Rastreamento Anatômico e Funcional In Vivo dos Terminais de Glutamato da Área Tegmental Ventral no Hipocampo

O protocolo atual analisa um método acessível e direto para rastreamento neuroanatômico e eletrofisiológico combinado de neurocircuitos in vivo. A técnica permite o mapeamento de terminais adjuntos de uma população específica de neurônios para um local alvo. Da mesma forma, o mapa anatômico desses terminais pode ser verificado por estimulação optogenética durante o registro extracelular no local alvo.

Este protocolo pode ser aplicado para estudar vários circuitos neurais associados à função sensorial, motora e cognitiva. A realização deste procedimento requer algum conhecimento de cirurgia estereotáxica de roedores e manuseio de eletrodos neurais delicados. A conexão do sistema de gravação para evitar ruídos nas gravações.

A demonstração visual destaca as etapas básicas na configuração de um sistema de LED acessível para optogenética in vivo. Além disso, mostra como conectar o amplificador com o driver de LED para gravação sincronizada e estimulação em um mouse anestesiado. Coloque uma almofada de aquecimento na estrutura estereotáxica de forma que o corpo do rato fique sobre ela, o que ajudará a manter a temperatura corporal durante todo o procedimento e, em seguida, fixe suavemente a cabeça no aparelho estereotáxico.

Prepare a área cirúrgica limpando-a primeiro com solução de iodo e depois com álcool para remover o iodo. Em seguida, aplique lidocaína tópica para bloquear a sensação no couro cabeludo. Em seguida, usando um bisturi, faça uma incisão na linha média que se estende da região frontal até a região occipital.

Para injeção na área tegmental ventral ou VTA, posicione uma seringa de agulha de ponta romba ultrafina nas coordenadas negativas 3.08 milímetros ântero-posterior e 0.5 milímetro medial lateral em relação ao bregma. Use uma ferramenta de perfuração para fazer um orifício de um milímetro no crânio na coordenada marcada. Siga as instruções do fabricante para fixar o porta-seringas em um micromanipulador e encha a seringa com água bidestilada para limpar e testar o fluxo de fluido.

Em seguida, dispense a água para testar o fluxo da seringa. Descongele alíquotas de vírus adeno-associado ou coquetel AAV no gelo. Encha a seringa montada com 1.000 nanolitros de solução AAV e dispense 10 nanolitros da solução para confirmar o fluxo do líquido.

Use o micromanipulador para abaixar a agulha até o local da injeção e injete 600 a 800 nanolitros de AAV no VTA, fornecendo a solução a 60 nanolitros por minuto. Três semanas após a injeção de AAV, afixar a cabeça do animal em uma estrutura estereotáxica conforme descrito anteriormente e realizar uma craniotomia para expor a dura-máter. Use uma ferramenta de perfuração para remover parte do osso parietal.

Sob um microscópio de dissecação, use uma ponta de agulha de calibre 27 dobrada para extirpar a dura-máter exposta, tomando cuidado para não separar a delicada cobertura da casca e os tecidos corticais nessa área. Aplique gotas de líquido cefalorraquidiano artificial sobre a área da craniotomia para evitar o ressecamento. Faça um orifício no osso occipital para segurar o parafuso de aterramento e conecte um fio terra de aço inoxidável.

Antes de abaixar a cânula, conecte o cabo de fibra óptica a uma fonte de LED acoplada a fibra. Abaixe a fibra óptica de 400 micrômetros de diâmetro no VTA nas coordenadas AP negativo 3,08 milímetros e ML 0,5 milímetros. Usando um micromanipulador, posicione os locais de contato do eletrodo na camada de células piramidais do CA1.

Para sincronizar o pulso de luz com a gravação neural, conecte o driver de LED e a importação digital do controlador de gravação a um pulsador lógico de transistor-transistor com um divisor BNC. Ajuste o botão para determinar a intensidade efetiva que pode gerar uma resposta sem produzir artefatos fotoelétricos e conecte o solo do crânio ao solo do adaptador. Conecte o cabeçote do préamplifier stage ao controlador de gravação por meio de um cabo de interface periférico serial e verifique as luzes coloridas do LED nas portas do controlador de gravação.

Os LEDs verde e amarelo indicam a tensão adequada na placa amplificadora conectada e o led vermelho indica um controle de estágio do cabeçote do software em funcionamento. Depois de iniciar o software, selecione o formato do arquivo de dados e altere o nome do arquivo. Mude para a porta do cabeçote conectado stage e clique em desabilitar tudo na porta se o eletrodo tiver menos canais do que o cabeçote stage.

Selecione o número apropriado de canais a serem exibidos na tela. Para capturar o carimbo de data/hora TTL para gravação neural sincronizada e carimbo de data/hora acionado por pulso de luz, clique nas importações digitais e ative o digital em zero um. Isso deve corresponder à conexão BNC nas importações digitais do amplificador.

Ajuste a escala de tempo e a escala de tensão para exibição apropriada da forma de onda e selecione a taxa de amostragem, tendo em mente que uma taxa de amostragem mais alta e um número de canais aumentarão o tamanho do arquivo. Em seguida, defina a largura de banda do amplificador para gravação de unidade única. Uma frequência de corte de 300 a 5.000 Hertz foi usada aqui.

Para som de pico, clique em áudio de saída analógica e ative a porta analógica. Em seguida, ajuste o ganho e o silenciador para obter o som ideal. Para sincronizar o amplifier gravação e trem de pulso de luz, clique na guia de exibição e ative mostrar marcador.

Mude para o canal apropriado que corresponde à conexão BNC e inspecione novamente as portas para certificar-se de que os canais de gravação e o canal de entrada digital estejam habilitados para capturar picos neurais e carimbos de data/hora de pulso de luz. Clique no escopo do pico para visualizar as formas de onda que constituem o trem de pico registrado continuamente. Use o mouse para definir o limite para as formas de onda a serem exibidas.

Em seguida, inspecione o RMS para determinar o nível de ruído em sua gravação. A expressão do vírus adeno-associado foi verificada por imunofluorescência de EYFP na área tegmental ventral de camundongos 21 dias após a injeção. A imagem de fluorescência também foi usada para detectar projeções pré-sinápticas de glutamato VTA nas camadas do hipocampo DG, CA3 e CA1.

Uma vez detectada a atividade da voltagem extracelular, a atividade basal foi registrada por aproximadamente 10 minutos antes de acionar o pulso de luz na frequência desejada. Isso tornou possível comparar as taxas de disparo ou explosão de neurônios putativos CA1 antes e depois da fotoestimulação de glutamato VTA. Para apoiar esse resultado, a comparação estatística das taxas de disparo da rede CA1 antes e depois da fotoestimulação revelou um aumento significativo para o período pós-estimulação.

A análise subsequente do trem raster para detectar explosões também mostrou um aumento da taxa de explosão para os neurônios piramidais putativos CA1 após a fotoestimulação. A resposta à fotossimulação foi identificada por fluorescência das expressões repórter do AAV nos locais de estímulo. Além disso, a descrição de deve ser correlacionada com o local de gravação para unidades putativas responsivas.

Este método também pode ser realizado em camundongos acordados realizando tarefas comportamentais. Nesse caso, devem ser utilizadas sondas implantáveis crônicas e cânula de fibra óptica. Esta técnica permitirá o rastreamento robusto de neurocircuitos por meio de uma combinação de distribuição de terminais pré-sinápticos no local alvo e modulação de terminais pré-sinápticos para detectar a resposta do local alvo in vivo.