Especificação progenitora hepática de células-tronco pluripotentes usando um sistema de diferenciação definido

Este protocolo fornece um sistema de diferenciação hepática derivado de células-tronco que oferece uma ferramenta reprodutível para estudar a biologia do fígado para pesquisa básica e clínica. Ao combinar um protocolo padronizado e fácil de seguir com reagentes de cultura prontos para uso, este sistema permite a produção de progenitores hepáticos e células semelhantes a hepatócitos em larga escala. Manter células pluripotentes humanas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em um prato de 10 centímetros com laminina-531, alimentando-as diariamente com 10 mililitros de meio de manutenção de células-tronco por prato.

Para preparar placas de laminina 521, dilua a laminina 521 descongelada em DPBS gelada com cálcio e magnésio até uma concentração final de oito microgramas por mililitro. Adicione 250 microlitros da solução de laminina a cada poço de placa de 24 poços ou 50 microlitros a cada poço de uma placa de 96 poços. Balance suavemente a placa de um lado para o outro para revestir uniformemente os poços, em seguida, sele as placas com um filme flexível semitransparente e armazene-as a quatro graus Celsius durante a noite.

No dia da semeadura celular, aqueça as placas pré-revestidas em uma incubadora de cultura de células por 30 a 60 minutos. Aspire a solução de laminina 521 e adicione meio de manutenção de células-tronco suplementado com inibidor de ROCK 10 micromolar a cada poço e, em seguida, retorne a placa à incubadora. Quando a fluência da contagem de células atingir 70 a 80%, aspire o meio gasto da placa de cultura e lave cada placa de cultura com cinco mililitros de DPBS sem cálcio ou magnésio à temperatura ambiente.

Aspire a lavagem da DPBS da placa de cultura, adicione cinco mililitros de reagente de dissociação livre de enzimas à placa e incube a placa a 37 graus Celsius por oito a 10 minutos até que as células se desprendam visivelmente da placa. Separe suavemente as células da placa de cultura com um raspador de células e, em seguida, pipete o conteúdo de cada poço para cima e para baixo com uma pipeta sorológica de cinco mililitros para obter uma única suspensão de células. Para cada linha celular, agrupe as células de todos os poços de manutenção em um tubo estéril de 50 mililitros.

Lave cada placa de cultura vazia com cinco mililitros desses meios de manutenção de células-tronco e adicione as lavagens ao tubo correspondente com as células agrupadas. Execute três contagens de células viáveis em cada amostra agrupada. Centrifugar as amostras agrupadas a 250 x g durante cinco minutos.

Em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em um a três mililitros de temperatura ambiente como meio de manutenção de células-tronco suplementado com inibidor de ROCK 10 micromolar Y27632. Depois de calcular o número necessário de células necessárias para atingir a densidade de semeadura desejada, ressuspenda as células até a concentração apropriada e distribua-as nas placas pré-revestidas. O volume total por poço deve ser de um mililitro para uma placa de 24 poços e 0,1 mililitro para uma placa de 96 poços.

Balance suavemente as placas de um lado para o outro e para frente e para trás para garantir uma dispersão uniforme das células e coloque as placas semeadas na incubadora, balançando-as para frente e para trás e de um lado para o outro. Prepare o meio para a indução definitiva do endoderme e para a subsequente diferenciação da especificação das células progenitoras hepáticas, conforme descrito no manuscrito do texto. No primeiro dia da diferenciação, remova o meio gasto dos poços e substitua-o pelo meio estágio um.

Nos dias dois, três e quatro, remova o meio gasto e alimente cada um bem com o meio estágio um dois. No quinto dia, fixe os poços destinados à análise definitiva da diferenciação da endoderme. Para os poços restantes, remova o meio gasto e alimente cada poço com meio progenitor hepático do caule.

No dia 10, colha células para análise de diferenciação de progenitores hepáticos ou prossiga com a diferenciação celular semelhante a hepatócitos. Para caracterizar as culturas de diferenciação do progenitor hepático, use imunocoloração para detectar a expressão de marcadores específicos do endoderma definitivo no quinto dia e marcadores específicos do progenitor hepático no dia 10 e quantificar a porcentagem de células alfa positivas para HNF4. No dia 10, meça também a alfafetoproteína e a secreção de albumina via ELISA.

Este protocolo foi usado para diferenciar células progenitoras hepáticas de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas humanas. No quinto dia do protocolo de diferenciação, a especificação definitiva do endoderme foi avaliada via expressão de Sox 17. Em ambas as linhagens celulares, Sox 17 foi altamente expresso com 80 e 87,8% de células positivas para Sox 17 para H9 e P106, respectivamente.

No dia 10, os progenitores hepáticos exibiram uma morfologia semelhante à de paralelepípedos. Além disso, a especificação do progenitor hepático foi avaliada quanto à expressão de HNF4 alfa, AFP, albumina e citoqueratina 19. Ambas as culturas progenitoras hepáticas expressaram marcadores hepáticos fetais, como HNF4 alfa, AFP e CK 19.

A secreção de alfa-fetoproteína foi detectada no dia 10 em ambas as linhagens celulares, enquanto a secreção de albumina não foi detectada com ELISA. A variabilidade do número de células e a eficiência de diferenciação do progenitor hepático foram avaliadas quantificando a expressão alfa de HNF4. No dia 10, os progenitores hepáticos não mostraram variabilidade significativa entre as fileiras com mais de 95 e 97% das células alfa positivas para HNF4 por poço para H9 e P106, respectivamente.

Uma distribuição celular uniforme antes do início da diferenciação é fundamental para garantir uma população homogênea de células progenitoras hepáticas. Para conseguir isso, balance suavemente as placas de um lado para o outro e para frente e para trás para garantir uma dispersão celular uniforme. As células progenitoras hepáticas produzidas por este protocolo podem ser ainda mais diferenciadas em células semelhantes a hepatócitos para outros ensaios, oferecendo uma ferramenta reprodutível e padronizada para modelagem de doenças ou triagem de drogas.