Name: Extração rápida e econômica do RNA do tecido pancreático de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda a extrair RNA de tecido pancreático de rato com um método rápido, econômico e eficiente. Esta técnica garante alta pureza e integridade do RNA para ensaios biológicos confiáveis.

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O presente estudo foi apoiado financeiramente pela Universidade shiraz de ciências médicas (Grant No. 93-01-01-7178\03-07-2014). Agradecemos ao Sr. Zomorodian e ao Sr. Rostami no Departamento de e-Learning em Ciências Médicas, Escola Virtual e Centro de Excelência em e-Learning, Universidade shiraz de Ciências Médicas por editar o vídeo.

A aprovação ética para este estudo foi obtida pela Universidade de Ciências Médicas de Shiraz (número de aprovação: 93-01-01-7178\03-07-2014).
NOTA: Use ratos machos Sprague-Dawley pesando 250 g. Coloque o frasco contendo uma lasca de tecido pancreático imerso no reagente estabilizador de RNA em um tanque de nitrogênio líquido a -80 °C e use a solução de reagente de extração de RNA para manter a integridade do RNA.
1. Remoção do tecido pancreático de rato
<ol><li>Prepare a sala de cirurgia e coloque todos os materiais necessários sob o capô.</li>
	<li>Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos (Fórceps de curativo, fórceps brown-adson, tesoura Iris e tesoura Littler) em forno por pelo menos 4 h a 240 °C para inativar RNases15. Esterilize a superfície do local cirúrgico com 70% de álcool sob o capô.</li>
	<li>Injete cetamina/xilazina intraperitonealmente usando uma seringa de insulina [80/8 mg/kg]. Verifique a profundidade da anestesia beliscando os dedos dos dedos do rato por falta de resposta.</li>
	<li>Adicione 1 mL de reagente de estabilização de RNA no microtubo adequado (2 mL) para inibir a ativação de endonucleases em tecidos excisados.</li>
	<li>Coloque imediatamente o rato na placa cirúrgica (cabeça longe do cirurgião) para uma incisão de linha média.</li>
	<li>Esterilize toda a superfície abdominal com 70% de álcool e remova o cabelo de rato usando um cortador de cabelo com lâminas #40.</li>
	<li>Faça uma incisão em forma de V para abrir o abdômen da área púbica para as pernas dianteiras com fórceps de curativo, fórceps Brown-Adson, tesoura Iris e tesoura Littler.</li>
	<li>Vire os órgãos abdominais para o lado esquerdo para expor o pâncreas. Encontre cuidadosamente o tecido pancreático, que se espalha na cavidade abdominal. Localize a área sob o baço para encontrar o pâncreas sem ser confundido com o tecido adiposo.</li>
	<li>Remova imediatamente 20-30 mg de pâncreas da cavidade abdominal em menos de 2 minutos. Coloque o tecido removido no microtubo de 2 mL rapidamente e corte-o com um cortador estéril para penetrar os tecidos separados com reagente de estabilização de RNA.</li>
	<li>Coloque o microtubo em um tanque de nitrogênio para congelar imediatamente. Mantenha o microtubo em um congelador de -80 °C por 24 h16.</li>
	<li>Depois das 24h, transfira os pequenos pedaços de tecidos pancreáticos para um recipiente de gelo.</li>
	<li>Injete cloreto de potássio (KCl) intracardialmente para eutanásia de ratos após a cirurgia.</li>
</ol>2. Extração de RNA
<ol><li>Esterilize a superfície sob o capô com 70% de álcool.</li>
	<li>Coloque 1 mL do reagente de extração de RNA, que contém tiocianato de guanidinium para inibir rnase, no microtubo estéril.</li>
	<li>Transfira o tecido pancreático separado para o microtubo. Transfira o microtubo para o nitrogênio líquido para congelar imediatamente.</li>
	<li>Homogeneize o tecido com o sônico da sonda de micro ponta a 4 °C definido para o nível 20 para 60 s ligado e 5 s desligado.</li>
	<li>Incubar cada amostra homogeneizada por 5 min a 4 °C usando gelo esmagado para permitir que os complexos de nucleoproteína sejam completamente dissociados.</li>
	<li>Enriqueça as amostras com 0,2 mL de clorofórmio para cada 1 mL de reagente de extração de RNA. Tampe o tubo com firmeza e agite-o com força para 15 s.</li>
	<li>Incubar o tubo por 15 minutos no gelo esmagado (4 °C) para separar o reagente em três fases.</li>
	<li>Execute a centrífuga a 12.000 x g por 15 min a +2 a +8 °C. Transfira a fase aquosa incolor para um novo microtubo.</li>
	<li>Adicione 0,5 mL de isopropanol de 100% à fase aquosa. Feche o tubo e, em seguida, inverta-o pelo menos 3 vezes para misturar bem o RNA.</li>
	<li>Incubar a amostra por 5-10 min em uma caixa fria (4 °C) para permitir a precipitação do RNA.</li>
	<li>Execute a centrífuga a 12.000 x g por 15 min a +2 a +8 °C. Descarte o supernaspeso.</li>
	<li>Enriqueça cada um dos tubos de centrífuga com 1 mL de 75% de etanol.</li>
	<li>Lave a pelota de RNA invertendo o tubo pelo menos 3 vezes.</li>
	<li>Execute a centrífuga a 7.500 x g a +2 a +8 °C por 5 min. Descarte o supernatante para remover o excesso de etanol da pelota de RNA por secagem a ar.</li>
	<li>Suspenda a pelota de RNA em água livre de dietilpirocarbonato (DEPC) tratada com RNase.</li>
	<li>Passe a solução através de uma ponta de pipeta várias vezes para dissolver a pelota de RNA. Em seguida, incubar a solução por 10-15 min a +65 °C.</li>
</ol>3. Avaliação da Integridade do RNA com eletroforese de desnaturação
<ol><li>Prepare o tampão de corrida de gel: 50 mM NaAc (tratado DEPC) e 0,5 M EDTA (pH 8.0) em H2O tratado por DEPC.</li>
	<li>Prepare 5x tampão de gel de formaldeído (tampão de execução MOPS): 0,1 M MOPS (pH 7.0), 40 mM NaAc, 5 mM EDTA (pH 8.0).<ol>
<li>Dissolver 20,6 g de MOPS em 800 mL de DEPC tratado 50 mM de acetato de sódio. Ajuste o pH para 7.0 com 2 N NaOH. Adicione 10 mL de EDTA tratado de DEPC 0,5 M (pH 8.0). Ajuste o volume da solução para 1 L com água tratada com DEPC.</li>
		<li>Filtre a solução através de um filtro de 0,2 μm e mantenha-a a temperatura ambiente longe da luz por causa da esterilização. O buffer fica amarelo com o tempo se for exposto à luz ou for autoclavado. Um tampão cor de palha funciona bem, mas os mais escuros não17.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare um gel de 1,5% agarose18. Para 50 mL, adicione 0,75 g de agarose e 31 mL de H2O. Micro-ondas a solução no micro-ondas por 1 min. Adicione 9 mL de formaldeído e 10 mL de buffer de execução MOPS de 5x.</li>
	<li>Prepare as amostras para o gel. Misture o seguinte em um tubo de microfuça estéril: X rna μL (até 30 μg) 2 μL de tampão de carregamento de gel de 5x 10 μL de formamida 4 μL de buffer de execução MOPS 1 μL de 0,1 mg/mL EtBr 3 μL de formaldeído 5-x μL de DEPC-H2O</li>
	<li>Incubar as amostras a 65 °C por 15 minutos e resfriá-las no gelo. Centrífuga por 5 s até que todo o fluido seja depositado.</li>
	<li>Pré-execute o gel a 5 V/cm por 5 minutos.</li>
	<li>Carregue as amostras nas pistas do gel imediatamente e, em seguida, submerse o gel em 1x tampão de gel de gel formaldeído. Executar em 3-4 V/cm19.</li>
</ol>

<ol><li>McCarthy, B., Hoyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+of+DNA+and+diversity+of+messenger+RNA+molecules+in+normal+mouse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).</li>
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</ol>

Nenhum declarado.

Na biologia molecular é vital obter RNA de alta qualidade. A presença das enzimas ribonuclease em células e tecidos rapidamente degrada o RNA e torna o complexo de extração. RNases são enzimas estáveis funcionando sem quaisquer cofatores. Pequenas quantidades de RNase são adequadas para destruir o RNA. Quando o tecido pancreático de rato é removido da cavidade abdominal, é necessário desinfetar os instrumentos cirúrgicos por detergentes fortes, enxaguar-os completamente e colocá-los em um forno por pelo menos 4 h a 240 °...

Dados genéticos estruturais podem ser transcritos para um produto funcional através da expressão genética. A análise de RNA é usada para descobrir diferenças na expressão genética em diferentes condições. Existem uma série de métodos para extrair ácidos nucleicos da seguinte forma: tiocianato de guanidinium, extração via fenol-clorofórmio, cromatografia à base de celulose, extração por matrizes de sílica e troca deânion 1,,2.
A detecção adequada da expressão genética é influenciada pela integridade do RNA isolado dos tecidos; portanto, é vital avaliar a integridade do RNA isolado dos tecidos antes que novos testes sejam realizados, pois testes moleculares complementares em RNA de baixa qualidade podem comprometer os resultados da aplicação diagnóstica. Assim, o RNA de alta integridade é necessário para testes biológicos moleculares com diferentes aplicações diagnósticas: RT-PCR quantitativo, micro arrays, ensaio de proteção à ribonuclease, análise de manchas do norte, mapeamento de RNA e construção de biblioteca cDNA3,,4.
O RNA torna-se bastante instável depois de ser mantido por muito tempo. Fragmentos longos de mRNA acima de 10 kb são particularmente suscetíveis à degradação5,6. Assim, os pesquisadores devem considerar vários fatores que influenciam a integridade do RNA purificado. A pureza do RNA deve ser protegida contra RNases, proteínas, DNA genômico e contaminação inibidora enzimática. Além disso, a melhor e aceitável razão de absorção de RNA para UV (260/280) deve estar dentro da faixa de 1,8-2.0 com fragmentação mínima sobre a eletroforese. Técnicas laboratoriais recentemente desenvolvidas permitiram aos cientistas avaliar a integridade da amostra de análise molecular mais praticamente7,,8.
É muito mais difícil extrair RNA não danificado do tecido pancreático do que outros tipos de tecidos devido à alta quantidade de ribonucleases (RNases). Entretanto, os métodos de extração existentes, ou seja, a rápida ejeção do tecido pancreático da cavidade abdominal e a homogeneização a baixas temperaturas para impedir as RNases, provaram-se ineficazes7,,8,,9,,10,,11,,12,,13,14.
O objetivo do presente estudo experimental comparativo é modificar e comparar os métodos existentes para determinar os métodos mais eficientes. Para isso, vários protocolos de extração de RNA foram modificados e comparados. O objetivo foi especificamente determinar o método mais barato que exige uma quantidade mínima de tecido pancreático.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Merck</td><td>116801</td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>Atoclave</td><td>Teb Zaim</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Irã Centrífuga</td><td>Sigma</td><td></td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Merck</td><td>107024</td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>Água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC)</td><td>Sigma</td><td></td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>sigma</td><td>60-00-4</td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>Tanque de eletroforese</td><td>Payapajoohesh</td><td></td><td>Irã</td></tr><tr><td>Eppendorf microTube</td><td>Extragene</td><td></td><td>Taiwan</td></tr><tr><td>EtBr</td><td>sigma</td><td>E 8751</td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>81870</td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>Falcon Tube</td><td>Extragene</td><td></td><td>Taiwan</td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Merck</td><td>344198</td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Merck</td><td>344206</td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>Homogeneizador-sunicador</td><td>Microson XL 2000</td><td></td><td>EUA</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>sigma</td><td>19516</td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>Cloridrato de cetamina</td><td>sigma</td><td>1867-66-9</td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>Laminar Flow Hood</td><td>Jal Tajhiz</td><td></td><td>Irã</td></tr><tr><td>Agitador Mgnetic</td><td>Labrotechnik</td><td></td><td>EUA</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>Pontas de micropipeta</td><td>Extragene</td><td></td><td>Taiwan</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>sigma</td><td>85022106</td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>Na AC</td><td>Merck</td><td>567422</td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>109137</td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>Forno</td><td>Teb Zaim</td><td></td><td>Irã</td></tr><tr><td>Medidor</td> <td>de PHKnick</td><td></td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>RNA Later/reagente de estabilização de RNA</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td>EUA</td></tr><tr><td>Instrumento cirúrgico</td><td>Agn Thos</td><td></td><td>Seringas de fabricação alemã</td></tr><tr><td></td><td>AvaPezeshk</td><td></td><td>Irã</td></tr><tr><td>Reagente TriPure/reagente de extração de RNA</td><td>Roche</td><td>11667157001</td><td>EUA</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Labinco</td><td></td><td>Holanda</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Memmert</td><td></td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>zylazine</td><td>sigma</td><td>7361-61-7</td><td>Alemanha</td></tr></tbody></table>

extração rápida e econômica do rna do tecido pancreático de rato

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Independentemente do método de extração, a extração otimizada de RNA de tecidos e linhas celulares é realizada em quatro estágios: 1) homogeneização, 2) desnaturação efetiva de proteínas de RNA, 3) inativação de ribonuclease e 4) remoção da contaminação do DNA, proteínas e carboidratos. No entanto, é muito trabalhoso manter a integridade do RNA quando há altos níveis de RNase no tecido. A autolise espontânea torna muito difícil extrair RNA do tecido pancreático sem danificá-lo. Assim, é necessário um método prático de extração de RNA para manter a integridade dos tecidos pancreáticos durante o processo de extração. Um estudo experimental e comparativo dos protocolos existentes foi realizado obtendo 20-30 mg de tecidos pancreáticos de ratos em menos de 2 minutos e extraindo o RNA. Os resultados foram avaliados por eletroforese. Os experimentos foram realizados três vezes para generalização dos resultados. A imersão do tecido pancreático no reagente de estabilização de RNA a -80 °C por 24 h rendeu RNA de alta integridade, quando o reagente de extração de RNA foi usado como reagente. Os resultados obtidos foram comparáveis aos resultados obtidos a partir de kits comerciais com as vinculações da coluna spin.

Avaliação da integridade do RNA no reagente de extração de RNA de acordo com um protocolo cirúrgico de rotina e modificado sem reagente estabilizador de RNA Bandas inaceitáveis foram observadas após a extração do RNA com o reagente de extração de RNA a partir de um protocolo cirúrgico de rotina. A faixa 1 mostra RNA do fígado como controle. A faixa 2 mostra o estado degradado das bandas de rRNA 28S/18S no total de RNA obtido a partir de um protocolo cirúrgico de rotina. Quando a quantidade de tecido p...

A pureza e integridade do RNA isolado é um passo vital nos ensaios dependentes do RNA. Aqui, apresentamos um método prático, rápido e barato para extrair RNA de uma pequena quantidade de tecido pancreático não danificado.

Extração rápida e econômica do RNA do tecido pancreático de rato

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Olá a todos. Nós projetamos, um método descritivo simples e rápido na classe para a extração eficiente de RNA a partir de tecido pancreático. A principal vantagem deste método é um procedimento otimizado para extrair RNA da quantidade mínima de tecido devido à autolise. Oi de novo. A demonstração do procedimento será feita por Sanaz Dastghaib, que é meu aluno de DOUTORADO em nosso laboratório no Departamento de Bioquímica da Universidade de Ciências Médicas shiraz.Primeiro prepare o local da cirurgia, coloque todos os requisitos sob o capô. Para inativar RNase estérilize todos os instrumentos cirúrgicos em um forno. Injete cetamina-xilazina intraperitoneal 80/8 miligramas por quilograma. Adicione 1 reagente de estabilização cc.RNA no microtubo adequado para habitar a ativação da endonuclease nos tecidos existentes. Coloque imediatamente o rato no quadro cirúrgico. Afaste o cirurgião para uma incisão no meio da linha. Em seguida, esterilize toda a superfície abdominal com 70% de álcool para remover o cabelo de rato. Corte a pele para a cirurgia. A correção remodelou a incisão para abrir o abdômen da área púbica para as pernas dianteiras. Vire os órgãos abdominais para o lado esquerd

rapid-and-cost-effective-rna-extraction-of-rat-pancreatic-tissue

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Microdissecção a laser é uma técnica que permite a recuperação de células selecionadas a partir de pequenas quantidades de parênquima. Aqui descrevemos um protocolo de aquisição ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos para serem utilizados para estudos de transcriptomic. Nosso protocolo melhora a autofluorescência intrínseca das células beta humanas, facilitando assim a sua coleção.

Protocolo melhorado para microdissecção a laser de ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos

Relatamos um procedimento para isolar RNA com alta integridade do pâncreas de camundongo rico em ribonuclease.

Isolamento de RNA Rato Pâncreas: Um tecido rico em Ribonuclease

desafios críticos para o campo de pesquisa do diabetes estão a compreender os mecanismos moleculares que regulam a replicação de células β dos ilhéus e desenvolver métodos para estimular a regeneração de células-β. Aqui um método de alto teor de rastreio para identificar e avaliar a actividade de promoção da replicação de células β de moléculas pequenas é apresentada.

A-alta conteúdo<em&gt; In Vitro</em&gt; Replicação plataforma de descoberta de células-β das ilhotas pancreáticas

Aqui apresentamos um protocolo para a detecção da expressão de microRNA na membrana peritoneal de ratos utilizando uma reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa em tempo real quantitativa. Este método é adequado para estudar o perfil de expressão de microARN na membrana peritoneal de ratos em várias condições patológicas.

Detecção da expressão de microRNA na Membrana Peritoneal de Ratos Usando PCR Quantitativa em Tempo Real

Este protocolo da isolação da ilhotas descreveu uma rota nova da injeção do colagenase para digerir o tecido exócrina e um procedimento simplificado do inclinação para purificar os ilhotas dos ratos. Envolve a digestão enzimática, separação de gradiente/purificação, e Islet mão-picking. O isolamento bem-sucedido pode produzir 250 – 350 de alta qualidade e ilhotas totalmente funcionais por mouse.

Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar insulina expressando 3D pancreatoids murino de progenitores pancreático flutuantes e10.5 dissociada e a mesênquima associada.

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

Nós descrevemos um método para o isolamento de células endócrinas de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal, seguidos por sequenciação do ARN de célula única. Esse método permite que as análises do desenvolvimento de linhagem endócrina do pâncreas, heterogeneidade e transcriptomic dinâmica de células.

Análises de célula única Transcriptomic de células endócrinas no pâncreas de rato

As células metaplásicas pancreáticas são precursoras de células malignas que dão origem a tumores pancreáticos. No entanto, isolar células pancreáticas viáveis intactas é um desafio. Apresentamos aqui um método eficiente para dissociação do tecido pancreático. As células podem então ser usadas para sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) ou para co-cultivo bidimensional ou tridimensional.

Dissecção do tecido pancreático para isolar células únicas viáveis

Este estudo desenvolveu um método simplificado para extrair eficientemente ilhéus primários funcionais e células acinares do pâncreas do camundongo, oferecendo uma ferramenta valiosa para estudar a comunicação intercelular na patogênese do Diabetes Induzido por Pancreatite Aguda.

Um método simples e rápido para isolamento simultâneo de ilhotas primárias e células acinares pancreáticas primárias de camundongos

Este protocolo descreve um método padronizado para colheita cirúrgica, digestão enzimática e purificação por gradiente de densidade de ilhéus pancreáticos de rato Lewis, permitindo preparações de alto rendimento e alta pureza para uso direto em transplantes ou estudos in vitro .

Isolamento e purificação de ilhotas pancreáticas a partir de ratos Lewis usando digestão enzimática e separação por gradiente de densidade

Aprenda a extrair RNA de tecido pancreático de rato com um método rápido, econômico e eficiente. Esta técnica garante alta pureza e integridade do RNA para ensaios biológicos confiáveis.

Extração rápida e econômica do RNA do tecido pancreático de rato

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