Name: Análise patológica da metástase pulmonar após injeção lateral de cauda-veia de células tumorais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprenda a analisar metástases pulmonares após injeção lateral de cauda-veia em modelo de câncer de mama. Este método utiliza análise digital de imagens para quantificar com precisão a carga tumoral metastática de forma reprodutível e econômica.

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Os dados representativos foram financiados por meio do Instituto Nacional de Câncer (K22CA218549 para S.T.S). Além de sua ajuda no desenvolvimento do método de análise abrangente aqui relatado, agradecemos ao Centro Abrangente de Câncer da Universidade estadual de Ohio e ao Recurso Compartilhado de Fenotipagem de Camundongos (Director – Krista La Perle, DVM, PhD) pelos serviços de histologia e imunohistoquímica e pelo Núcleo de Imagem de Patologia para desenvolvimento e análise de algoritmos.

O uso de animais seguiu as regulamentações do University Laboratory Animal Resources (ULAR) sob o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da OSU – protocolo aprovado 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore).
1. Injeção de veias traseiras de células cancerígenas de mama
<ol><li>Preparação de células e seringas para injeção<ol>
<li>Placa um número apropriado de células com base no número de camundongos e concentração celular a ser usado. NOTA: O número de células injetadas e o tempo para o desenvolvimento de metástases dependerão da linha celular utilizada e precisarão ser otimizadas. Nesta demonstração, 1 x 106 células MDA-MB-231 são injetadas por via intravenosa em camundongos NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) e lesões pulmonares macroscópicas são observadas no máximo 24 dias após a injeção. Para a linha de células tumores mamárias MVT1 murina17, 3 x 106 células são injetadas em camundongos FVB/N imuno-competentes com numerosas metástases pulmonares observadas por 14 dias22,23.</li>
		<li>Aspirar mídia e enxaguar placas celulares com 1x PBS. Células de trypsinize em volume mínimo, adicione o volume apropriado de mídia e conte células usando um hematócito ou outro método preferido. O azul trypan (0,4%) ou outros corantes de células vivas/mortas podem ser usados para determinar a contagem de células viáveis.</li>
		<li>Células de pelota girando a 180 x g por 5 min.</li>
		<li>Resuspenque o número apropriado de células em 1x PBS estéril, de tal forma que um volume de 100 μL seja injetado por mouse. Mantenha a suspensão celular no gelo para manter a viabilidade.</li>
		<li>Antes da injeção, ressuspendam completamente as células com uma pipeta de 200 μL ou 1 mL para evitar a aglomeração. Desenhe 100 μL em uma seringa de insulina de 28 G (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Elimine quaisquer bolhas de ar mantendo a seringa vertical, tocando na seringa e ajustando lentamente o êmbolo. A injeção de bolhas de ar na veia pode causar uma embolia de ar/gás que pode ser fatal.</li>
	</ol></li>
	<li>Injeção lateral da veia traseira NOTA: Para ensaios experimentais de metástase do câncer de mama, as injeções são realizadas em camundongos fêmeas de > 6 semanas de idade.<ol>
<li>Manuseie o mouse pela cauda e deslize animal em um tubo ranhuted/dispositivo de contenção de um tamanho apropriado (consulte a Tabela de Materiais para o dispositivo de contenção usado).</li>
		<li>Insira a porção do plugue do dispositivo de contenção e posicione o mouse de lado, de forma que sua veia traseira lateral seja fácil de visualizar. O camundongo tem uma artéria ventral alinhada com a genitália, uma veia dorsal e duas veias caudais laterais.</li>
		<li>Limpe a superfície da cauda do rato com um lenço asséptico. Segure a cauda entre o dedo indicador e o polegar com a mão não dominante e aplique uma leve tensão.</li>
		<li>Começando pela porção distal da cauda, insira a agulha paralela à veia com o bisel acabar.</li>
		<li>Se permitido, recapitula a agulha cuidadosamente e dobre para um ângulo de 20-30°. Uma abordagem individual ou dispositivo de recapeamento de agulhas é altamente recomendado. NOTA: Não é necessário aspirar, pois isso pode causar o colapso da veia. No entanto, um pequeno flash de sangue pode ser visto quando colocado pela primeira vez. A agulha avançará suavemente na veia com a colocação adequada.</li>
		<li>Distribua lentamente o volume completo na veia. Não deve haver resistência quando o êmbolo é empurrado.</li>
		<li>Se houver alguma resistência, remova prontamente a agulha da seringa. Se necessário, reinsira a agulha (idealmente não mais do que 3 tentativas) movendo-se em direção à extremidade proximal da cauda ou veia lateral oposta.</li>
		<li>Um pequeno volume de sangue provavelmente será deslocado após a injeção. Aplique pressão suave com gaze estéril e limpe com limpeza asséptica.</li>
		<li>Descarte prontamente a seringa no recipiente afiado apropriado.</li>
		<li>Devolva o mouse a uma gaiola limpa e ventilada e monitore por sinais de angústia.</li>
		<li>Monitore camundongos 2-3x/semanalmente para sinais de formação de metástase (respiração trabalhada, postura curvada, perda de peso) e sofrimento geral. O tempo para o desenvolvimento da metástase dependerá da linha celular e da tensão do rato.</li>
		<li>Se usar um dispositivo de imagem animal in vivo vivo, os ratos de imagem imediatamente após a injeção da veia traseira para confirmar a injeção bem sucedida de células e obter dados "zero" do tempo (detalhes específicos sobre imagens de bioluminescência in vivo não estão incluídos aqui, mas são descritos por Yang et al.24).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fixação do tecido pulmonar e análise da carga do tumor pulmonar metastático
<ol><li>Inflação do tecido pulmonar para manter o formato estrutural dos pulmões para histopatologia<ol>
<li>Após os procedimentos aprovados de eutanásia (por exemplo, dióxido de carbono a 30 - 70% de deslocamento do volume da câmara/min) são seguidos, proteja a carcaça do rato em uma placa de dissecação com pinos. Pulverizar ou aplicar 70% de etanol para manter a pele do rato fora do caminho durante a dissecação. NOTA: Asfixia por dióxido de carbono pode causar hemorragia pulmonar como lesão de fundo esperada, especialmente em taxas de fluxo mais lentas.</li>
		<li>Abra o tórax com uma incisão midline, estenda a incisão cranially/caudally através do peritônio, e corte o diafragma agarrando o processo xifoide.</li>
		<li>Usando um conjunto separado de tesouras para não entorpecer as lâminas, corte as costelas ao longo de cada lado do esterno e remova cuidadosamente a caixa torácica deixando espaço para os pulmões se expandirem.</li>
		<li>Isole a traqueia removendo glândulas salivares submandibulares e musculatura infra-ióide. Colocar pinos em ambos os lados da traqueia pode evitar movimentos indesejados durante a inserção da agulha.</li>
		<li>Encha uma seringa de 26 G com 2-3 mL de formalina tamponada neutra de 10% e insira na traqueia.</li>
		<li>Injete lentamente formalina e observe que os pulmões se expandam (geralmente requer ~1,5 mL de formalina).</li>
		<li>Uma vez que a formalina começa a vazar dos pulmões (evite a inflação), belisque a traqueia com um par de fórceps, remova a agulha da seringa e desprende todo o aparelho respiratório. Coloque pulmões, coração, etc. diretamente em formalina, pois o corte adicional de tecido pode ser feito após a fixação.</li>
		<li>Processamento completo, incorporação, secção de tecido e hematoxilina e eosina (H&E) de coloração usando métodos padrão.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise da carga do tumor pulmonar metastático<ol>
<li>Escaneie seções pulmonares manchadas de H&E em um scanner de slides de alta resolução a 40x de ampliação (Figura 3).</li>
		<li>Importar imagens em software de análise de imagens (por exemplo, Análise de Imagem visiopharm) para quantificação de metástases pulmonares. NOTA: Recomendamos que novos usuários obtenham treinamento no local ou online para usar o software de análise de imagens. Inúmeros webinars também estão disponíveis através da página comercial.</li>
		<li>Selecione o Aplicativo de Metástase pulmonar do Visiopharm 10118 H&E Na biblioteca de aplicativos do software. NOTA: O objetivo deste aplicativo é rotular e quantificar a metástase pulmonar em slides manchados de H&E. Como parte do Aplicativo de Metástase Pulmonar 10118, a primeira etapa de processamento de imagem segmenta o tecido pulmonar com o Aplicativo de Detecção de Tecidos. A segunda etapa de processamento de imagem usa o Aplicativo de Detecção de Metástase que identifica as metástases dentro do tecido pulmonar. Metástases são identificadas via forma juntamente com regiões que são muito desacompusadas, muito vermelhas ou muito esparsas para serem identificadas como metástases.</li>
		<li>Ajuste os parâmetros que definem a forma e a escassez para melhor se encaixar em imagens representativas. Áreas segmentadas de metástases tumorais e tecido pulmonar normal podem ser exibidas usando diferentes rótulos de cor para cada tipo de tecido. NOTA: No caso de o aplicativo não conseguir separar com precisão metástases do tecido pulmonar normal, um aplicativo personalizado usando o programa Visiopharm Decision Forest pode precisar ser escrito como foi feito para os experimentos (ver Figura 2 e Figura 3). Os detalhes para escrever um algoritmo personalizado seguem abaixo. Caso contrário, prossiga para a etapa 2.2.9.</li>
		<li>Abra o programa Floresta de Decisão, que funciona treinando várias classes [ou seja, tecido pulmonar (não neoplásico), metástases, glóbulos vermelhos, epitélio e/ou espaço branco] em uma imagem desejada. Na Figura 2, as metástases tumorais são azuis, o tecido normal é verde, e o epitélio bronquiolar é amarelo. Além disso, os glóbulos vermelhos estão em espaços vermelhos e de ar em rosa.</li>
		<li>Siga a série solicitada de perguntas sim ou não para treinar adequadamente cada Classe para uma imagem. A precisão do algoritmo determinará o número de perguntas sim/não. Para a análise, o algoritmo/aplicativo personalizado foi escrito com precisão definida para 50 (faixa 0-100).</li>
		<li>Ajuste recursos para cada classe aplicando filtros para afiar, desfocar, classificar por forma, etc. para melhorar a precisão do algoritmo/App. Visiopharm visualiza cada Classe através de uma ou várias lentes conhecidas como Recursos. As características mudam a forma como a Classe vê a imagem para trazer certas cores ou intensidades. NOTA: Para o algoritmo personalizado, metástases medindo 8500 μm2 ou mais são rotuladas e medidas como metástases. Isso explica a variância de tamanho e metástases muito pequenas para detectar. Pequenas áreas desalinhadas e pequenas áreas metastáticas abaixo de 8500 μm2 foram incluídas na quantificação normal do tecido.</li>
		<li>Salve as configurações modificadas do aplicativo ou do algoritmo personalizado e, em seguida, aplique o algoritmo/aplicativo a um conjunto inteiro ou série de tecidos manchados de H&E.</li>
		<li>Por fim, exporte todas as variáveis de produção, que incluem as listadas na Tabela 1. A área em mícrons ao quadrado (μm2) pode ser quantificada para cada tipo de tecido e as porcentagens são derivadas da área total do tecido líquido da amostra (ou seja, tecido total menos espaço aéreo).</li>
		<li>Ao criar um algoritmo personalizado, revise as marcações teciduais em consulta com um conselho de patologista veterinário certificado pelo American College of Veterinary Pathologists para garantir medidas precisas e diferenciar entre os tipos de tecidos.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+orthotopic+mouse+models+of+patient-derived+breast+cancer+brain+metastases+by+a+modified+intracarotid+injection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method.</a> Scientific Reports. 9 (1), 622(2019).</li>
<li>Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+for+treating+brain+metastases+from+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer.</a> Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).</li>
<li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Stereology+Applications+for+the+Pathologist%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Practical Stereology Applications for the Pathologist.</a> Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).</li>
<li>Aeffner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Microscopy%2C+Image+Analysis%2C+and+Virtual+Slide+Repository%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

À medida que os pesquisadores continuam a usar a injeção intravenosa de células tumorais como modelo experimental para metástase, faltam práticas padrão para analisar a carga tumoral metastática resultante. Em alguns casos, diferenças significativas na carga tumoral metastática após a manipulação de linhas celulares específicas e/ou uso de compostos químicos podem ser observadas macroscopicamente. No entanto, em outros casos, diferenças sutis na semeadura metastática e no crescimento podem ser negligenciadas ou mal inter...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.
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Katie A. Thies1,&#160;Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
to:
Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.

Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Apesar de ser um processo altamente complexo e ineficiente1, a metástase é um contribuinte significativo para a morbidade e mortalidade de pacientes com câncer2. De fato, a maioria das mortes relacionadas ao câncer é atribuída à disseminação metastática da doença3,4. Para que as células tumorais se metástasizem com sucesso, elas devem se desprender do local primário, invadir através do estroma adjacente, intravasar em circulação sanguínea ou linfáticos, viajar para o leito capilar de um local secundário, extravasar no tecido secundário e proliferar ou crescer para formar lesões metastáticas5. O uso de modelos de camundongos tem sido fundamental para promover a compreensão dos mecanismos moleculares responsáveis pela semeadura metastática e crescimento6,7. Aqui, focamos na metástase do câncer de mama, para a qual tanto modelos de camundongos geneticamente modificados quanto métodos de transplante são frequentemente utilizados – cada um com seu próprio conjunto de vantagens e limitações.
Modelos de tumor mamário geneticamente modificados fazem uso de promotores específicos da glândula mamária, incluindo MMTV-LTR (vírus tumoramático de camundongos longa repetição terminal) e WAP (Whey Acidic Protein), para impulsionar a expressão de transgenes no epitélio mamário8. Oncogenes incluindo antígeno T médio de polioma (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 e vírus símio 40 (SV40) foram expressos desta forma9,10,11,12,13, e embora esses modelos genéticos sejam úteis para estudar a iniciação e progressão do tumor primário, poucos prontamente metástases para órgãos distantes. Além disso, esses modelos genéticos de camundongos são muitas vezes mais tempo e custo proibitivos do que modelos de metástase espontânea ou experimental. Dada a limitação da maioria dos modelos de tumores mamários geneticamente modificados para estudar a metástase, as técnicas de transplante tornaram-se métodos atraentes para estudar esse processo complexo. Isso inclui ortotópica, veia traseira, intracardiac e injeção intracraniana de linhas celulares adequadas.
Embora várias linhas de células cancerígenas de mama prontamente metástases após a injeção ortotópica na almofada de gordura mamária14,15, a consistência e a reprodutibilidade da carga tumoral metastática podem ser um desafio, e a duração desses estudos pode ser na ordem de vários meses. Para avaliar a metástase pulmonar, em particular, a injeção intravenosa na veia traseira é muitas vezes um método mais reprodutível e eficaz com propagação metastática tipicamente ocorrendo dentro do período de algumas semanas. No entanto, uma vez que o modelo de injeção intravenosa contorna as etapas iniciais da cascata metastática, deve-se tomar cuidado na interpretação dos resultados desses estudos. Nesta demonstração, mostramos a injeção de veias traseiras de células tumorais mamárias, juntamente com um método de análise preciso e abrangente.
Embora a comunidade de pesquisa tenha feito progressos significativos na compreensão do complexo processo de metástase do câncer de mama, estima-se que mais de 150.000 mulheres tenham atualmente câncer de mama metastático16. Das pessoas com câncer de mama estágio IV, >36% das pacientes têm metástase pulmonar17; no entanto, o padrão específico do local e a incidência de metástases podem variar de acordo com o subtipo molecular18,19,20,21. Pacientes com metástases pulmonares associadas ao câncer de mama têm uma sobrevida mediana de apenas 21 meses, destacando a necessidade de identificar tratamentos eficazes e novos biomarcadores para esta doença17. O uso de modelos experimentais de metástase, incluindo a injeção intravenosa de células tumorais, continuará avançando nosso conhecimento sobre este importante desafio clínico. Quando combinadas com a patologia da imagem digital e o método de análise da carga de tumores pulmonares metastáticos descritos neste protocolo, as injeções de veias traseiras são uma ferramenta valiosa para a pesquisa de metástase do câncer de mama.

<table><tbody><tr><td>almofadas de preparação de álcool</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td>para limpar a cauda antes da injeção</tesoura ></td></tr> <tr><td>dissecação</td> forte <td>Fisher Scientific</td><td>08-951-5</td><td>para dissecção de camundongos e inflação do tecido pulmonar</td></tr><tr><td>DMEM com L-Glutamina, 4,5g/L de Glicose e Piruvato de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10013CV</td><td>base de meios de cultura celular para linhas celulares MDA-MB-231 e MVT1</td></tr><tr><td>Solução de sal tamponada com fosfato de Dulbecco 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21030CV</td><td>usado para ressuspender células tumorais para injeção</td></tr><tr><td>de etanol (solução a 70%)</td> <td>OSU</td><td></td><td>usado para minimizar a pele do camundongo durante a dissecção; use cuidado -</td></tr><tr><td>corante azul</td> inflamável <td>de Evan Millipore Sigma</td><td>E2129</td><td>utilizado a 1 % em PBS estéril para a prática com o método de injecção na veia da cauda; use cuidado - reagente</td></tr><tr><td>perigoso Soro bovino fetal</td><td>Millipore Sigma</td><td>F4135</td><td>aditivo de meios de cultura de células; usado a 10% em</td></tr><tr><td>pinças</td> DMEM <td>Fisher Scientific</td><td>10-270</td><td>para dissecção e insuflação do tecido pulmonar</td></tr><tr><td>Camundongos FVB/NJ</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>001800</td><td>cepa de camundongo singênico para células MVT1</td></tr><tr><td>hemacitômetro (Bright-Line)</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z359629</td><td>para uso em cultura de células para obter contagens de células</td></tr><tr><td>seringa de insulina (28 G)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td>para injeções na veia da cauda (BD 329424)</td></tr> <tr><td>Células MDA-MB-231</td> Linha <td>celular de câncer de mama humano</td><td>ATCC</td><td></td></tr><tr><td>Células</td><td></td><td></td> MVT1 células <td>de tumor mamário de camundongo</td></tr><tr><td>agulhas (26 G)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14-826-15</td><td>usado para inflar o mouse pulmões</td></tr><tr><td>formalina tamponada neutra (10%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245685</td><td>usado como fixador de tecido e para inflar tecido pulmonar; tenha cuidado - NOD de reagente perigoso</td></tr><tr><td>. Camundongos Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>005557</td><td>mantido pela OSUCCC Target Validation Recurso Compartilhado</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina 100x</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>gaze</td></tr><tr><td>estéril</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9379092</td><td>para aplicar pressão na cauda do camundongo se ocorrer sangramento</td></tr><tr><td>seringa (5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-458</td><td>usado para inflar o</td></tr><tr><td>contenor da veia da cauda</td> do tecido pulmonar do camundongo <td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>TV-150 STD</td><td>usado para conter o camundongo para injeções na veia da cauda</td></tr><tr><td>Azul de tripano (0,4%)</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>usado em cultura de células para avaliar a viabilidade</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25</td>%<td>ThermoFisher</td><td>25200-114</td><td>usado em cultura de células para separar células tumorais da placa</td></tr></tbody></table>

análise patológica da metástase pulmonar após injeção lateral de cauda-veia de células tumorais

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

A metástase, a principal causa de morbidade e mortalidade para a maioria dos pacientes com câncer, pode ser desafiadora para modelar preclinicamente em camundongos. Poucos modelos de metástase espontânea estão disponíveis. Assim, o modelo experimental de metástase envolvendo injeção de veias traseiras de linhas celulares adequadas é um pilar da pesquisa de metástase. Quando as células cancerígenas são injetadas na veia traseira lateral, o pulmão é seu local preferido de colonização. Uma limitação potencial dessa técnica é a quantificação precisa da carga do tumor pulmonar metastático. Enquanto alguns pesquisadores contam macrometastases de um tamanho pré-definido e/ou incluem micrometastases após a secção do tecido, outros determinam a área de lesões metastáticas em relação à área normal do tecido. Ambos os métodos de quantificação podem ser extremamente difíceis quando a carga metastática é alta. Aqui, demonstramos um modelo de injeção intravenosa de metástase pulmonar seguido de um método avançado para quantificar a carga do tumor metastático usando o software de análise de imagem. Esse processo permite a investigação de múltiplos parâmetros de ponto final, incluindo tamanho médio de metástase, número total de metástases e área total de metástase, para fornecer uma análise abrangente. Além disso, este método foi revisado por um conselho veterinário certificado pelo American College of Veterinary Pathologists (SEK) para garantir a precisão.

Se usar células não rotuladas para injeção de veias traseiras, pode ser difícil confirmar a colonização pulmonar até (1) o tempo de necropsia se macrometastases podem ser observadas ou (2) após análise histológica se existem metástases microscópicas. Com extensa carga de tumores pulmonares metastáticos, os camundongos terão a respiração trabalhada. Como em qualquer estudo de tumor, os camundongos devem ser cuidadosamente monitorados durante toda a duração do estudo. O uso de células rotuladas é uma maneira fácil de confi...

A injeção intravenosa de células cancerígenas é frequentemente usada em pesquisas de metástase, mas a carga tumoral metastática pode ser difícil de analisar. Aqui, demonstramos um modelo de injeção de veias traseiras de metástase e incluímos uma nova abordagem para analisar a carga do tumor pulmonar metastático resultante.

Análise patológica da metástase pulmonar após injeção lateral de cauda-veia de células tumorais

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Atualmente, não existe um padrão-ouro para analisar as cargas de tumor de pulmão metastático induzidas por injeção na veia da cauda. Utilizamos a análise de imagens digitais para quantificar com precisão e reprodutibilidade as metástases pulmonares de maneira altamente eficiente. Este método é eficaz em termos de tempo e custo.E, quando acoplado à análise de imagem digital, permite uma análise altamente precisa e abrangente da carga tumoral metastática pulmonar resultante. Para preparar células de câncer de mama humano para injeção, primeiro coloque um número apropriado de células em um meio de cultura celular adequado, com base no número de camundongos e na concentração de células a serem usadas. Quando as células atingirem uma confluência de 80 a 90%, lave as placas com PBS e solte as células em um volume mínimo de tripsina, de acordo com os protocolos padrão.Quando as células se separarem, ressuspendê-las em meio de cultura fresco para contagem e coletá-las por centrifugação. Em seguida, ressuspenda as células na concentração apropriada em 100 microlitros de PBS por camundongo, no gelo. Pouco antes da injeção, ressuspenda completamente as células no gelo para evitar aglomeração e carregue 100 microlitros das células em uma seringa de insulina de calibre 28.Mantendo a seringa na vertical, bata no eixo enquanto ajusta lentamente o êmbolo para remover quaisquer bolhas. Se permitido, retampe cuidadosamente a agulha e dobre a ponta da agulha em um ângulo de 20 a 30 graus. Prenda um camundongo fêmea com mais de seis semanas de idade em um limitador de plástico e posicione o mouse de lado de forma que sua veia lateral da cauda seja facilmente visualizada.Localize a artéria ventral alinhada com a genitália, uma veia dorsal e duas veias laterais do caudle e use um lenço umedecido asséptico para limpar a superfície da cauda. Segurando a cauda entre o dedo indicador e o polegar da mão não dominante, aplique uma leve tensão e, começando na porção distal da cauda, insira a agulha, com o lado chanfrado para cima, paralelo à veia. Entregue lentamente todo o volume de células na veia.Um pequeno volume de sangue provavelmente será deslocado após a injeção. Aplique uma leve pressão com uma gaze estéril no local da injeção. Em seguida, descarte a seringa em um recipiente apropriado para objetos cortantes e coloque o mouse em uma gaiola limpa e ventilada com monitoramento.No máximo uma hora após a injeção na veia da cauda, realize imagens in vivo de animais vivos para confirmar uma injeção de células bem-sucedida e obter dados de tempo zero. Para manter o formato estrutural dos pulmões para histopatologia, prenda o camundongo a uma placa de dissecação e molhe o pelo com etanol a 70%. Abra o tórax com uma incisão na linha média, estendendo a incisão cranial e caudalmente através do peritônio, e segure o processo xifóide para permitir a remoção do diafragma.Usando uma segunda tesoura, corte as costelas ao longo de cada lado do esterno e remova cuidadosamente a caixa torácica para deixar espaço para os pulmões se expandirem. Para isolar a traqueia, remova as glândulas salivares submandibulares e a musculatura infra-hióidea e coloque pinos em ambos os lados da traqueia para evitar movimentos indesejados durante a inserção da agulha. Carregue uma seringa de três mililitros, equipada com uma agulha de calibre 26, com dois a três mililitros de Formelina tamponada a 10% neutra e insira a agulha na traqueia.Injete lentamente a Formelina, enquanto observa a expansão dos pulmões. Assim que a formelina começar a vazar dos pulmões, use uma pinça para arrancar a traqueia e remover a agulha. Em seguida, retire todo o aparelho respiratório e coloque os órgãos diretamente em um recipiente de formelina fresca.Para análise da carga tumoral de pulmão metastática, escaneie seções de tecido pulmonar coradas com H & E em um scanner de lâminas de alta resolução com uma ampliação de 40 vezes e importe as imagens para um programa de software de análise de imagem apropriado. Ajuste os parâmetros que definem a forma e a dispersão para melhor se ajustar às imagens. Para exibir as áreas segmentadas de metástases tumorais e tecido pulmonar normal, usando rótulos coloridos diferentes para cada tipo de tecido, abra o programa Decision Forest e siga a série solicitada de perguntas sim ou não para treinar adequadamente cada classe para uma imagem.Para ajustar os recursos de cada classe, aplique filtros para aumentar a nitidez, desfocar ou classificar por forma para aumentar a precisão do algoritmo. Nesta análise, as metástases tumorais aparecem em azul. O tecido normal é verde e o epitélio bronquiolar é amarelo.Os glóbulos vermelhos podem ser observados em vermelho e os espaços aéreos aparecem em rosa. Quando todos os recursos tiverem sido definidos, salve as configurações modificadas e aplique o algoritmo a todo o conjunto ou série de tecidos corados com H&E. Em seguida, exporte todas as variáveis de saída para permitir que a área em mícron ao quadrado seja quantificada para cada tipo de tecido e para permitir o cálculo das porcentagens da área total do tecido líquido da amostra.A presença de um sinal de bioluminescência no espaço torácico menos de duas horas após a injeção na veia da cauda de células epiteliais de câncer de mama humano marcadas com luciferase pode ser considerada a confirmação de uma injeção precisa. Neste experimento, a contagem de fótons na região torácica aumentou ao longo do tempo e um forte sinal de bioluminescência ainda estava presente no dia 24 após a injeção. No momento da necropsia, muitas lesões pulmonares macroscópicas foram observadas nesses camundongos.Usando software de análise de imagem e um algoritmo personalizado, conforme demonstrado, todo o tecido pulmonar pode ser segmentado por diferentes características do tecido. Ao segmentar o tecido pulmonar dessa maneira, o software pode quantificar vários parâmetros. Aqui, são mostrados dados brutos de uma análise realizada no tecido pulmonar de camundongos injetados com células epiteliais humanas de câncer de mama seguidas de tratamento com um medicamento projetado para bloquear a colonização metastática.Conforme demonstrado por essas imagens, uma diferença na carga tumoral metastática entre esses grupos de tratamento pode ter sido facilmente negligenciada, pois o número total de nódulos pulmonares não é diferente. Uma análise abrangente de todos os parâmetros, no entanto, indicou uma diferença significativa na porcentagem da área líquida de metástase pulmonar, ressaltando a necessidade de uma abordagem completa para a análise da carga tumoral do pulmão metastático Uma ressuspensão celular adequada sem bolhas de ar é fundamental para prevenir embolias pulmonares, e uma insuflação pulmonar bem-sucedida ajuda a manter a integridade da estrutura do tecido para uma análise precisa da imagem. A imunomarcação do tecido pulmonar pode ser realizada para determinar a presença de células ou proteínas de interesse nas lesões pulmonares ou no microambiente pulmonar.

pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este artigo descreve os procedimentos de um ensaio de metástase experimental que é usado para determinar o potencial metastático de linhagens de células humanas de câncer.

Ensaio Metástase Experimental

Este vídeo descreve uma técnica de injeção de células cancerígenas marcadas usando injeção de veia da cauda em um modelo de camundongo. Além disso, monitoramos a formação e o crescimento de metástases de câncer de mama usando imagens de animais vivos in vivo em tempo real.

Injeção na veia da cauda: um método para administrar células cancerígenas para estudos metastáticos em um modelo de camundongo

Neste vídeo, as células do melanoma são injetadas por via intravenosa através da veia da cauda no modelo de camundongo. As células do melanoma viajam ainda mais pelo sistema circulatório, adaptando-se ao microambiente distante e causando metástases em órgãos como os pulmões.

Modelo experimental de camundongo com melanoma metastático: uma plataforma para estudar o potencial metastático de células de melanoma nos pulmões

Este manuscrito descreve um método para quantificar o acúmulo de células de tumor nos pulmões em um modelo animal de metástases de tumor.

Ensaio de recrutamento de células de Tumor de pulmão

A metástase desempenha um papel profundo na virulência do câncer, sendo responsável por cerca de 90% das mortes.  Relatamos um protocolo para um modelo de melanoma metastático em camundongos que é útil para determinar a eficácia de agentes terapêuticos contra esse fenômeno clínico.

Injeção de células Singênico Murino melanoma para determinar o seu potencial metastático nos pulmões

Um procedimento cirúrgico foi desenvolvido para entregar células tumorais mamárias ao fígado murino por meio de injeção na veia porta. Este modelo permite a investigação de estágios tardios de metástase hepática em um hospedeiro totalmente imunocompetente, incluindo extravasamento de células tumorais, semeadura, sobrevivência e crescimento metastático no fígado.

Um modelo de injeção da veia porta para o Estudo do Fígado metástase do câncer de mama

O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição detalhada do protocolo para o ensaio de metástase pulmonar (PuMA). Este modelo permite aos pesquisadores estudar o crescimento de células metastáticas osteossarcoma (OS) no tecido pulmonar, usando um widefield fluorescência ou microscópio confocal de varredura a laser.

Considerações práticas em estudar a colonização de pulmão metastático em osteossarcoma usando o ensaio de metástase pulmonar

Um modelo animal é necessário decifrar o papel de células tumorais (CTC) em promover a colonização de pulmão durante a metástase do cancro em circulação. Aqui, nós estabelecemos e realizou com sucesso um na vivo do ensaio para teste especificamente a exigência de assembly de fibronectina poliméricos (polyFN) na CTC para a colonização de pulmão.

O estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de Tumor nos tecidos do pulmão de circulação

A abordagem descrita combina ensaios experimentais de metástase da veia da cauda com imagens de animais vivos in vivo in vivo para permitir o monitoramento em tempo real da formação e crescimento da metástase do câncer de mama, além da quantificação do número e tamanho da metástase nos pulmões.

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

Descrevemos um modelo de metástase cerebral de câncer de mama em camundongos xenoenxerto gerada por injeção na veia caudal de uma linhagem de células inflamatórias de câncer de mama amplificadas endogenamente por HER2.

Modelando Metástase Cerebral Via Injeção Venosa Caudal de Células Inflamatórias de Câncer de Mama

O manuscrito descreve uma metodologia para o estabelecimento, bem como o monitoramento longitudinal do crescimento de metástases pulmonares espontâneas de tumores de mama injetados ortotopicamente, passíveis de intervenção em todos os estágios da cascata metastática.

In vivo Imagem para medir metástase pulmonar espontânea de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

Aprenda a analisar metástases pulmonares após injeção lateral de cauda-veia em modelo de câncer de mama. Este método utiliza análise digital de imagens para quantificar com precisão a carga tumoral metastática de forma reprodutível e econômica.

Análise patológica da metástase pulmonar após injeção lateral de cauda-veia de células tumorais

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