Um sistema de neuronação estereática guiada por imagem de alta produtividade e sistema de ultrassom focado para abertura de barreira hemencefálica em roedores

Gliomas de alto grau, como o glioma pontino intrínseco difuso, são tumores altamente invasivos com alta mortalidade. Apesar de anos de extensa pesquisa, a barreira hematoencefálica é um aspecto importante porque a quimioterapia não é capaz de atingir efetivamente o cérebro. Felizmente, o ultrassom focalizado é capaz de abrir temporária e localmente a barreira hematoencefálica para tratamentos eficazes.

Desenvolvemos um sistema de ultrassom focalizado neuronavegado pequeno e econômico para ruptura da barreira hematoencefálica. Este sistema é construído com componentes disponíveis comercialmente e com alto grau de automação, permite estudos pré-clínicos de avaliação de medicamentos. A medicina de precisão é definida como o medicamento certo na dose certa para o paciente certo na hora certa.

Para conseguir isso, muitos medicamentos pré-selecionados precisam ser rastreados. Nosso sistema de ultrassom focalizado compacto de alto rendimento para ruptura da barreira hematoencefálica nos permite fazer exatamente isso. Demonstrando o procedimento estarão Rianne Haumann e Elvin t Hart, dois alunos de doutorado do meu grupo de pesquisa.

O fluxo de trabalho para ultrassom focalizado em neuronavegação estereotáxica guiada por imagem inclui imagens intervencionistas e acoplamento acústico para sonoporação na plataforma de ultrassom. Em seguida, podem ser realizadas imagens de acompanhamento. Selecione um transdutor adequado com base nos requisitos do experimento projetado.

Coloque-o em um cone impresso em 3D cheio de água desgaseificada e fechado na parte inferior com uma membrana Mylar acusticamente transparente. Conecte o transdutor a um gerador de funções e a um amplificador de potência. Monte o transdutor em um estágio linear motorizado para posicionamento vertical automático e conecte-o ao amplificador de potência.

Use uma plataforma estereotáxica destacável que inclua aquecimento regulado por temperatura, barras de mordida e ouvido, anestesia e marcadores fiduciais multimodais. Anexe a plataforma ao palco linear 2D. Antes que o sistema FUS possa ser usado, calibre-o e determine o ponto de foco do transdutor.

O ponto de foco corresponde à posição vertical do animal na plataforma estereotáxica. Aclimatar o animal às instalações por pelo menos uma semana após a chegada e pesá-lo regularmente. No dia do experimento, administre buprenorfina por meio de uma injeção subcutânea 30 minutos antes do tratamento com FUS.

Depois de anestesiar o mouse, aplique pomada para os olhos para evitar olhos secos. Se necessário, remova os pelos do topo da cabeça do animal com uma navalha e creme depilatório. Lave a pele com água para remover quaisquer resíduos.

Para experimentos com modelos de tumor BLI, injete 150 microlitros de D-luciferina intraperitonealmente com uma seringa de insulina de calibre 29. Para a administração de microbolhas para abertura da BHE, insira um cateter de veia caudal de calibre 26 a 30 e lave a veia com um pequeno volume de solução de heparina. Prenda o cateter com fita adesiva para evitar o descolamento.

Se o cateterismo for bem-sucedido, encha o cateter com a solução de heparina para evitar a coagulação do sangue. Coloque o animal na plataforma estereotáxica regulada por temperatura para evitar hipotermia. Fixe a cabeça do animal usando uma barra de mordida e barras de orelha e prenda a cauda e o cateter na plataforma.

Fixe o corpo do mouse com uma alça. Coloque a plataforma estereotáxica com o rato montado na modalidade de imagem e tire imagens do animal. Determine se o animal está colocado corretamente na plataforma.

Marque a posição do animal usando os marcadores fiduciais multimodais em combinação com a tubulação de processamento de imagem de acordo com o ponto de foco do transdutor. Determine a área-alvo colocando um contorno do cérebro sobre a imagem de raio-x adquirida ou usando imagens BLI para determinar o centro do tumor. Antes de posicionar o transdutor, proteja as narinas e a boca do animal com fita adesiva para evitar que o gel de ultrassom interfira na respiração.

Aplique gel de ultrassom no topo da cabeça do mouse para uma condução sonora adequada. Registre a cavitação de microbolhas com o hidrofone de agulha, que é colocado nas proximidades diretas do osso occipital. Com base nos valores de calibração, guie o transdutor para a posição correta acima do animal.

Aplique configurações pré-configuradas a todos os dispositivos conectados para atingir a região do cérebro de interesse. Depois que o transdutor for colocado na posição correta, dissolva e ative as microbolhas conforme descrito pelo fabricante. Antes da injeção de microbolhas, lave o cateter da veia caudal com solução salina para confirmar o acesso à veia caudal.

Inicie a trajetória de insonicação e simultaneamente injete as microbolhas. Ao mesmo tempo, o hidrofone da agulha detectará e verificará a cavitação de microbolhas em tempo real. Se desejar, administre um agente de contraste intravascular ou medicamento após a sonoporação.

Monitore o animal até um ponto de tempo predeterminado. A pressão acústica com um índice mecânico de 0,4 em combinação com microbolhas forneceu um meio muito sensível e confiável de detecção de cavitação estável em comparação com nenhuma detecção de sub-harmônicos quando nenhuma microbolha foi injetada ou a observação de cavitação inercial quando um IM de 0,6 foi aplicado. Enquanto a pressão acústica com IM de até 0,6 não resultou em dano macroscópico, o dano microscópico foi evidenciado histologicamente com um IM de 0,6.

Uma amplitude de pressão com IM de 0,8 resultou em hemorragia cerebral macroscópica de vasos maiores e lise tecidual generalizada com extravasamento de eritrócitos. Injetou-se azul de Evans intravenoso para validar a abertura da BHE na região pontina. O extravasamento de albumina conjugada com azul de Evans foi observado ao nível da ponte e do cerebelo no camundongo tratado com FUS e microbolhas, demonstrando um direcionamento preciso da região de interesse.

As etapas mais importantes deste protocolo são a colocação correta do cateter da veia caudal, o posicionamento e direcionamento do animal e a injeção de microbolhas com ultrassom focalizado com detecção de cavitação. Este sistema de ultrassom focalizado de fabricação própria pode ser adaptado e redesenhado para várias questões de pesquisa, sendo econômico e com um fluxo de trabalho automatizado, o que o torna adequado para pesquisadores relativamente inexperientes.