Name: Tela genética avançada usando aequorin repórter de cálcio transgênico para identificar novos alvos na sinalização de cálcio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprenda a realizar triagem genética direta em Arabidopsis usando aequorina como repórter de cálcio para identificar novos genes envolvidos na sinalização de cálcio em plantas.

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Agradecemos ao Instituto Nacional de Pesquisa de Genomas Vegetais - Instalação Fitotrona pelo crescimento da planta, Bombaim Locale pela filmagem, e pelo Departamento de Biotecnologia- Consórcio ELibrary por fornecer acesso aos recursos eletrônicos. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Biotecnologia da Índia através do Programa de Núcleo de Pesquisa de Genomas Vegetais do Instituto Nacional de Plantas, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group; e CSIR-Junior Research Fellowship (para D.M e S.M) e Departamento de Biotecnologia-Junior Research Fellowship (para R.P).

1. Mutagênese EMS e coleção única de sementes baseadas em pedigree (1-3 meses)
<ol><li>Pesar 150 mg de sementes (~7500) de aequorina para mutagênese EMS (sementes M0). Pese mais 150 mg de sementes para serem usadas como controle.</li>
	<li>Transfira as sementes para um tubo de 50 mL e adicione 25 mL de 0,2% EMS (v/v) (ATENÇÃO) (para tratamento) ou 25 mL de água autoclavada (para controle). NOTA: O sulfonato de metano é um agente químico para mutagenizar o material vegetal.</li>
	<li>Sele o tubo com parafilm e enrole-o em papel alumínio. Gire o tubo de ponta a ponta por 18 h em temperatura ambiente.</li>
	<li>Deixe as sementes se instalarem. Remova cuidadosamente a solução EMS e descarte em um recipiente de resíduos contendo 1 M NaOH em volumes iguais (o NaOH ajuda a neutralizar/inativar o EMS tornando-o seguro para descartar). Descarte o plástico usado em uma solução NaOH de 1 M. NOTA: Após 24 horas, descarte os descartes de acordo com as práticas laboratoriais de materiais perigosos.</li>
	<li>Lave bem as sementes mutagenizadas com 40 mL de água autoclavada pelo menos 8 vezes. Descarte o EMS contendo água em um recipiente de resíduos NaOH como mencionado acima.</li>
	<li>Para a lavagem final, adicione 40 mL de tiossulfito de sódio de 100 mM e enxágue 3 vezes para remover traços de EMS.</li>
	<li>Mergulhe as sementes em 40 mL de água autoclavada por ~1h para difundir o EMS das sementes e, em seguida, coloque-as no papel do filtro até secar completamente.</li>
	<li>Transfira as sementes para um tubo de microcentrífuga e estratifice as sementes a 4 °C em 40 mL de água autoclavada por 2-4 dias. Isso ajuda a quebrar a dormência das sementes e garante um crescimento homogêneo.</li>
	<li>Transfira tanto as sementes mutagenizadas (M0) quanto as sementes de controle para o solo (composição do solo: agropet: soilrite, 1:1) e transfira-as para salas de crescimento com um fotoperíodo escuro de 16h/8h, uma intensidade leve de 150 μmol∙m−2∙s−1 e ~70% de umidade relativa.</li>
	<li>Para determinar se a mutagênese foi bem sucedida, procure a redução da velocidade de germinação e o crescimento das mudas, e o setor de clorofila18 (Figura 1A). Compare as plantas mutagenizadas com as plantas de controle para identificar essas diferenças fisiológicas e de desenvolvimento. NOTA: Diferentes métodos podem ser usados para a colheita de sementes de plantas M1. Neste protocolo, usamos o método único de coleta de sementes baseado em pedigree. Cada planta M1 recebe um número único, começando de A1 a A3500.</li>
	<li>Manter plantas numeradas individualmente como linhas de plantas discretas(Figura 1B).</li>
	<li>Após a maturação, colhem sementes dessas plantas mutantes individuais e armazenam como linhas individuais de M1 (Figura 2). A partir da única coleção de sementes baseadas em pedigree, obtivemos cerca de 5000 linhas M1 das quais 3500 M1 foram rastreadas.</li>
</ol>2. Triagem de alto rendimento para selecionar mutantes (8 meses)
<ol><li>Identifique novos mutantes com base na resposta ca2+ a um estímulo selecionado. Aqui, usamos H2O2 como exemplo.</li>
	<li>Para identificar mutantes, tela a geração M2. Uma vez que os mutantes recessivos segregam-se em 1/8 de frequência na geração M2 sobre a mutagênese EMS14, a triagem de 8-12 M2-segregando plantas cobre uma linha M1 e identifica um mutante recessivo homozigoso (usando 12 mudas aumenta a probabilidade de encontrar um mutante). De cada linha Independente M1, teste 12 M2 mudas para resposta Ca2+ para H2O2 (12 M2 mudas por linha M1).</li>
	<li>Use um protocolo de esterilização de sementes de alto rendimento e protocolo de crescimento de plantas hidropônicas19. Coloque quase 12-15 M2 sementes por linha M1 em poços individuais de uma placa de cultura tecidual de 24 poços e estérilize usando gás cloro (40 mL de hipoclorito de sódio de 12% e ácido clorídrico, 3:1, v/v) em um desiccator por 4h em um capô de fumaça. Após o procedimento, abra o desiccador e deixe durante a noite para que o gás cloro evapore.</li>
	<li>Após a esterilização, leve as placas para fora e adicione mídia líquida de 1/2 MS (MS sem ágar) a poços individuais. Sele as placas com parafilm e estratifice as sementes por 2-4 dias a 4 °C e depois mova as sementes para uma câmara de crescimento com 10h de luz/ 14h de fotoperíodo escuro a 20-22 °C com 70% de umidade relativa.</li>
	<li>Uma vez que as mudas têm 8-12 dias de idade, coloque 12 M2 mudas de cada linha individualmente em uma placa de 96 poços de luminômetro. Para medir a resposta ca2+ para H2O2,use um leitor de placas de luminômetro.</li>
	<li>Após a transferência de mudas, adicione 150 μL de solução de coelentrazina de 5-10 μM (diluída em água autoclavada a partir de um estoque de 5 mM em metanol) (CUIDADO) em poços individuais em uma área escura/baixa luz e armazenar no escuro a 21 °C por 8h. NOTA: Coelentrazina é um grupo protético que se liga à apo-aequorina e a reconstitui à aequorina funcional. A coelentrazina é sensível à luz e, portanto, é armazenada em garrafas de cor escura, protegidas da luz.</li>
	<li>No dia seguinte, realize a tela mutante usando 10 mM H2O2 como estímulo e meça a resposta ca2+ subsequente.</li>
	<li>Para medição simultânea de 24 poços, crie um programa cinético automatizado que mede o fundo por 1 min, seguido de adição de estímulos (40 μL) e medição de 10 min, seguido de descarga total de aequorina (2 M CaCl2 em 150 μL 20% etanol) por 1-2 min. NOTA: É necessária uma descarga final para a aequorina total para quantificar o Ca2+ medido e como controle adicional para a aequorina funcional. A descarga final é de um curto prazo de 1-2 min e não causa morte significativa da planta. Alternativamente, se as plantas morrerem após a etapa de descarga, então re-tela a linha M1 específica e resgate sem descarga. Tais mutantes podem ser confirmados nas gerações M3 e M4 usando a etapa de descarga.</li>
	<li>Use um método de digitalização de formato de 24 poços que mede cada linha em intervalo de 7 s com tempo de integração de 300 ms por poço por ponto de medição. Use uma muda tipo selvagem como controle em cada linha para comparação e avaliação do mutante. NOTA: Uma única placa de 96 poços contendo mudas M2 cobrirá 8 linhas individuais M1 (8 M1*12= 96 M2) e poderá ser examinada em 2,5 h e a cada dia 32 linhas M1 seriam rastreadas, 640 M1 plantas por mês. Todo o procedimento de triagem após as plantas estarem prontas levaria cerca de 8 meses.</li>
	<li>Identificar mutantes com base na perda ou redução da resposta Ca2+ com H2O2. Resgate os mutantes selecionados através de um processo de lavagem à base de antibióticos. Lave a muda com solução de cefotaxime de 25 mg/L duas vezes e depois transfira para o meio de resgate que contém 25 mg/L cefotaxime em 1/2 MS ágar.</li>
	<li>Plante as placas a um fotoperíodo escuro de 10h/ 14h para obter uma planta mutante. A lavagem do cefotaxime ajuda a remover quaisquer microrganismos prejudiciais na muda. Uma vez que as mudas após a reconstituição são mantidas não seladas, minimize a contaminação ao transferir de volta para condição estéril.</li>
	<li>Transfira a planta mutante para o solo para obter a população homozigosa M3.</li>
</ol>3. Análise de dados e identificação de mutantes (1-3 meses)
NOTA: As leituras fornecidas a partir do método acima estão em unidades de luz relativa (RLU).
<ol><li>Para calcular [Ca2+] concentraçãode cite, use a seguinte equação de concentração20. pCa = 0,332588 (-log (L/Lmax)) + 5,5593 Contagem de luminescência () e contagem total restante(max).</li>
	<li>Converta os valores pCa obtidos para [Ca2+] valoresde cite em μM multiplicando por 106. Em seguida, plote graficamente contra um controle de aequorina (Col-0 transgênico) para identificar mutantes putativos H2O2 para resposta Ca2+. </li>
	<li>Mudas de resgate mostrando uma perda ou redução da resposta ao aplicativo H2O2 resgatado.</li>
	<li>Após o amadurecimento, colhem sementes do mutante resgatado e re-tela para resposta a H2O2 em M3 mudas. Se todas as mudas de 12 M3 apresentarem uma resposta Ca2+ semelhante à planta mãe, considere a população como uma população mutante homozigosa M3. Se todas as 12 mudas não mostrarem tal resposta, então leve-as para a geração M4 e re-tela para obter população homoziga.</li>
	<li>Uma vez que uma linha de plantas homozigos tenha sido obtida, identifique o gene que leva ao fenótipo alterado usando sequenciamento de próxima geração.</li>
</ol>

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<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lectin+S-domain+receptor+kinase+mediates+lipopolysaccharide+sensing+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).</li>
<li>Johnson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Poly%28A%29+Ribonuclease+Controls+the+Cellotriose-Based+Interaction+between+Piriformospora+indica+and+Its+Host+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+sensor+HPCA1+is+an+LRR+receptor+kinase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis.</a> Nature. 578, 577-581 (2020).</li>
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Nenhum dos autores tem conflitos de interesse para declarar.

A mutagênese EMS é uma ferramenta poderosa para gerar mutações na população. As telas genéticas avançadas clássicas usando EMS têm sido uma ferramenta eficaz para identificar novos genes por duas razões principais: em primeiro lugar, eles não exigem quaisquer suposições prévias sobre identidade genética e, em segundo lugar, eles não introduzem qualquer viés. Existem vários métodos para gerar uma triagem de populações como EMS, inserções de T-DNA, radiações etc. De todos os métodos, a mutagênese baseada em EMS tem poucas ...

Uma mudança na concentração de cálcio citosomico (Ca2+) na percepção de estímulo biótico ou abiótico é um evento de sinalização precoce bem estudado que ativa muitas vias de sinalização1,,2,,3,4. Uma célula em seu estado de repouso basal mantém uma concentração ca2+ mais baixa no citosol e sequesters em excesso ca2+ em várias organelas intracelulares e apoplasto extracelular levando a um gradiente Ca2+ íngreme5,6. Após a percepção do sinal, os níveis de Ca2+ aumentam no citosol devido a um influxo de Ca2+ de fontes extracelulares e/ou intracelulares e geram uma assinatura específica de cálcio7,,8,,9. As elevações ca2+ no citosol são ativadas por muitos estímulos, mas a especificidade é mantida por lojas distintas que liberam Ca2+,uma assinatura ca2+ exclusiva e proteínas sensoriais apropriadas10,,11.
O uso de agente alquilante, sulfonato de metano etílico (EMS) para mutagênese é uma ferramenta poderosa em telas genéticas avançadas clássicas para identificar múltiplos genes independentes envolvidos em um processo. EMS é um mutagênico químico que induz as transições C para T e G para A aleatoriamente em todo o genoma e produz uma mudança de 1 bp em cada 125 kb do genoma. A mutagênese EMS induzirá ≈1000 alterações de par de base única, inserção/exclusões (InDel) ou polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) por genoma12. Mutações induzidas pelo EMS são mutações de vários pontos com uma frequência de mutação que varia de 1/300 a 1/30000 por lócus. Isso reduz o número de plantas M1 necessárias para encontrar uma mutação em um determinado gene. Uma faixa populacional de sementes M1 de 2000-3000 é tipicamente usada para obter mutações de interesse em Arabidopsis thaliana13,14.
Os transgênicos de aequorin são plantas ecotipos Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) expressando p35S-apoaequorin (pMAQ2) no citosol15. Aequorina é uma proteína de ligação Ca2+ composta de apoproteína e um grupo protético composto por molécula de luciferina, coelenterazina. A ligação de Ca2+ à aequorina, que possui três sítios ca2+ de ligação EF-hands, resulta em coelenterazina sendo oxidada e ciclizada para dar o intermediário dioxetanona, seguida de uma alteração conformacional da proteína acompanhada pela liberação de dióxido de carbono e coelenteramida singlet-excited16. A coelenteramida tão produzida emite uma luz azul (λmax, 470 nm) que pode ser detectada pelo luminômetro17. As elevações extremamente rápidas de Ca2+ podem, portanto, ser medidas em tempo real e exploradas para telas genéticas rápidas. Este protocolo visa usar a especificidade da resposta ao cálcio para identificar novos atores-chave que estão envolvidos na assinatura do Ca2+. Para alcançar essa tarefa, usamos mutagênese EMS em aequorina transgênica e identificamos os SNPs associados à sinalização alterada de Ca2+. O protocolo identifica mutantes que não mostram elevações de Ca2+ reduzidas após a adição de estímulos. Esses mutantes podem então ser mapeados para identificar os genes responsáveis pela resposta ca2+. O método é aplicável a qualquer tipo de estímulo líquido em plantas que resulte em uma elevação de Ca2+. Uma vez que a elevação do Ca2+ é uma das primeiras respostas na via de sinalização de defesa vegetal, a identificação de componentes de resposta a montante pode fornecer candidatos para a engenharia genética para desenvolver plantas resistentes.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 24 poços</td><td>Jetbiofil</td><td>11024</td><td>para o cultivo de mudas</td></tr><tr><td>96 poços cliniplate branco</td><td>Thermo Scientific</td><td>9502887</td><td>para medições de luminômetro</td></tr><tr><td>Aequorin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agropet</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>para crescimento de plantas</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12135</td><td>para descarga solução</td></tr><tr><td>Coelenterazina</td><td>PJK</td><td>55779-48-1</td><td>grupo protético para aequorina</td></tr><tr><td>Eftilmetano sulfonato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0880-5G</td><td>para mutagênese de sementes</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Reagente analítico</td><td>1170</td><td>para solução de descarga</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Merck Life Sciences</td><td>1.93001.0521</td><td>solução de esterilização</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Fisher Scientific</td><td>15465</td><td>como estímulo para elevação de cálcio</td></tr><tr><td>Ascensão de Luminoskan</td><td>Thermo Scientific</td><td>5300172</td><td>medição de luminescência de aequorina</td></tr><tr><td>Buffer MES Himedia</td><td></td><td>RM1128-100G</td><td>crescimento de plantas</td></tr><tr><td>Murashige e skoog media</td><td>Himedia</td><td>PT021-25L</td><td>crescimento de plantas</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>27805</td><td>para neutralização EMS</td></tr><tr><td>Hipoclorito de sódio</td><td>Merck Life Sciences</td><td>1.93607.5021</td><td>solução de esterilização</td></tr><tr><td>Tiossulfato de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>28005</td><td>para lavagem de sementes na etapa 1.6</td></tr><tr><td>soilrite</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>para crescimento</td></tr><tr><td>de plantas Vasos quadrados</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>para crescimento de plantas</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td>crescimento de plantas</td></tr><tr><td>Taxim</td><td>Alkem</td><td>7180720</td><td>para resgate de mudas</td></tr></tbody></table>

tela genética avançada usando aequorin repórter de cálcio transgênico para identificar novos alvos na sinalização de cálcio

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Telas genéticas avançadas têm sido ferramentas importantes na identificação imparcial de componentes genéticos envolvidos em várias vias biológicas. A base da tela é gerar uma população mutante que pode ser rastreada com um fenótipo de interesse. EMS (sulfonato de metano etílico) é um agente alquilante comumente usado para induzir mutação aleatória em uma tela genética clássica para a frente para identificar múltiplos genes envolvidos em qualquer processo. A elevação do cálcio citosomico (Ca2+) é uma via de sinalização inicial chave que é ativada após a percepção do estresse. No entanto, a identidade dos receptores, canais, bombas e transportadores do Ca2+ ainda é evasiva em muitos sistemas de estudo. Aequorin é uma proteína repórter de cálcio celular isolada da Aequorea victoria e expressa em Arabidopsis. Explorando isso, projetamos uma tela genética avançada na qual ems-mutagenizamos a aequorin transgênica. As sementes das plantas mutantes foram coletadas (M1) e a triagem para o fenótipo de interesse foi realizada na população segregadora (M2). Usando um protocolo de medição Ca2+ de alta produtividade de 96 poços, vários novos mutantes podem ser identificados que têm uma resposta de cálcio variada e são medidos em tempo real. Os mutantes com o fenótipo de interesse são resgatados e propagados até que uma população de plantas mutantes homozigosa seja obtida. Este protocolo fornece um método para encaminhar telas genéticas em fundo de repórter Ca2+ e identificar novos alvos regulamentados ca2+.

A população ems foi examinada para elevação H2O2 induzida ca2+. Como discutido anteriormente, 12 mudas individuais M2 foram examinadas de cada linha M1. Na Figura 3,uma dessas linhas M1 é traçada com cada painel mostrando 12 mudas individuais M2. Uma aequorina tipo selvagem é usada como controle para comparar e avaliar a resposta mutante. Um mutante recessivo segrega na proporção de 1:7 (mutante: não mutante). Ao se...

Uma tela genética para a frente baseada na elevação de Ca2+ como leitura leva à identificação de componentes genéticos envolvidos em vias de sinalização dependentes de cálcio nas plantas.

Tela genética avançada usando aequorin repórter de cálcio transgênico para identificar novos alvos na sinalização de cálcio

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

O objetivo deste protocolo é identificar um método que pode ser usado para identificar novos genes que estão envolvidos na sinalização de cálcio. Para fazer isso, usamos a clássica tela genética para a frente. A sinalização de cálcio é um importante caminho de resposta à defesa em vários sistemas vegetais.Para identificar os genes envolvidos nesse caminho, usamos a tela genética clássica para a frente. Neste método, o EMS seria usado como um agente alquilante para introduzir mutações aleatórias nos sistemas vegetais. A geração mutante desenvolvida pode então ser usada para triagem para um fenótipo de interesse.Uma vez identificado o fenótipo de interesse, o gene causal pode ser mapeado. Neste estudo, utilizamos a planta modelo Arabidopsis que tem a repórter de cálcio aequorin em seu espectro. Pese 150 mg de sementes de aequorina para mutagênese EMS e outras sementes de 150 mg para serem usadas como controle.Transfira as sementes para um tubo Falcon de 50 ml e adicione 2% DES ou água autoclavada. Ao usar o EMS, tenha cuidado porque é cancerígeno. As engrenagens de proteção devem ser usadas durante o uso de EMS e qualquer tipo de derramamento deve ser evitado.Sele os tubos Falcão com parafina e enrole-o com papel alumínio. Gire a extremidade do tubo por 18 horas em temperatura ambiente. Permita que as sementes se instalem e removam cuidadosamente a solução EMS e descarte em um recipiente de resíduos contendo um NaOH molar.Lave bem as sementes mutagenizadas com 40 ml de água autoclavada pelo menos oito vezes. Para a lavagem final, adicione 100 mililitros de tiossulfito de sódio e enxágue pelo menos três vezes para remover traços de EMS. Mergulhe as sementes em 40 ml de água autoclavada por uma hora para difundir o EMS das sementes e, em seguida, coloque-as no papel Whatman até secar completamente.Transfira as sementes para Eppendorf e incubar a quatro graus Celsius por dois a quatro dias para estratificação. Transfira as sementes mutagenizadas e as sementes tratadas com água para o solo e transfira-as para salas de crescimento com luz de 16 horas e período de oito horas de foto escura a 22 graus Celsius e 70% de umidade relativa. Para determinar se a mutagênese foi bem sucedida, procure o setor de clorofila.Usamos o único método de coleta de sementes à base de pedigree e cada planta M1 recebe um número único. Após a maturação, as sementes são colhidas dessas plantas mutantes individuais e armazenadas como linhas M1 individuais. É utilizado um protocolo de esterilização de sementes de alto rendimento e protocolo radicular de plantas hidropônicas, adaptado de Ranf et al.No primeiro dia, coloque cerca de 12 a 15 sementes M2 por M1 uma linha em poços individuais de uma placa de cultura tecidual de 24 poços e esterilize usando hipoclorito de sódio e solução de ácido clorídrico em uma proporção de três é para um. Isso libera gás cloro que esteriliza as sementes. Deixe a placa durante a noite para evaporar completamente o gás cloro restante.Após a esterilização, adicione mídia líquida de MS de meia resistência aos poços individuais e estratize as sementes por dois a quatro dias a quatro graus Celsius, e depois mova as sementes para uma câmara de crescimento com período de foto de 10 horas de luz e 14 horas escuras a 22 graus Celsius, 70% de umidade relativa. No dia 14, uma vez que as mudas têm de oito a 12 dias, coloque 12 mudas M2 de cada linha individualmente em uma placa de 96 poços de luminômetro. Após a transferência de mudas, adicione 150 microliters de cinco soluçãos de coelenterazina micromolar em poços individuais e armazene no escuro a 21 graus Celsius por oito horas.Coelenterazine é um grupo protético que se liga à apoaequorina para formar aequorina funcional. A coelenterazina é sensível à luz e, portanto, é armazenada em garrafas de cor escura protegidas da luz. No dia seguinte, mutantes de tela usando peróxido de hidrogênio como estímulo e medem a elevação subsequente do cálcio.Para medição simultânea de 24 poços, é feito um programa cinético automatizado, que inclui medir o fundo por um minuto, seguido de adição e medição de estímulo por 10 minutos, seguido de injeção de descarga de 150 microliter e medição por três a cinco minutos. E qualquer descarga para a filha aequorin seria incluída na leitura para quantificar o cálcio medido e como controle adicional para aequorina funcional. As leituras fornecidas a partir do método acima estão em unidades de luz relativas.Para calcular a concentração de íons de cálcio citosóis, é utilizada uma equação de concentração previamente descrita dada por Rental e Knight em 2004, que está descrita no protocolo. As RLUs obtidas a partir do luminômetro são adicionadas à equação para calcular a concentração de íons de cálcio. Os valores de íons de cálcio citosóicos obtidos são então graficamente plotados contra um controle do tipo selvagem para identificar mutantes de peróxido de hidrogênio putativo para resposta ao cálcio.Este é um resultado representativo do protocolo mostrado. Mostramos uma linha M1 com 12 mudas individuais que foram medidas para elevação da concentração de íons de cálcio. A linha verde no gráfico indica aequorina tipo selvagem que foi medida junto com mutantes.Vermelho é a média de todas as 12 mudas, e linha preta é mudas individuais M2 medidas para a elevação de íons de cálcio. As mudas que mostram uma resposta altamente reduzida à aplicação de peróxido de hidrogênio são então resgatadas. Mutantes resgatados são então reconfirmados na próxima geração, seguidos de mapeamento para identificar genes causais.Deve-se ter cuidado ao usar o EMS como mutagênico, já que é um cancerígeno. A engrenagem protetora deve ser usada o tempo todo e qualquer derramamento feito deve ser tratado com boas práticas laboratoriais. Além disso, ao fazer uma coleção de sementes à base de pedigree, as plantas individuais devem ser colhidas com o maior cuidado para que não haja mistura de sementes em nenhum estágio.Isso vai ajudar alguém a voltar e rastrear a planta mãe, que é a planta mutante homozigous. Além disso, uma vez que este método não introduz qualquer viés ou quaisquer suposições anteriores no método de triagem, ele pode ser usado para uma ou mais condições para identificar um fenótipo de interesse. Além disso, vários genes independentes também poderiam ser identificados usando o mesmo protocolo.O protocolo é fácil de usar, pois com a pequena dosagem, um grande número de plantas pode ser mutagenizado. Este grande número de plantas mutantes pode ser usado para várias populações e para várias condições e para identificar vários genes. Uma perda parcial de função, uma função alterada, uma perda completa da função ou também função genética constitutiva podem ser identificadas através deste método.O mapeamento deve ser uma tarefa fácil dado o avanço das tecnologias de mapeamento nos cenários atuais. Um sistema de mapeamento baseado em novo, uma conspiração racial baseada em SNP e muitos outros podem ser usados para identificar o gene causal que causa o fenótipo de interesse. Dada a aplicabilidade deste método, ele pode ser usado não apenas nas plantas modelo Arabidopsis, mas em outras plantas modelo também desde que um fenótipo de leitura de interesse possa ser estabelecido.

forward-genetic-screen-using-transgenic-calcium-reporter-aequorin-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo apresenta os conceitos por trás da imagem de cálcio e inclui um protocolo de exemplo para imagem de lapso de tempo de vermes contidos em poços de agarose moldados.

Imagem de cálcio: um método para visualizar a atividade neural em C. elegans vivos

Com o seu pequeno corpo transparente, neuroanatomia bem documentado e uma série de técnicas genéticas passíveis e...

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

O ensaio de mobilização de cálcio e de fluorescência baseada aqui descrito é um sistema de rastreio inverso farmacologia de médio rendimento para a identificação de ligandos funcionalmente activação (s) de órfãos receptores acoplados à proteína (GPCRs).

Caracterização dos receptores acoplados à proteína por uma mobilização de cálcio Ensaio baseado em fluorescência

Aqui nós apresentamos um romance Ca 2+ -Imaging abordagem usando um repórter bioluminescente. Esta abordagem utiliza um GFP-aequorina constructo fundido que se liga a Ca 2+ e emite luz, eliminando a necessidade de excitação da luz. Significativamente este método permite imagem longa e contínua, o acesso a estruturas cerebrais profundas e alta resolução temporal.

In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Este protocolo descreve o uso de geneticamente codificado Ca2 + repórteres para alterações de registro da atividade neural em se comportando vermes Caenorhabditis elegans .

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

Descrevemos abordagens para a manipulação de genes no sistema modelo evolucionista Astyanax mexicanus. São descritas três técnicas diferentes: transgênese mediada por Tol2, alvo de manipulação do genoma usando CRISPR/Cas9 e nocaute de expressão usando morpholinos. Essas ferramentas devem facilitar a investigação direta de genes subjacentes a variação entre as formas de superfície - e caverna-moradia.

Manipulação de função do Gene em Cavefish mexicano

Apresentamos um protocolo de duas partes que combina imagens fluorescentes de cálcio com hibridização in situ, permitindo que o experimentador correlacione padrões de atividade de cálcio com perfis de expressão genética em um nível unicelular.

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Descrevemos aqui, o estabelecimento e a aplicação de um Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referido como αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 abaixo) linha de repórteres para avaliação de reprogramação cardíaca. Os fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs) isolados da cepa do camundongo são convertidos em cardiomiócitos induzidos (iCMs), permitindo uma avaliação conveniente e eficiente da eficiência de reprogramação e maturação funcional dos ICMs via fluxo de cálcio (Ca2+).

Avaliação in vitro da reprogramação cardíaca medindo fluxo de cálcio específico cardíaco com um repórter GCaMP3

O presente protocolo descreve o controle totalmente óptico e a observação da atividade celular desencadeada em cardiomiócitos derivados de iPSC (iPSC-CMs) para triagem de drogas de alto rendimento e testes de toxicidade. A quantificação multiparamétrica de padrões fenotípicos no tempo e no espaço é mostrada. Efeitos a longo prazo de drogas ao longo de horas, ou medições sequenciais ao longo dos dias, são demonstrados.

Controle óptico de alto rendimento e registro do sinal de cálcio em cardiomiócitos derivados de iPSC para testes de toxicidade e triagem fenotípica de drogas

Neste trabalho, um ensaio de fluorescência de cálcio intracelular de alto rendimento para placas de 384 poços para rastrear pequenas bibliotecas de moléculas em receptores acoplados à proteína G recombinante (GPCRs) é descrito. O alvo, o receptor de cinina do carrapato da febre do gado, Rhipicephalus microplus, é expresso em células CHO-K1. Este ensaio identifica agonistas e antagonistas usando as mesmas células em um ensaio de "adição dupla".

Um ensaio de fluorescência de cálcio de "dupla adição" para a triagem de alto rendimento de receptores acoplados à proteína G recombinante

As próteses retinianas têm a capacidade de gerar percepções visuais. Para avançar no desenvolvimento de novas próteses, são necessários métodos ex vivo para testar os dispositivos antes do implante. Este artigo fornece um protocolo abrangente para o estudo da atividade do cálcio na camada de células ganglionares da retina quando submetido à estimulação elétrica.

Imagem de cálcio em retinas planas eletricamente estimuladas

Aprenda a realizar triagem genética direta em Arabidopsis usando aequorina como repórter de cálcio para identificar novos genes envolvidos na sinalização de cálcio em plantas.

Tela genética avançada usando aequorin repórter de cálcio transgênico para identificar novos alvos na sinalização de cálcio

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