Amostragem e Cultivo Simplificado da Larvacean Cosmopolita Pelagic, Oikopleura dioica
16 de junho de 2020
Oikopleura dioica é um organismo modelo tunicate em vários campos da biologia. Descrevemos métodos de amostragem, identificação de espécies, configuração de cultivo e protocolos de cultivo para os animais e alimentação de algas. Destacamos fatores-chave que ajudaram a fortalecer o sistema cultural e discutir os possíveis problemas e resoluções.
Este protocolo demonstra visualmente como estabelecer um sistema de cultura confiável e de longo prazo para o tunicate pelagic marinho Oikopleura dioica. O sistema cultural Oikopleura fornece os recursos básicos para investigar uma ampla gama de campos biológicos relacionados à ecologia, desenvolvimento, genômica e evolução. Esta espécie tem um curto ciclo de vida, alta fecundidade, e pode ser facilmente coletada da costa, tornando-se um excelente organismo modelo.
Embora este protocolo seja otimizado para o O.dioica, esperamos que possa ser aplicado a outros organismos planctônicos. Para começar, inicie alimentos algas para sustentar a cultura Oikopleura, começando pela autoclavagem da água do mar filtrada. Para iniciar uma cultura de estoque de Chaetoceros calcitrans, 60 mil de água do mar autoclaved foram complementados com os seguintes:30 microliters de vitaminas, 30 microliters de solução A, 15 microliters de silicato de sódio e 60 microliters de estreptomicina.
Finalmente, 30 microliters de C.calcitrans de uma cultura de ações anterior foi adicionado como um inoculante. Consulte a tabela dois no manuscrito sobre volumes de suplemento e inoculação para as outras espécies de algas e tipos de cultura. Após a inoculação, o estoque e as subculturas são mantidos em uma incubadora a 17 graus Celsius com iluminação contínua.
Após aproximadamente 10 dias, o crescimento de algas é confirmado pelos frascos que se tornam coloridos. Quando isso ocorrer, mova as culturas de estoque para o armazenamento de longo prazo a quatro graus Celsius por até um mês, mantendo a subcultura na mesma incubadora. Para criar uma cultura de trabalho, adicione suplementos necessários a 400 mil de água do mar autoclavada e inoculado com 100 mils da subcultura anterior.
Sele o frasco com uma tampa de borracha, insira uma pipeta descartável de um mil e mova-os para uma estação de algas e mantenha-os em temperatura ambiente com um fotoperíodo de oito horas e uma aeração constante. Manualmente redemoinho culturas algas duas vezes ao dia para evitar a agregação na parte inferior do frasco. Uma vez estabelecidas as culturas algas, colete amostras de campo em um local local.
Lance uma rede de plâncton, e permita que a extremidade do bacalhau afunde de um a dois metros abaixo da superfície. Reboque a rede a uma velocidade de aproximadamente 5 a 1 metros por segundo. Continue rebocando para frente e para trás por entre dois e cinco minutos.
O tempo de reboque deve ser ajustado de acordo com a abundância de plâncton no local. Após o reboque, levante cuidadosamente a rede e transfira lentamente o conteúdo da extremidade do bacalhau para uma garrafa de vidro de 500 mil. Encha a garrafa na borda para evitar bolhas de ar que possam causar estresse aos animais durante o transporte.
Nesta fase, a presença de Oikopleura pode ser confirmada visualizando as garrafas de amostra em um fundo escuro. No entanto, a observação microscópica é necessária para identificação do nível das espécies. Repita este processo até que três garrafas de 500 mil tenham sido coletadas.
Colete água do mar superficial para registrar salinidade, temperatura e concentração de clorofila com um perfil CTD. Além disso, recolher de 10 a 15 litros de água do mar no local para ajudar a aclimatar os animais em condições laboratoriais. Para aclimatar os animais, prepare uma proporção de água do mar superficial do local da amostra e a água do mar filtrada mantida em laboratório.
O volume final deve ser ajustado para entre cinco a 10 litros, dependendo da concentração da amostra de plâncton. Adicione cuidadosamente a amostra de 500 mil ao béquer preparado. Usando uma pá presa a um motor síncrono girando a 15 RPM, mantenha o plâncton em suspensão durante a noite.
Na manhã seguinte, verifique a presença de Oikopleura de olho. Transfira os animais para uma placa de Petri, e observe sob um microscópio de campo escuro definido entre a ampliação de 20 a 40 vezes para uma identificação positiva. Oikopleura são caracterizados como animais em forma de girino ondulando suas caudas dentro de uma casa translúcida.
Para confirmar o O.dioica, procure machos totalmente maduros com gônados amarelos ou fêmeas com ovos. Se os animais forem imaturos, procure a presença de duas células subcorrdais na metade distal da cauda. Estes estão presentes em animais maduros e imaturos.
Uma vez confirmada a espécie, transfira-as para uma nova placa de Petri. Repita este processo até que 10 a 20 indivíduos tenham sido confirmados a nível de espécies. Se não for encontrado O.dioica, mantenha o béquer mexendo por mais um dia ou dois.
Pequenas O.dioica que inicialmente não eram observáveis continuarão a crescer e se tornarão mais fáceis de ver. Se nenhum aparecer após uma semana, descarte a amostra e tente a amostragem novamente. Para estabelecer uma monocultura, isole 120 O.dioica de uma amostra de campo em cinco litros de água do mar filtrada.
Na manhã seguinte, procure machos totalmente maduros identificados por gônados amarelos e por fêmeas com ovos que pareçam como esferas douradas cintilantes. Prepare um béquer de desova transferindo suavemente 15 machos e 30 fêmeas com uma pipeta de cinco mil e sem cortes para um béquer contendo 2,5 litros de água do mar filtrada. Para minimizar o estresse físico durante a transferência manual, solte lentamente os animais sob a superfície da nova água do mar.
Permitir que adultos isolados desovam naturalmente. Após a desova, a fertilização bem sucedida pode ser confirmada extraindo de 5 a 10 mil de água do mar do fundo do béquer de desova e identificando ovos com decotes sob um microscópio. Na primeira manhã após a desova, primeiro dia, uma nova geração de animais jovens com casas infladas deve aparecer no béquer.
Use um béquer portátil de 500 mil para transferir os animais suavemente para um novo béquer contendo 7,5 litros de água do mar fresca e filtrada. Despeje lentamente o conteúdo na superfície para minimizar a turbulência e as forças de cisalhamento. Na segunda manhã após a desova, segundo dia, transfira manualmente 150 animais para um novo béquer contendo cinco litros de água do mar fresca e filtrada.
Na terceira manhã pós-desova, terceiro dia, transfira manualmente 120 animais para um novo béquer com cinco litros de água do mar fresca e filtrada. Até o quarto dia, animais adultos sexualmente maduros devem estar presentes. Colete 15 machos e 30 fêmeas para um novo béquer de desova com 2,5 litros de água do mar filtrada para iniciar a próxima geração.
Esse processo é repetido e mantido para a vida da cultura. Para manter uma monocultura de O.dioica, a algal é preparada diariamente a partir de culturas de trabalho. Os animais são alimentados três vezes por dia.
Prepare alimentos diários medindo a absorção da cultura de trabalho usando um espectotômetro fixado em 660 nanômetros. Valores de absorção, volumes de cultura O.dioica e maturidade animal são colocados em uma planilha preparada com base em uma curva de crescimento de algas previamente determinada para calcular o volume exato de algas necessárias para a alimentação do dia. Pipeta os volumes calculados em tubos de 50 mil, e centrífuga a 5.000g por cinco minutos em temperatura ambiente.
Despeje lentamente sobrenaante, e cuidadosamente pipeta para cima e para baixo para resuspend as algas pelleted. Reabastecer os tubos ao seu volume original com água do mar fresca e filtrada. Com base no gráfico diário de alimentação de algas da planilha, alimente a quantidade especificada para cada béquer às 9:00.m.
12 p.m. e 17h.m. Uma bomba de dosagem automatizada pode ser configurada para alimentar os animais a 5 p.m.
nos fins de semana sem a presença de funcionários de cultivo. Após cada alimentação, mantenha o alimento de algas preparados a quatro graus Celsius até estar pronto para ser usado para a próxima ração. O.dioica pode ser coletado de um porto pelo reboque suave de uma rede de plâncton modificada equipada com malha de 100 mícrons e uma extremidade de bacalhau não filtrante.
A amostragem entre 2015 e 19 mostrou variação sazonal na presença de O.dioica nos portos de Okinawa. A temperatura da água do mar parecia influenciar a presença dos animais. O.dioica dominou quando a temperatura da água do mar era de 28 graus ou mais.
O.dioica coexistiu com Oikopleura longicauda a temperaturas entre 24 e 27 graus. No entanto, O.longicauda dominou a temperaturas abaixo de 23 graus. As mudanças na salinidade não se correlacionam com a abundância de O.dioica.
Os três fatores mais importantes para o estabelecimento de sistemas de cultura O.dioica estáveis são manter a alta qualidade da água com um sistema de filtragem de várias etapas, identificando um regime de alimentação ideal, de preferência criando curvas padrão de algas, e preparação de béquers desova com número suficiente de machos e fêmeas. Seguindo o protocolo fornecido, o ciclo de vida da O.dioica é de quatro dias a 23 graus. Estabelecemos de forma confiável seis populações independentes de O.dioica, todas elas durando mais de 20 gerações.
Em conclusão, estabelecer uma cultura estável de O.dioica pode ser feito de forma rápida e econômica. Com uma configuração adequada, uma cultura estável pode ser alcançada dentro de uma semana. Em conjunto com seu pequeno genoma e ciclo de vida rápido, isso faz da O.dioica uma poderosa espécie modelo de chordate.
O.dioica pode ser mantido em água do mar artificial e natural. O armazenamento a longo prazo de alimentos algas é possível usando cultura sólida e criopreservação. Além disso, o esperma de O.dioica também pode ser criopreservado e permanecer viável por mais de um ano.
O.dioica continua fornecendo informações poderosas sobre vários campos biológicos. Uma compreensão da sazonalidade local, um sistema de cultura meticuloso e alguns indivíduos dedicados permitem que a cultura eficaz seja estabelecida com pouco esforço.
Visão Geral
Este artigo detalha o estabelecimento de um sistema de cultivo confiável para o tunicado marinho Oikopleura dioica, um organismo modelo para diversos estudos biológicos. Ele descreve métodos de coleta, identificação da espécie e protocolos de cultivo, enfatizando fatores-chave para a manutenção bem-sucedida do cultivo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia marinha
- Ecologia
- Biologia do desenvolvimento
Contexto
- Oikopleura dioica é um tunicado com um ciclo de vida curto e alta fecundidade.
- Pode ser facilmente coletado em ambientes costeiros.
- Esta espécie serve como um excelente modelo para o estudo de diversos processos biológicos.
- Protocolos otimizados podem beneficiar outros organismos planctônicos.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para o cultivo de Oikopleura dioica.
- Facilitar pesquisas em ecologia, desenvolvimento, genômica e evolução.
- Aprimorar a compreensão dos sistemas de cultivo de organismos marinhos.
Métodos Utilizados
- Preparação de alimento de algas utilizando água do mar autoclavada e suplementos específicos.
- Coleta de amostras de campo usando redes de plâncton.
- Identificação microscópica de Oikopleura dioica.
- Estabelecimento de culturas monoclonais por meio de protocolos cuidadosos de transferência e desova.
Resultados Principais
- Estabelecimento bem-sucedido de um sistema de cultura de longo prazo para Oikopleura dioica.
- Métodos de identificação confirmaram a presença e maturidade da espécie.
- Foram desenvolvidos protocolos para desova e manutenção de culturas.
- Foram fornecidas diretrizes para aclimatização e manutenção de culturas.
Conclusões
- O estudo apresenta uma abordagem abrangente para o cultivo de Oikopleura dioica.
- Os achados podem ser aplicados a outras espécies planctônicas.
- O estabelecimento de sistemas de cultivo confiáveis é crucial para pesquisas biológicas futuras.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de sistemas de cultivo confiáveis para organismos modelo marinhos como Oikopleura dioica apoia a validação inicial de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta biofarmacêutica. O ciclo de vida rápido da espécie, as vias de desenvolvimento conservadas e a facilidade genômica permitem triagens fenotípicas em alta produtividade e estudos translacionais de biomarcadores. Este fluxo de trabalho fornece uma plataforma escalável e reprodutível para avaliar os efeitos de compostos em um sistema relevante para doenças, reduzindo a incerteza biológica antes da otimização do composto líder.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias de desenvolvimento conservadas em cordados e redes regulatórias de genes relevantes para mecanismos de doenças humanas.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio da fenotipagem rápida de perturbações genéticas ou farmacológicas em um contexto de organismo inteiro.
- Valor Preditivo: Facilita a redução de riscos mecanicistas ao associar a modulação de alvos a resultados fenotípicos ou comportamentais observáveis em um modelo geneticamente manipulável.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão para ensaio: Fornece um sistema biológico padronizado e quantificável para o preparo de placas de triagem de compostos com estadiamento desenvolvimental consistente.
- Escalabilidade: A alta fecundidade e a fertilização externa permitem a coleta em larga escala de embriões para ensaios fenotípicos baseados em placas de múltiplos poços.
- Reprodutibilidade: Regimes alimentares definidos e controles ambientais reduzem a variabilidade, favorecendo a padronização de ensaios entre equipes e locais diferentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Vias conservadas de apoptose, metabolismo e sinalização permitem a modelagem de fenótipos de doenças humanas para confirmação de alvos.
- Continuidade Translacional: Permite a progressão da validação de alvos promissores até testes de eficácia pré-clínicos em um sistema cordado com ferramentas genômicas.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Permite a avaliação precoce da toxicidade de compostos e do mecanismo de ação, orientando decisões de avanço ou interrupção antes de estudos em mamíferos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O sistema de cultivo de Oikopleura dioica integra-se a fluxos de trabalho de descoberta precoce, apoiando a validação de alvos por meio de triagem fenotípica e acompanhamento mecanicista antes da identificação de compostos líderes e do desenvolvimento pré-clínico.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses sobre função gênica e atividade de vias por meio de fenótipos observáveis em um modelo de cordado vivo.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e de alto conteúdo, como morfologia, motilidade e repórteres de fluorescência, para avaliação dos efeitos de compostos.
- Análises: Permite imagens com lapso de tempo, análise automatizada de imagens e comparação estatística entre populações tratadas e controles.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais sobre mecanismos de ação à validação pré-clínica por meio de vias conservadas relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um recurso biológico renovável e de baixa manutenção para campanhas repetidas de triagem e projetos de validação de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista em um modelo de cordado geneticamente acessível.
- Valor Operacional: Oferece padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio de protocolos definidos de alimentação, desova e manutenção de cultivo.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de prosseguimento ou interrupção do projeto e a eficiência do capital ao permitir a redução precoce de riscos biológicos.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos com base na validação fenotípica em um sistema de organismo inteiro.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em manejo de invertebrados marinhos, microscopia e técnicas de cultivo de algas.
- Requer acesso a incubadoras, espectrofotômetros para quantificação de algas e sistemas de filtração estéril para o preparo de água do mar.
- Exige padronização entre equipes nos horários de alimentação, controles ambientais e procedimentos de manipulação dos animais.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes pontos experimentais, como imagens de fluorescência ou ensaios comportamentais.
- Inclui limitações práticas, como a disponibilidade sazonal em amostragens de campo e a necessidade de produção contínua de alimento algal.
