2D-HELS MS Seq: Um método geral baseado em LC-MS para sequenciamento direto e de novo de misturas de RNA com diferentes modificações de nucleotídeos
10 de julho de 2020
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para um método de sequenciamento baseado em LC-MS que pode ser usado como um método direto para sequenciar RNA curto (<35 nt por execução) sem um intermediário de cDNA e como um método geral para sequenciar diferentes modificações de nucleotídeos em um único estudo com precisão de base única.
Este protocolo cobre todas as etapas essenciais necessárias ao usar o novo método desenvolvido para sequenciar diretamente o RNA, independentemente de a amostra de RNA ser de fita simples, mista ou modificada. O método não é afetado por erro enzimático ou complementaridade de bases. Ele fornece um fluxo de trabalho direto e uma solução geral que possibilita sequenciar diferentes modificações de RNA simultaneamente, em vez de uma modificação específica por vez.
Essa tecnologia pode ser desenvolvida em uma ferramenta de diagnóstico para determinar segmentos de RNA de assinatura para relacioná-la a doenças humanas e uma ferramenta precisa para estudar modificações de RNA no nível epitranscriptômico. O método não depende de nenhum método de sequenciamento anterior. Em vez disso, é uma abordagem completamente nova e pretendemos torná-la o método ideal para sequenciar qualquer RNA modificado.
Algumas partes deste protocolo contêm aspectos críticos que podem ser transmitidos com mais precisão por demonstração visual, como rotular a 3'extremidade da aquisição de dados de RNA LC-MS e a análise de dados pelo software MassHunter. Vou demonstrar esse procedimento e configurar o LC-MS e medir nossas amostras de RNA. Para realizar uma reação de marcação em uma etapa, combine 2 microlitros de 150 microlitros de AppCp-biotina micromolar, 3 microlitros de tampão de reação de ligase 10x, 1,5 microlitros de amostra de RNA 100 micromolar, 3 microlitros de DMSO anidro, 10 unidades de T4 RNA ligase e 19,5 microlitros de água tratada com DEPC para um volume total de 30 microlitros.
Incube a reação durante a noite a 16 graus Celsius e, em seguida, execute a purificação da coluna de acordo com as instruções do manuscrito. Depois de dividir o RNA em três alíquotas e adicionar um volume igual de ácido fórmico, incube as reações a 40 graus Celsius. Uma vez terminada cada reação, congele imediatamente a amostra em gelo seco para extinguir a degradação ácida.
Use um concentrador centrífugo a vácuo para secar a amostra por aproximadamente 30 minutos. Ressuspenda as amostras secas em 20 microlitros de água tratada com DEPC e combine-as. Armazene as amostras a 20 graus Celsius até a medição LC-MS.
Transfira a amostra de RNA para o frasco de amostra LC-MS após preparar as fases móveis. Cada injeção deve conter 100 a 400 picomoles de RNA e 20 microlitros. Depois de adquirir os dados, use o fluxo de trabalho de extração de recursos moleculares para extrair informações compostas, incluindo massa, tempo de retenção, volume e índice de qualidade.
Use o formato de dados centróide em configurações de moléculas pequenas. Defina a altura do pico para pelo menos 100, mas menos de 1.000, e o índice de qualidade para pelo menos 50. Por fim, exporte os dados como um arquivo do Excel.
A separação da escada 3' da escada 5' e outros fragmentos indesejados é mostrada aqui em um gráfico de tempo de retenção de massa 2D. Também é possível sequenciar amostras mistas contendo duas fitas de RNA de comprimentos diferentes com um marcador de 5'biotina em cada RNA. Para diferenciar uridina de pseudouridina, o RNA foi tratado com CMC, que converte uma pseudouridina em um aduto CMC-pseudouridina.
O aduto tem uma massa diferente em uma uridina e pode ser diferenciado no 2D-HELS MS Seq. O perfil de HPLC do produto bruto da reação convertendo pseudouridina em seu aduto CMC foi usado para calcular a conversão percentual, que foi de 42%Uma mistura de cinco fitas de RNA diferentes foi sequenciada pela abordagem 2D-HELS MS Seq com marcação 3'end e normalizada para melhor visualização de múltiplas sequências de RNA. Sem a normalização, os códigos das letras para as sequências dos cinco RNAs seriam agrupados.
Ao tentar este procedimento, configure a reação de marcação com cuidado para obter um alto rendimento de amostras de RNA marcadas. Além disso, monitore cuidadosamente o tempo de degradação para criar escadas de massa confiáveis e coletar a quantidade máxima de amostras secas com 20 microlitros de água. Uma pergunta que pode ser feita após a execução deste protocolo é como aumentar a largura, o comprimento e a taxa de transferência do método de sequenciamento.
Um algoritmo melhor e um instrumento mais avançado com maior resolução e sensibilidade podem ajudar. Após o desenvolvimento deste protocolo, tornou-se possível sequenciar diretamente uma gama mais ampla de amostras de RNA contendo nucleotídeos canônicos e modificados sem nenhum erro relacionado ao sequenciamento de RNA baseado em CDA.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um novo método de sequenciamento baseado em LC-MS para RNA curto que elimina a necessidade de um intermediário de cDNA. O protocolo permite o sequenciamento simultâneo de várias modificações de RNA com precisão de base única.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Sequenciamento de RNA
- Epitrancriptômica
- Biotecnologia
Antecedentes
- Os métodos atuais de sequenciamento de RNA frequentemente dependem de intermediários de cDNA.
- Erros enzimáticos podem afetar a precisão do sequenciamento.
- O sequenciamento simultâneo de modificações de RNA é desafiador.
- Compreender as modificações de RNA é essencial para estudar doenças humanas.
Objetivo do Estudo
- Apresentar um método de sequenciamento direto para RNA.
- Permitir o estudo de múltiplas modificações de RNA em uma única análise.
- Fornecer uma ferramenta confiável para pesquisas em epitranscriptômica.
Métodos Utilizados
- Técnica de sequenciamento baseada em LC-MS.
- Sequenciamento direto de RNA de fita simples, misto ou modificado.
- Eliminação da etapa de síntese de cDNA.
- Fluxo de trabalho projetado para alta precisão e exatidão.
Resultados Principais
- O método sequencia com sucesso RNA curto (<35 nt) sem cDNA.
- Foi alcançada a detecção simultânea de várias modificações de RNA.
- A técnica demonstrou resistência a erros enzimáticos.
- Foram identificadas aplicações potenciais em diagnósticos para doenças humanas.
Conclusões
- Esse novo método de sequenciamento poderá se tornar um padrão para a análise de RNA modificado.
- Oferece uma abordagem abrangente para o estudo de modificações do RNA.
- O protocolo tem implicações para pesquisas futuras em biologia do RNA.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método de sequenciamento de RNA baseado em LC-MS permite o sequenciamento direto e de novo de misturas de RNA modificadas sem a síntese de cDNA, abordando um gargalo fundamental na validação de alvos epitranscriptômicos. Ao fornecer dados quantitativos de sequenciamento com resolução de modificações, ele apóia a descoberta precoce de biomarcadores baseados em RNA e a redução de riscos mecanicistas de oligonucleotídeos terapêuticos. A abordagem aumenta a confiança preditiva na identificação de compostos líderes ao fornecer resultados específicos de modificações e confirmados pela sequência, diretamente aplicáveis aos fluxos de trabalho de triagem e desenvolvimento de ensaios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio do sequenciamento direto de modificações no RNA, como pseudouridina e 5-metilcitosina, em contextos nativos.
- Valor Operacional: Oferece uma solução geral para a detecção simultânea de nucleotídeos canônicos e modificados, reduzindo a necessidade de ensaios específicos para cada modificação em sequência.
- Valor Preditivo: Reforça a confiança no alvo por meio da correlação direta entre massa e tempo de retenção das bases nitrogenadas modificadas, facilitando o mapeamento preciso de modificações em locais específicos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera saídas quantitativas de massa e tempo de retenção que permitem discriminação confiável de sequências de RNA em misturas contendo até 12 oligonucleotídeos distintos.
- Valor Operacional: Fornece dados reprodutíveis e prontos para normalização, compatíveis com sistemas padrão de CL-EM de alta resolução, apoiando a padronização de ensaios em painéis de RNA curtos.
- Escalabilidade: Facilita a preparação de sistemas biológicos validados para triagem posterior, produzindo padrões de RNA com sequências verificadas e padrões de modificações definidos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Apoia a verificação de sequência de oligonucleotídeos de RNA terapêutico modificados, conectando modificações da fase de descoberta à avaliação de candidatos pré-clínicos.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a detecção de deslocamentos de massa induzidos por modificações (por exemplo, aduto de pseudouridina-CMC) para distinguir sinal verdadeiro de artefatos de degradação em amostras complexas.
- Avanço com Base no Risco: Fornece confirmação de sequência sem viés enzimático, reduzindo falsos negativos na triagem de modificações e melhorando a confiabilidade das decisões de avançar ou interromper o desenvolvimento.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial como uma ferramenta de sequenciamento inicial para análise de RNA orientada por hipóteses, contribuindo para a identificação de candidatos ao sucesso ao confirmar a sequência e o estado de modificação de alvos de RNA sintéticos ou endógenos antes da triagem funcional.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao fornecer evidência direta da coocorrência de sequência e modificações de RNA em misturas nativas ou sintéticas.
- Triagem: Permite prontidão para ensaios mediante a geração de escadas de massa e tempo de retenção que servem como referências quantitativas para perfis de modificações ou degradação de RNA induzidas por compostos.
- Análise: Gera dados de características moleculares baseados em centróides (massa, tempo de retenção, volume, pontuação de qualidade) exportáveis para Excel, permitindo comparação entre condições e avaliação estatística da estabilidade de modificações.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao fornecer padrões de RNA modificado com sequência verificada, adequados para alinhamento de biomarcadores e validação funcional em sistemas relevantes para doenças.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade reutilizável baseada em CL-EM para sequenciamento rápido de variantes de RNA curto (<35 nt), reduzindo a dependência de sequenciamento terceirizado e acelerando ciclos internos de triagem de modificações.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Oferece confiança preditiva na validação de alvos ao eliminar erros mediados por cDNA e permitir a observação direta de assinaturas de massa específicas à modificação.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de etapas padronizadas de marcação, neutralização ácida e normalização que minimizam a variabilidade entre corridas em misturas complexas de RNA.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir o sequenciamento interno de RNA modificado, reduzindo a dependência de fornecedores externos e acelerando os ciclos de iteração na otimização de compostos líderes.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer dados inequívocos sobre sequência e modificações, diminuindo a eliminação em estágios avançados devido à heterogeneidade ou má anotação do RNA não detectadas.
Considerações de Implementação
- Exige experiência no manuseio de RNA, operação de LC-MS e extração de características moleculares baseada no MassHunter para interpretação precisa dos dados.
- Depende do acesso a sistemas de LC-MS de alta resolução capazes de aquisição de dados em modo centroid com limites definidos de altura de pico (100–1000) e pontuação de qualidade (≥50).
- Necessita padronização entre equipes quanto à eficiência de marcação, tempo de degradação e protocolos de normalização para garantir a geração consistente de escadas de massa entre diferentes usuários e plataformas.
- Requer considerações de adaptação ao ser estendido além de RNA curto (<35 nt) ou a amostras biológicas complexas, à espera de futuras melhorias em algoritmos e instrumentos.
- Envolve limitações práticas, incluindo restrições atuais de produtividade e dependência de otimização manual das reações de marcação (por exemplo, AppCp-biotina, ligase T4, DMSO) para maximizar o rendimento e a resolução da escada de massa.
