Name: Dissecção, imuno-histoquímica e montagem de cérebros de larvas e adultos de Drosophila para visualização do lobo óptico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprenda a dissecar, realizar imuno-histoquímica e montar cérebros de larvas e adultos de Drosophila para visualização do lobo óptico. Este protocolo padronizado melhora a clareza da imagem em neurociência.

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Gostaríamos de agradecer a Claude Desplan por compartilhar conosco uma alíquota do anticorpo Bsh. Os anticorpos monoclonais DE-Cadherin, Dachshund, Eyes Absent, Seven-up e Bruchpilot foram obtidos do Developmental Studies Hybridoma Bank, criado pelo NICHD do NIH e mantido na Universidade de Iowa, Departamento de Biologia, Iowa City, IA 52242. Este trabalho foi apoiado por um NSERC Discovery Grant concedido a T.E.. A UA é apoiada por uma bolsa de pós-graduação NSERC Alexander Graham Bell Canada. PV é apoiado por uma bolsa de estudos de pós-graduação de Ontário.

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<li>Ting, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+dendritic+morphology+in+columns+and+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analyzing dendritic morphology in columns and layers.</a> Journal of Visualized Experiments. , e55410(2017).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Neste protocolo, descrevemos um método para imunocorar cérebros de larvas e adultos de Drosophila e montá-los em várias orientações. Embora os métodos para corar cérebros larvais e adultos tenham sido descritos anteriormente22 , 23 , 24 , 27 , 28 , as estratégias de montagem para a visualização ideal de estruturas específicas do lobo óptico receberam ...

O sistema visual da Drosophila, composto pelo olho composto e pelo lobo óptico subjacente, tem sido um excelente modelo para o estudo do desenvolvimento e função do circuito neural. Nos últimos anos, o lobo óptico, em particular, emergiu como um sistema poderoso para estudar processos de neurodesenvolvimento, como neurogênese e fiação de circuitos 1,2,3,4,5,6,7,8. É composto por quatro neurópilos: lâmina, medula, lóbula e placa lobular (as duas últimas compõem o complexo lobular)1,2,3,4,5,6. Os fotorreceptores do olho têm como alvo os neurônios da lâmina e da medula, que processam as entradas visuais e as transmitem aos neurópilos do complexo do lóbulo 1,2,3,4,5,6. Os neurônios de projeção no complexo lobular subsequentemente enviam informações visuais para os centros de processamento de ordem superior no cérebro central 1,5,9. A complexa organização do lobo óptico, necessária pela necessidade de manter a retinotopia e processar diferentes tipos de estímulos visuais, torna-o um sistema atraente para estudar como circuitos neurais sofisticados são montados. Notavelmente, a medula compartilha semelhanças impressionantes em sua organização e desenvolvimento com a neurorretina, que há muito é um modelo para o desenvolvimento do circuito neural de vertebrados 3,8.
O desenvolvimento do lobo óptico começa durante a embriogênese, com a especificação de ~ 35 células ectodérmicas que formam o placódio óptico 2,4,5,6,7,8. Após a eclosão larval, o placódio óptico é subdividido em dois primórdios distintos: 1) o centro de proliferação externo (OPC), que gera os neurônios da lâmina e da medula externa e 2) o centro de proliferação interno (IPC), que gera neurônios da medula interna e do complexo da lóbula 4,5,6,10 . Na larva do segundo ínstar tardio, as células neuroepiteliais do OPC e IPC começam a se transformar em neuroblastos que subsequentemente geram neurônios por meio de células-mãe ganglionares intermediárias 4,5,11,12. Os neuroblastos do lobo óptico são padronizados por fatores de transcrição espacial e temporalmente restritos, que atuam juntos para gerar diversidade neural em sua progênie 11,12,13,14. Na pupa, os circuitos dos neurópilos do lobo óptico são montados por meio da coordenação de vários processos, incluindo morte celular programada 11,15, migração neuronal12,16, direcionamento axonal / dendrítico10,17, formação de sinapses18,19 e rotações do neurópilo10,17.
Aqui, descrevemos a metodologia pela qual os cérebros larvais e adultos são dissecados, imunomarcados e montados para imagens do lobo óptico. Dada a sua complexa organização tridimensional, a análise do lobo óptico requer que se entenda como seus neurópilos adultos e progenitores larvais estão posicionados em relação uns aos outros e ao cérebro central. Assim, colocamos ênfase especial em como a orientação da montagem se relaciona com a organização espacial das estruturas do lobo óptico. Descrevemos três estratégias de montagem para cérebros larvais (anterior, posterior e lateral) e três para cérebros adultos (anterior, posterior e horizontal), cada uma das quais fornece um ângulo ideal para imagens de uma população progenitora específica do lobo óptico ou neurópilo.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>Bioshop</td><td>PBS405</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldeído</td><td>Bioshop</td><td>FOR201</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (cabra) secundário</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td>uso em 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 (camundongo) secundário</td><td>Invitrogen</td><td>A-31570</td><td>uso em 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (cobaia) secundário</td><td>Invitrogen</td><td>A-21450</td><td>uso em 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (rato) secundário</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td>use a 1:500</td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de dissecação - #5</td><td>Dumont</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de dissecação - #55</td><td>Dumont</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Prato de dissecação</td><td>Corning</td><td>722085</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes secos</td><td>Kimbery Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo primário anti-Bgal de cabra</td> Uso de <td>biogênese</td><td></td><td>a 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo primário anti-Bsh de cobaia</td><td>Presente de Claude Desplan</td><td></td><td>uso a 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo primário anti-Vsx1 de cobaia</td><td>Erclik et al. 2008</td><td></td><td>uso a 1:1000</td></tr><tr><td>Filme de laboratório</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de</td> <td>microcentrífugaSarstedt</td><td>72.706.600</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>VWR</td><td>CA4823-180</td><td></td></tr><tr><td>Estudos de desenvolvimento de anticorpo primário anti-dac de camundongo</td> Banco de <td>hibridoma (DSHB)</td> <td>mabdac2-3</td><td>em 1:20</td></tr><tr><td>Anticorpo primário anti-eya de camundongo</td><td>DSHB</td><td>eya10H6</td><td>uso em 1:20</td></tr><tr><td>Anticorpo primário anti-nc82 de camundongo</td><td>DSHB</td><td>nc82</td><td>uso em camundongo 1:50</td></tr><tr><td> anticorpo primário anti-svp</td><td>DSHB</td><td>Uso de 2D3 de sete para cima</td><td>a 1:100</td></tr><tr><td>Argila de polímero</td><td>Qualquer tipo de argila pode ser usado</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coelho anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A-11122</td><td>uso a 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo primário anti-DE-caderina de rato</td><td>DSHB</td><td>DCAD2</td><td>uso a 1:20</td></tr><tr><td>Meio de montagem Slowfade</td><td>Invitrogen</td><td>S36967</td><td>O meio de montagem Vectashield (cat# H-1000) também pode ser usado</td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td></td></tr></tbody></table>

dissecção, imuno-histoquímica e montagem de cérebros de larvas e adultos de drosophila para visualização do lobo óptico

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

O lobo óptico de Drosophila , composto por quatro neurópilos: lâmina, medula, lóbula e placa de lóbula, é um excelente sistema modelo para explorar os mecanismos de desenvolvimento que geram diversidade neural e conduzem a montagem do circuito. Dada a sua complexa organização tridimensional, a análise do lobo óptico requer que se entenda como seus neurópilos adultos e progenitores larvais estão posicionados em relação uns aos outros e ao cérebro central. Aqui, descrevemos um protocolo para dissecção, imunocoloração e montagem de cérebros larvais e adultos para imagens do lobo óptico. Ênfase especial é colocada na relação entre a orientação de montagem e a organização espacial do lobo óptico. Descrevemos três estratégias de montagem na larva (anterior, posterior e lateral) e três no adulto (anterior, posterior e horizontal), cada uma das quais fornece um ângulo de imagem ideal para uma estrutura distinta do lobo óptico.

Imagens confocais de lobos ópticos larvais e adultos montados nas orientações descritas no protocolo são apresentadas na Figura 1 e na Figura 2.
A Figura 1 mostra esquemas e fatias confocais representativas de cérebros larvais posicionados nas orientações anterior, posterior e lateral. Na orientação de montagem anterior, o epitélio OPC (DE-Cadherin), neuroblastos medulares (deadpan&gt;βgal) e neu...

Este protocolo descreve três etapas para preparar os lobos ópticos de larvas e adultos de Drosophila para imagem: 1) dissecções cerebrais, 2) imuno-histoquímica e 3) montagem. A ênfase é colocada na etapa 3, pois são necessárias orientações de montagem distintas para visualizar estruturas específicas do lóbulo óptico.

Dissecção, imuno-histoquímica e montagem de cérebros de larvas e adultos de Drosophila para visualização do lobo óptico

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

Descrevemos um protocolo para dissecar, imunomarcar e montar cérebros de larvas e adultos de Drosophila com ênfase especial nos lobos ópticos. Dada a complexa organização tridimensional do lobo óptico, prevê-se que o protocolo descrito aqui forneça aos pesquisadores uma maior compreensão da relação entre a orientação de montagem e as estruturas do lobo óptico visualizadas. Este protocolo descreve três estratégias de montagem para lobos ópticos larvais e adultos, cada uma das quais fornece um ângulo ideal para visualizar uma estrutura específica do lobo óptico durante a imagem.Antes de iniciar a dissecação, encha todos os poços de uma placa de três poços com 400 microlitros de PBS por poço e use uma pinça para selecionar suavemente 15 larvas de terceiro ínstar errantes rastejando no interior de um frasco ou garrafa de drosófila. Coloque todas as larvas no primeiro poço da placa de três poços e transfira uma larva para o poço do meio da placa. Usando a mão não dominante, prenda o corpo da larva na base do poço e use a mão dominante para segurar suavemente o gancho da boca da larva.Puxe o gancho da boca para longe do corpo para remover o cérebro. Em seguida, remova os tecidos acessóri

dissection-immunohistochemistry-mounting-larval-adult-drosophila

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Aqui nós descrevemos um protocolo para analisar a migração de células gliais no olho Drosophila desenvolvimento, utilizando análise microscópica ao vivo emparelhado com GFP tag células gliais.

Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

Dissecção e imunohistoquímica de larvas, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

Este vídeo descreve um método de montagem de cérebros intactos de moscas adultas sob uma lâmina de ponte e mostra o protocolo realizado em cérebros imunomarcados para microscopia fluorescente.

Montagem de cérebros de Drosophila adulta: um método para preparar lâminas para imagens confocais

A imunocoloração é uma técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células e proteínas dentro dos tecidos. Ao utilizar a sonicação, o protocolo descrito aqui alivia a necessidade de dissecar tecidos de Drosophila melanogaster de embriões e larvas em estágio avançado antes da imunocoloração. Fornecemos uma metodologia eficiente para a imunocoloração de larvas de montagem inteira fixadas em formaldeído.

Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos<em&gt; In Situ</em

Este protocolo detalha um método simplificado utilizado para conduzir imagem de células vivas, no contexto de um cérebro de larvas intacta. Abordagens imagens de células vivas são de valor inestimável para o estudo de células-tronco neurais divisões assimétricas, bem como outros processos neurogênicas e de desenvolvimento, de forma consistente descobrir mecanismos que anteriormente eram negligenciados.

Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

As estruturas adultas de Drosophila são derivadas de estruturas semelhantes a sacos chamadas discos imaginais. A análise desses discos fornece informações sobre muitos processos de desenvolvimento, incluindo determinação de tecidos, estabelecimento de limites de compartimentos, proliferação celular, especificação do destino celular e polaridade celular planar. Este protocolo é usado para preparar discos imaginais para microscopia de luz / fluorescente.

Dissecção e Imunocoloração do Imaginário discos de Drosophila melanogaster

O adulto de Drosophila cérebro é um sistema valioso para estudar circuitos neuronais, funções cerebrais superiores, e doenças complexas. Um método eficiente para dissecar tecido do cérebro inteiro do cabeça pequena mosca facilitará estudos baseados em cerebrais. Aqui nós descrevemos um de uma etapa simples protocolo, dissecação de cérebros adultos com morfologia bem preservada.

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

Este protocolo descreve a dissecção e imunocoloração de adultos Drosophila melanogaster tecidos do cérebro. Especificamente, este protocolo destaca o uso da Drosophila cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios como subconjuntos neuronal de exemplo que podem ser usados com precisão para descobrir princípios gerais subjacentes a muitos aspectos do desenvolvimento neuronal.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Este trabalho apresenta um método cirúrgico para dissecando Drosophila pupal retina juntamente com protocolos para o processamento de tecido para extração de RNA, análise ocidental e imuno-histoquímica.

Dissecação da Retina Pupal drosófila para imuno-histoquímica, análise ocidental e isolamento de RNA

Este estudo apresenta um protocolo simplificado para processamento de tecidos envolvendo decapitação, fixação, criosecção, coloração de fluorescência, imunocoloração e imagem, que pode ser estendido para imagens confocais e multifotônicas. O método mantém uma eficácia comparável a dissecções complexas, ignorando a necessidade de habilidades motoras avançadas. A análise quantitativa de imagens fornece amplo potencial investigativo.

Crioseccionamento direto de cabeças de Drosophila para coloração e imunocoloração aprimoradas de fluorescência cerebral

Aprenda a dissecar, realizar imuno-histoquímica e montar cérebros de larvas e adultos de Drosophila para visualização do lobo óptico. Este protocolo padronizado melhora a clareza da imagem em neurociência.

Dissecção, imuno-histoquímica e montagem de cérebros de larvas e adultos de Drosophila para visualização do lobo óptico

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