Name: Imagem e Análise do Transporte de Neurofilamento em Nervo Tibial de Camundongo Excised (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprenda a analisar o transporte de neurofilamentos em axônios mielinizados de camundongos transgênicos usando microscopia de fluorescência. Este método permite medir a direcionalidade e velocidade do transporte em segmentos nervosos isolados.

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Os autores gostariam de agradecer paula Monsma por instrução e assistência com microscopia confocal e dissecção do nervo tibial e Dr. Atsuko Uchida, Chloe Duger e Sana Chahande pela assistência com a criação de ratos. Este trabalho foi apoiado em parte pela Colaborativa National Science Foundation Grants IOS1656784 to A.B. e IOS1656765 a P.J., e Institutos Nacionais de Subsídios à Saúde R01 NS038526, P30 NS104177 e S10 OD010383 a A.B. N.P.B. foi apoiado por uma bolsa do Programa de Pós-Doutorado do Presidente da Universidade estadual de Ohio.

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Os autores não têm nada a revelar.

Deve-se tomar cuidado na análise de experimentos de fuga de pulso e difusão de pulso, pois há um potencial significativo para a introdução de erros durante o pós-processamento, principalmente durante a correção de campo plano, alinhamento de imagem e correção de alvejante. A correção em campo plano é necessária para corrigir a não uniformidade na iluminação, o que resulta em uma queda de intensidade em todo o campo de visão do centro para a periferia. A extensão da não uniformidade é dependente do comprimento de onda e, ...

O transporte axonal de neurofilamentos foi demonstrado pela primeira vez na década de 1970 pela rotulagem de pulso radioisotópica1. Essa abordagem tem gerado uma riqueza de informações sobre o transporte de neurofilamento in vivo,mas tem resolução espacial e temporal relativamente baixa, tipicamente na ordem dos milímetros e dias, no máximo2. Além disso, a rotulagem de pulso radioisotópica é uma abordagem indireta que requer a injeção e o sacrifício de vários animais para gerar um curso único. Com a descoberta de proteínas fluorescentes e os avanços na microscopia de fluorescência na década de 1990, tornou-se posteriormente possível a imagem do transporte de neurofilamento diretamente em neurônios cultos em uma escala de tempo de segundos ou minutos e com resolução espacial sub-micrômetro, proporcionando uma visão muito maior do mecanismo do movimento3. Esses estudos revelaram que os polímeros de neurofilamento em axônios se movem de forma rápida e intermitente em direções anterogradas e retrógradas ao longo de trilhas de microtúbulos, impulsionados por proteínas motoras microtúbulas. No entanto, neurofilamentos são estruturas limitadas à difração com apenas 10 nm de diâmetro que são tipicamente espaçadas além de seus vizinhos por apenas dezenas de nanômetros; portanto, os polímeros só podem ser rastreados em neurônios cultivados que contenham neurofilamentos pouco distribuídos para que os polímeros em movimento possam ser resolvidos a partir de seus vizinhos4. Assim, não é possível rastrear neurofilamentos únicos em axônios que contenham polímeros neurofilados abundantes, como axônios mieliados.
Para analisar o transporte axonal de neurofilamentos em axônios ricos em neurofilamentos usando microscopia de fluorescência, utilizamos um método de fotoativação de fluorescência de fuga de pulso que desenvolvemos para estudar o comportamento de pausa a longo prazo de neurofilamentos em células nervosas cultivadas4,,5. Neurofilamentos marcados com uma proteína de fusão de neurofilamento fluorescente fotoativat são ativados em um pequeno segmento de axônio, e então a taxa de saída desses filamentos da região ativada é quantificada pela medição da decadência da fluorescência ao longo do tempo. A vantagem dessa abordagem é que é uma análise em nível populacional do transporte de neurofilamento que pode ser aplicada em uma escala de tempo de minutos ou horas sem a necessidade de rastrear o movimento de polímeros de neurofilamento individual. Por exemplo, usamos este método para analisar a cinética do transporte de neurofilamento nas culturas mielique6.
Recentemente, descrevemos o desenvolvimento de um rato transgênico hThy1-paGFP-NFM que expressa baixos níveis de uma proteína de neurofilamento com marca paGFP M (paGFP-NFM) em neurônios sob o controle do promotor Thy1 específico do neurônio humano7. Este camundongo permite a análise do transporte de neurofilamento in situ usando microscopia de fluorescência. Neste artigo, descrevemos as abordagens experimentais para a análise do transporte de neurofilamento em axônios mieliados de nervos tibiais desses camundongos usando duas abordagens. A primeira dessas abordagens é o método de fuga de pulso descrito acima. Este método pode gerar informações sobre o comportamento de pausa dos neurofilamentos, mas é cego para a direção em que os filamentos partem da região ativada e, portanto, não permite a medição da direcionalidade líquida e da velocidade de transporte8. A segunda dessas abordagens é um novo método de propagação de pulso no qual analisamos não apenas a perda de fluorescência da região ativada, mas também o aumento transitório da fluorescência em duas janelas de flanqueamento através das quais os filamentos fluorescentes se movem à medida que saem da região ativada em direções anterogradas e retrógradas. Em ambas as abordagens, parâmetros de transporte de neurofilamento, como a velocidade média, direcionalidade líquida e comportamento de pausa podem ser obtidos utilizando-se análise matemática e modelagem das mudanças na fluorescência nas janelas de medição. A Figura 3 ilustra essas duas abordagens.
Este protocolo demonstra dissecação e preparação do nervo, ativação e imagem da fluorescência paGFP e quantificação do transporte de neurofilamento a partir das imagens adquiridas utilizando o pacote de distribuição FIJI da ImageJ9. Usamos o nervo tibial porque é longo (vários cm) e não ramifica; no entanto, em princípio, qualquer nervo que expresse paGFP-NFM é apropriado para uso com esta técnica se ela pode ser dissecada e desapeto sem danificar os axônios.

<table><tbody><tr><td>Junta retangular 14 x 22 0.1mm</td><td>Bioptechs</td><td>1907-1422-100</td><td>junta interna</td></tr><tr><td>2-deoxy-D-glucose</td><td>Sigma</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>Junta redonda de 30 mm com furos</td><td>Bioptechs</td><td>1907-08-750</td><td>junta externa</td></tr><tr><td>35 x 10 mm prato</td><td>Thermo Fisher</td><td>153066</td><td>pratos de dissecação</td></tr><tr><td>40 mm lamínulas redondas</td><td>Bioptechs</td><td>40-1313-0319</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 60mL - Ponta Luer-lock</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Andor Revolution WD sistema confocal de disco giratório</td><td>Andor</td><td></td><td>equipado com sistemas Perfect Focus e FRAPPA</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>Fisher</td><td>12-541-B</td> para solução de glicose D-(+) de <td>lâmina de fluoresceína</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Pinos de dissecação</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-70</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de dissecação</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>pinça de ponta fina</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecção</td><td>Zeiss</td><td>47 50 03</td><td></td></tr><tr><td>Panela de dissecação com cera</td><td>Ginsberg Scientific</td><td>568859</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-09</td><td>inicial tesoura de dissecção</td></tr><tr><td>FCS2 câmara de perfusão</td><td>Bioptechs</td><td>060319-2-03</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína sódica</td><td>Fluka</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor de solução em linha</td><td>Warner Instruments</td><td>SH27-B</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de laminectomia</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td>pinça de dissecção inicial</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de microaqueduto</td><td>Bioptechs</td><td>130119-5</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td>para lâmina de fluoresceína</td></tr><tr><td>Inserção de platina de microscópio</td><td>Instrumentação Científica Aplicada</td><td>I-3017</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de aquecimento de objetiva</td><td>Okolab</td><td></td><td>Oko Touch com colar de objetiva</td></tr><tr><td>Óleo de objetiva - tipo A</td><td>Nikon</td><td>descontinuado</td><td></td></tr><tr><td>Plano Apo VC 100x 1.40 NA objetiva</td><td>Nikon</td><td>MRD01901</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sódio iodoacetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2512</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>Sage Instruments</td><td>Modelo 355</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de tubulação - fêmea</td><td>Small Parts Inc.</td><td></td><td></td>1005109</tr><tr><td>Adaptador de tubulação - macho</td><td>Small Parts Inc.</td><td></td><td></td>1005012</tr><tr><td>Tygon tubulação</td><td>Bioptechs</td><td></td><td>1/16" ID, 1/32" espessura de parede</td></tr><tr><td>Tesoura de mola Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>tesoura fina</td></tr></tbody></table>

imagem e análise do transporte de neurofilamento em nervo tibial de camundongo excised

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Os polímeros de proteína neurofilamental movem-se ao longo dos axônios no componente lento do transporte axonal a velocidades médias de ~0,35-3,5 mm/dia. Até recentemente, o estudo desse movimento in situ só era possível utilizando rotulagem de pulso radioisotópica, que permite a análise do transporte axonal em nervos inteiros com resolução temporal de dias e resolução espacial de milímetros. Para estudar o transporte de neurofilamento in situ com maior resolução temporal e espacial, desenvolvemos um camundongo transgênico hThy1-paGFP-NFM que expressa proteína de neurofilamento M marcada com GFP fotoativatável em neurônios. Aqui descrevemos os métodos de fotoativação de fluorescência de fuga de pulso e difusão de pulso para analisar o transporte de neurofilamento em axônios mieliados únicos de nervos tibiais desses camundongos ex vivo. Segmentos nervosos isolados são mantidos no estágio do microscópio por perfusão com soro fisiológico oxigenado e imageados por microscopia de fluorescência confocal de disco giratório. A luz violeta é usada para ativar a fluorescência em uma janela axonal curta. A fluorescência nas regiões ativadas e flanqueadas é analisada ao longo do tempo, permitindo o estudo do transporte de neurofilamento com resolução temporal e espacial na ordem de minutos e mícrons, respectivamente. A modelagem matemática pode ser usada para extrair parâmetros cinéticos do transporte de neurofilamento, incluindo a velocidade, viés direcional e comportamento de pausa dos dados resultantes. Os métodos de fuga de pulso e difusão de pulso também podem ser adaptados para visualizar o transporte de neurofilamento em outros nervos. Com o desenvolvimento de camundongos transgênicos adicionais, esses métodos também poderiam ser usados para imagem e análise do transporte axonal de outras proteínas citoesqueletal e citosóica em axônios.

A Figura 3 mostra imagens representativas de experimentos de fuga de pulso e propagação de pulso. Publicamos diversos estudos que descrevem dados obtidos utilizando o método pulse-escape e nossos métodos para a análise desses dados5,,6,7,,8,,17. Abaixo, mostramos como os dados de difusão de pulso podem produzir informações sobre a...

Descrevemos métodos de fotoativação de fluorescência para analisar o transporte axonal de neurofilamentos em axônios mieliados únicos de nervos periféricos de camundongos transgênicos que expressam uma proteína de neurofilamento fotoativavel.

Imagem e Análise do Transporte de Neurofilamento em Nervo Tibial de Camundongo Excised

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Este protocolo permite a imagem direta da população de neurofilamento em axônios mieliados de camundongos juvenis ou adultos usando microscopia de fluorescência, possibilitando medir a direcionalidade e a velocidade do transporte de neurofilamento em segmentos nervosos isolados. Este método depende da disponibilidade de camundongos expressando uma fusão fluorescente fotoativa da proteína de interesse, mas pode ser adaptado para uso em qualquer nervo prontamente dissecado. Para começar, despeje soro fisiológico oxigenado em uma seringa de 60 mililitros e certifique-se de que há ar mínimo restante na seringa.Conecte a seringa à tubulação e coloque o tubo de saída em um frasco de resíduos. Coloque a junta externa na carcaça da câmara de perfusão, garantindo que a entrada de fluxo e os postes de saída estejam alinhados com os orifícios da junta, em seguida, coloque a junta interna em uma tampa circular número 1,5 e suavize cuidadosamente quaisquer rugas na junta para garantir uma vedação apertada. Coloque a tampa e a junta em uma toalha de papel ou uma limpeza de tarefa com a junta voltada para cima.Use um par de tesouras de dissecção grande para fazer uma incisão dorsal na pele perto do meio da coluna vertebral e continue a cortar em torno do aspecto ventral do animal. Puxe lentamente a pele para longe do músculo e corte a fáscia. Em seguida, use uma tesoura de microdisseção para fazer uma incisão nos músculos da coxa no meio do caminho entre a cauda e o joelho para expor o nervo ciático.Certifique-se de que o nervo, que é visível através do músculo, não seja cortado. Estique a incisão dorsal e ventrally para remover o músculo, em seguida, remova os músculos da panturrilha, mantendo os cortes rasos e curtos para evitar danificar os nervos. Continue removendo os músculos até que o nervo tibial esteja totalmente exposto do ponto onde ele se ramifica do nervo ciático até o calcanhar.Segure o nervo tibial na extremidade proximal da coluna vertebral com um par de fórceps e corte-o com um par de tesouras de microdisseção, certificando-se de não aplicar muita tensão ao nervo. Levante-o cuidadosamente do músculo e corte qualquer apego, tomando cuidado para não colocar tensão no nervo. Corte a extremidade distal da coluna vertebral do nervo tibial e transfira-a para uma pequena placa de Petri de soro fisiológico oxigenado à temperatura ambiente.A partir da extremidade proximal do nervo, segure suavemente as extremidades do axônio exposto com um par de fórceps de ponta muito finos. Com um segundo par de fórceps, segure a bainha nervosa proximalmente e puxe lentamente para a extremidade distal do nervo certificando-se de que nenhuma tensão indevida seja aplicada durante este processo. Segure a extremidade proximal do nervo e lentamente deite-a em uma mancha de cobertura, em seguida, endireitar-lo sob tensão suave.Coloque o deslizamento do microacoduto sobre o nervo com o deslizamento ranhurado para baixo e posicione a direção do fluxo paralelo ao nervo. Vire o deslizamento de tampas e o conjunto de micropacdutos e coloque-o na caixa da câmara de perfusão com o slide oposto à junta externa. Para fixar a câmara de profusão, coloque-a na caixa metálica e gire o anel de bloqueio.Deprimir lentamente o êmbolo da seringa salina e encher a câmara de perfusão. Mantenha a entrada e a saída de tubos, o frasco de saída e a seringa elevados acima da própria câmara o tempo todo durante a configuração e a imagem. Transfira o conjunto de profusão para um estágio de microscópio invertido e monte a seringa salina na bomba de seringa, em seguida, inicie o motor e ajuste a velocidade para uma taxa de fluxo de 0,25 mililitros por minuto.Conecte o aquecedor de solução inline e coloque-o a 37 graus Celsius. Conecte o aquecedor objetivo e coloque-o a 37 graus Celsius. Aplique óleo ao objetivo e insira a câmara de profusão na montagem do palco.Aplique óleo na almofada de aquecedor da câmara e conecte-o à câmara de perfusão, em seguida, conecte-o e coloque-o a 37 graus Celsius. Tranque a câmara de profusão no adaptador de palco e leve o óleo objetivo para contato com o deslizamento de cobertura na parte inferior da câmara. Use a iluminação Brightfield para se concentrar na camada de axônios na superfície inferior do nervo mais próximo da superfície da mancha.Axônios mielinados podem ser identificados pela presença de uma baia de mielina que é visível sob iluminação de luz transmitida brightfield sem aprimoramento de contraste. Adquira uma imagem de referência Brightfield, registrando a direcionalidade do nervo, em seguida, adquira uma imagem confocal usando um laser de 488 nanômetros e um filtro de emissão apropriado para GFP fotoativatável. Defina a potência laser para aproximadamente cinco vezes a potência normal de imagem e adquira uma imagem com um tempo de exposição de três a quatro minutos, em seguida, adquira outra imagem confocal para registrar a autofluorescência pré-ativação após a etapa de branqueamento.Desenhe uma linha paralela aos axônios com um comprimento igual ao tamanho da janela de ativação desejada da imagem Brightfield. Usando esta linha como guia, desenhe uma região retangular de interesse através do campo de visão perpendicular aos axônios. Ative a fluorescência GFP nesta região por excitação de padrão com a luz de 405 nanômetros, certificando-se de que uma imagem seja adquirida pouco antes e imediatamente após a ativação.À medida que a ativação termina, inicie um temporizador de um minuto. Quando explodir, comece a aquisição de uma série timelapse. Adicione 250 miligramas de pó de fluoresceína a 0,5 mililitros de água dupla destilada e misture-a até que não haja partículas visíveis, em seguida, gire a solução por 30 segundos em uma centrífuga de mesa para sedimentar qualquer material não resolvido.Adicione oito microliters de solução de fluoresceína a um slide e aplique um deslizamento de tampas número 1,5. Limpe o excesso de líquido, sele a tampa com esmalte e deixe o slide secar. Coloque o slide descalada lateral para baixo no estágio do microscópio invertido e ajuste o foco no plano fino de fluorescência na superfície do deslizamento.Mova o slide ao redor para encontrar um campo de visão que não contenha bolhas de ar ou grandes partículas de fluoresceína e adquira uma pilha de Z que abrange seis micrômetros a intervalos de 0,2 micrômetros de modo que a imagem do meio seja o plano de foco original. Feche todas as persianas do caminho da luz, incluindo o obturador da câmera e ajuste a potência do laser e o tempo de exposição para zero segundos. Adquira uma pilha de 100 imagens com essas configurações, que serão mediadas para gerar a imagem de campo escuro.Imagens representativas de experimentos de fuga de pulso e propagação de pulso são mostradas aqui. Para o método de fuga de pulso, a fluorescência decai cinética na região ativada pode produzir informações sobre comportamento de pausa a longo prazo e de curto prazo. A região ativada pode ser curta para esses experimentos.Uma região ativada mais longa é usada para o método de propagação de pulso, a fim de fornecer uma maior piscina de neurofilamentos fluorescentes. Isso alonga o tempo sobre o qual o aumento da fluorescência nas regiões de flanqueamento permanece linear. 15 janelas de flanqueamento de micrômetros são usadas aqui.A fluorescência total da janela de medição foi quantificada. A decadência é bifásica para o método de fuga de pulso com uma decadência exponencial inicial representando a partida de neurofilamentos na pista e uma segunda decadência exponencial mais lenta em 10 a 20 minutos que representa a partida de filamentos fora da pista. Para a estratégia de propagação de pulso, os cálculos da velocidade e direcionalidade do movimento dependem apenas das encostas nas janelas de flanqueamento.Para os comprimentos da janela utilizados aqui, a fase linear se estende por cerca de cinco minutos. Um timelapse de um nervo glicogliticamente inibido é mostrado aqui, demonstrando uma aparente redução no transporte para fora da região ativada. De fato, as encostas distal e proximal são significativamente menores nos nervos tratados com inibidor.Há também uma diminuição significativa da velocidade populacional entre essas duas condições. Ao tentar este protocolo, lembre-se que é crucial ser precipitado na condução das porções de dissecção e montagem da câmara à medida que a saúde nervosa diminui após o sacrifício do animal. A cultura celular neuronal pode permitir a medição e análise do movimento de neurofilamentos individuais, o que complementaria os dados da escala populacional coletados por meio desse protocolo.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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