml)</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (5000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 meio Gibco</td><td></td><td>21870092</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11900024</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowcytometry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences</td><td>BD / Fisher</td><td>560380</td><td></td></tr><tr><td>anti-Troponina T, Isoforma Cardíaca Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision</td><td>Fisher</td><td>MS-295-P0</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Clean Solução</td><td>BD</td><td>340345</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSFlow Bainha Fluida</td><td>BD</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSSosolução de inse</td><td>BD</td><td>340346</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo Falcon com Tampa de Filtro de Células (Caixa de 500)</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (500ml)</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloração de células mortas Aqua fixável LIVE/DEAD, para excitação de 405 nm</td><td>Sondas moleculares</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences</td><td>BD / Fisher</td><td>558821</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47306-50G-F</td><td></td></tr><tr><td>VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences</td><td>BD / Fisher</td><td>560411</td><td></td></tr><tr><td>Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Kit de rotulagem</td><td>Sondas moleculares</td><td>Z25002</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de tecidos cardíacos projetados em forma de malha derivados de células ips humanas para reparo de miocárdio in vivo

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

O protocolo atual descreve métodos para gerar tecidos cardíacos escaláveis em forma de malha (ECTs) compostos por células cardiovasculares derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs), que são desenvolvidas para o objetivo do uso clínico. Cardiomiócitos derivados do HiPSC, células endoteliais e células mural vasculares são misturados com matriz de gel e, em seguida, despejados em um molde de tecido polidimetilsiloxano (PDMS) com postes retangulares e escalonados internos. No dia da cultura, 14 ECTs amadurecem em uma estrutura de malha de 1,5 cm x 1,5 cm com feixes de miofibra de 0,5 mm de diâmetro. Os cardiomiócitos alinham-se ao eixo longo de cada feixe e batem espontaneamente sincronizadamente. Essa abordagem pode ser dimensionada até uma malha ECT de malha maior (3,0 cm x 3,0 cm), preservando a maturação e a função do construto. Assim, os ECTs em forma de malha gerados a partir de células cardíacas derivadas do hiPSC podem ser viáveis para paradigmas de regeneração cardíaca.

A Figura 1A,B mostra os esquemas do protocolo CM+CE e MC. Depois de induzir CMs e ECs do protocolo CM+EC e MCs do protocolo MC, as células são misturadas ajustando as concentrações finais de MC para representar de 10 a 20% do total de células. O molde de tecido de 2 cm de largura é fabricado de acordo com o desenho de 0,5 mm de espessura da folha PDMS de espessura(Figura 2A,B). Seis milhões de células CM+EC+MC são combinadas com...

O presente protocolo gera tecidos cardíacos projetados em forma de malha contendo células cardiovasculares derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para permitir a investigação da terapia de implantação celular para doenças cardíacas.

Preparação de tecidos cardíacos projetados em forma de malha derivados de células iPS humanas para reparo de miocárdio in vivo

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Este protocolo descreve um método nobre e fácil para criar tecidos cardíacos projetados em forma de malha derivados de partes do corpo induzidas pelo homem e células-TRONCO derivadas de células. A flexibilidade da geometria tecidual e a escalabilidade da função tecidual preservada são as principais vantagens dessa técnica. Os ECTs de forma de malha implantados podem restaurar uma estrutura cardíaca e funcionar em um modelo de infarto do miocárdio de rato.Confirmando sua viabilidade para uso em terapia regenerativa cardíaca. Essas técnicas requerem processamento de células STEM humanas reprodutíveis e habilidades de cultura tecidual para resultados consistentes. Comece cortando uma folha PDMS curada ao tamanho adequado para permitir que a folha seja ligada com adesivo de silicone para fabricar uma bandeja retangular de 21 por 20,5 milímetros com sete milímetros de largura e 2,5 milímetros de altura em posições retangulares escalonadas.O espaçamento horizontal entre duas linhas de postes deve ser de 2,5 milímetros. Autoclave a bandeja a 120 graus Celsius por 20 minutos antes de revestir o molde com 1% Poloxamer 407 em PBS por uma hora. Em seguida, enxágue completamente o molde com PBS e coloque o molde em um poço de uma placa de seis poços.Para análise de linhagem, combine as células do cardiomiócito mais protocolos de células mural endoteliais e vasculares. De modo que a concentração final de células mural é de 10 a 20% em um número celular total de seis vezes 10 para as seis células por construção. Misture 133 microliters de ácido solúvel Rat Tail solução tipo um e 17 microliters de Tampão alcalino a 17 microliters de 10X Mínimo Essencial Médio no gelo.Em seguida, adicione 67 microliters de Basement Membrane Matrix à solução de colágeno. Em seguida, centrifugar as células e resuspensar a pelota em 167 microliters do Medium Essencial Mínimo de Alta Glicose Dulbecco complementado com soro bovino fetal e antibióticos. Misture as células na solução matricial no gelo.Em seguida, despeje cuidadosamente 400 microliters da suspensão da matriz celular no molde de tecido PDMS revestido poloxamer 407. Incubar a mistura de matriz celular em uma incubadora de cultura celular padrão a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 60 minutos. Quando o tecido for formado, mergulhe cuidadosamente o molde com quatro mililitros de cultura ECT e devolva a placa à incubadora de cultura celular por 14 dias.Antes da implantação da ECT, você esterilizasse fórceps finos para remover cuidadosamente o ECT dos postes de carregamento. Moldes de tecido podem ser fabricados com vários padrões, comprimentos postais e pós-espaçamento para gerar diferentes geometrias finais de ECT. Para esta análise, utilizou-se um molde com postes longos de sete milímetros com intervalos de 2,5 milímetros de largura.Poloxamer 407 previne a adesão das células ao molde e permite a formação de uma estrutura de malha característica, após compactação rápida de gel em 14 dias. A estrutura é mantida mesmo após a liberação da ECT do molde. A construção de tecido fabricado tem aproximadamente 1,5 centímetros de largura e 0,5 milímetros de espessura.E a largura de cada feixe na malha é de aproximadamente 0,5 milímetros em média. É possível gerar um ECT de malha de largura final de 3 centímetros contendo 24 milhões de células de um molde quatro vezes maior com o mesmo design de post escalonado. Esta malha maior ECT também pode ser facilmente removida do molde e gera um ato local de força equivalente à malha menor ECT.É importante despejar a mistura da matriz celular uniformemente no molde do tecido sem gerar bolhas para evitar sentir defeitos no gel final. Caracterização funcional do contratante. e as relações de quarta frequência podem ser realizadas usando sistemas embutidos.Nosso objetivo final é a tradução dos paradigmas da ECT em terapias clínicas que utilizam grandes estudos pré-clínicos animais.

preparation-mesh-shaped-engineered-cardiac-tissues-derived-from-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Métodos para a preparação de um gel matriz injetável a partir de tecido decelularizado e injetá-lo em rato...

Biologicamente fabricação de materiais derivados injetável para Engenharia de Tecidos do Miocárdio

A geração de alinhados tecido do miocárdio é um requisito fundamental para a adaptação dos avanços recentes em biologia de células-tronco para fins clinicamente úteis. Descrevemos aqui uma abordagem impressão microcontact para o controlo preciso da forma e função celular. Usando populações altamente purificadas de células-tronco embrionárias derivadas progenitores cardíacos, nós, então, gerar tecido funcional anisotrópica do miocárdio.

Geração de Alinhados tecido funcional do miocárdio através de impressão microcontact

Este manuscrito descreve a criação de tecidos cardíacos projetados definidos usando expressão de marcadores de superfície e classificação celular. Os tecidos definidos podem então ser usados em um biorreator multitecido para investigar os mecanismos da terapia com células cardíacas, a fim de fornecer um sistema modelo funcional, mas controlado, do coração humano.

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Apresentamos três protocolos de novos e mais eficientes para a diferenciação de células estaminais pluripotentes humanas induzida em cardiomiócitos, células endoteliais, e células do músculo liso e um método de entrega que melhora o enxerto de células transplantadas através da combinação de injecção das células com citocinas entrega mediada por remendo.

Pluripotentes Stem Cell Derivado células cardíacas para reparo do miocárdio

Este protocolo descreve um método baseado em molde líquido para criar tecidos cardíacos livre de andaime tridimensionais com integridade estrutural satisfatória e comportamento batendo síncrono.

Um método baseado em molde líquido de criação livre de andaime tridimensional de tecido cardíaco

Aqui nós apresentamos um protocolo para a indução de cryoinjury ventricular esquerdo, seguido da implantação de um patch do músculo cardíaco, derivado de células iPS humana cardiomyocytes em um modelo de cobaia.

Implantação de Patches hiPSC-derivado do músculo cardíaco após lesão miocárdica em um modelo de cobaia

Aqui, descrevemos uma metodologia fácil de usar para gerar matrizes microtissue cardíacas auto-montadas em 3D compostas de cardiomiócitos pluripotentes pluripotentes induzidos pelo homem, cardiomiócitos, fibroblastos cardíacos e células endoteliais. Esta técnica de necessidade de células fáceis de usar e baixas para gerar microtissues cardíacas pode ser implementada para modelagem de doenças e estágios iniciais do desenvolvimento de medicamentos.

Fabricação de matrizes microtissue cardíacas 3D usando Cardiomiócitos derivados do iPSC humano, fibroblastos cardíacos e células endoteliais

O objetivo deste protocolo é explicar e demonstrar o desenvolvimento de um modelo microfluido tridimensional (3D) de tecido cardíaco humano altamente alinhado, composto por cardiomiócitos derivados de células-tronco co-cultivados com fibroblastos cardíacos (CFs) dentro de um hidrogel biomimético, à base de colágeno, para aplicações em engenharia de tecido cardíaco, triagem de medicamentos e modelagem de doenças.

Desenvolvimento de tecido cardíaco humano organizado 3D dentro de uma plataforma microfluida

Apresenta-se aqui um conjunto de protocolos para a geração e criopreservação de esferoides cardíacos (CSs) de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos cultivados em um formato multidimensional de alto rendimento. Esse modelo tridimensional funciona como uma plataforma robusta para modelagem de doenças, rastreios de alto rendimento e mantém sua funcionalidade após a criopreservação.

Geração, Triagem de Alto Rendimento e Biobanco de Esferoides Cardíacos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Humanos.

O uso da luz para controlar células e tecidos cardíacos permite a estimulação sem contato, preservando assim o estado natural e a função das células, tornando-se uma abordagem valiosa tanto para pesquisa básica quanto para aplicações terapêuticas.

Um sistema microfisiológico cardíaco para estudar a propagação de Ca2+ via estimulação óptica não genética

Um método reprodutível é apresentado para gerar tecidos miocárdicos 3D combinando scaffolds de escrita eletrospinning (MEW), policaprolactona (PCL) e hidrogéis de fibrina com cardiomiócitos e fibroblastos derivados de hiPSC. Essa técnica oferece controle preciso sobre a arquitetura do andaime e pode ser aplicada em testes pré-clínicos de medicamentos e modelagem de doenças cardíacas.

Geração de tecido miocárdico humano 3D usando escrita eletrogiratória por fusão de andaimes de policaprolactona e células cardíacas derivadas de hiPSC

Aprenda a criar tecidos cardíacos em malha derivados de células iPS humanas para engenharia de tecidos cardíacos. Este método demonstra viabilidade na restauração da função cardíaca em modelo de infarto do miocárdio em ratos.

Preparação de tecidos cardíacos projetados em forma de malha derivados de células iPS humanas para reparo de miocárdio in vivo

Explorar mais vídeos