Name: Rastreamento Anatômico e Funcional In Vivo dos Terminais de Glutamato da Área Tegmental Ventral no Hipocampo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Aprenda a rastrear projeções de glutamato da VTA para o hipocampo usando optogenética e gravações eletrofisiológicas in vivo em camundongos. Este método permite mapear circuitos neurais e analisar a modulação sináptica em tempo real.

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Este trabalho é financiado pela CBS Bridging Grant concedido à OOM. OOM, PAA e AS projetaram o estudo e realizaram os experimentos. As e PAA analisaram os resultados. OOM e PAA prepararam o manuscrito. Agradecemos ao Dr. Karl Disseroth (Universidade de Stanford) por disponibilizar o AAV para nosso uso.

Todos os procedimentos experimentais e de manejo animal foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Estadual de Louisiana.
1. Animal experimental
<ol><li>Use ratos de 5 a 6 semanas.</li>
	<li>Casa 3-5 animais por gaiola sob condições padrão de 12 h alternando luz e ciclo escuro. Comida e água devem ser fornecidas ad libitum.</li>
</ol>2. Craniotomia e preparação animal
NOTA: Esta seção descreve procedimentos pré e peri-operatórios para craniotomia do rato. Use aparelhos estereotáticos padrão e coordenadas apropriadas (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML e Dorsoventral: DV). Consulte um atlas cerebral de rato para determinar as coordenadas para a região cerebral de interesse.
<ol><li>Anesthetize camundongos por cetamina intraperitoneal (100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg) injeção de coquetel. Realize um teste de beliscão do dedo do pé para garantir a ausência de sensação antes do início da cirurgia. NOTA: Alternativamente, a anestesia isoflurane com uma câmara de nariz apropriada também pode ser usada para esta etapa.</li>
	<li>Conserte suavemente a cabeça do animal no aparelho estereotaxico. NOTA: É importante lidar com animais com cautela durante este processo. Além disso, verifique a taxa de respiração e outros sinais vitais antes de prosseguir com a cirurgia. Deixe o animal descansar por ~7 minutos para reduzir o estresse.<ol>
<li>Coloque uma almofada de aquecimento na estrutura estereotaxa de tal forma que o corpo do animal esteja deitado sobre ele. Isso ajudará a manter a temperatura corporal e manter o animal aquecido, embora o procedimento. Mantenha a almofada de aquecimento para cuidados pós-operatórios e recuperação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use um cortador para remover o cabelo sobre o couro cabeludo e limpe a pele com uma solução de iodo.<ol>
<li>Aplique lidocaína tópica para bloquear a sensação no couro cabeludo.</li>
		<li>Use um bisturi para fazer uma incisão de couro cabeludo médio que se estenda da frontal até a região occipital.</li>
		<li>Limpe a área de incisão com solução de iodo e exponha a calvaria. NOTA: Uma pequena quantidade de 3% de solução de peróxido de hidrogênio pode ser aplicada para remover periosteum da calvária. Isso aumentará a visibilidade de marcos (bregma e lambda) e suturas.</li>
		<li>Usando um atlas estereotático cerebral do camundongo, determine coordenadas AP e ML relativas ao bregma.</li>
		<li>Para injeção de VTA, posicione uma seringa de agulha de ponto contundente ultrafina (por exemplo, seringa neuros) nas coordenadas AP: -3,08 mm/ML: 0,5 mm em relação ao bregma.</li>
		<li>Use uma ferramenta de perfuração para furar um orifício de 1 mm (craniotomia) no crânio na coordenada AP/ML marcada. NOTA: Esta etapa requer um nível significativo de cautela. A pressão mínima deve ser aplicada durante a perfuração para evitar que a broca esmague o tecido cerebral. No presente estudo, a broca foi de 0,8 mm e a velocidade da broca foi fixada em 15.000 rpm. ATENÇÃO: Se o peróxido de hidrogênio foi usado na limpeza da incisão ou calvária, garanta a remoção total da solução ou permita a secura completa antes da perfuração.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Injeção de coquetel AAV
NOTA: Esta seção descreve o processo de injeção de AAV no VTA de camundongos C57BL/6 adultos (23-27 g). O método descrito pode ser usado para injeção de AAV em qualquer região cerebral usando aparelhos estereotáticos padrão e coordenadas apropriadas. Para demonstrar este protocolo, eYFP e hChR2 foram expressos em neurônios glutamato VTA usando transfecção mediada por AAV5 sob um promotor CaMKIIα(Figura 1). A recombinação de cre-lox também pode ser usada para esta etapa.
<ol><li>Monte uma seringa com agulha de ponto contundente ultrafina (32 G; capacidade de 5 μL com precisão de 100 nL) em um injetor. Conserte o suporte de seringa em um micromanipulador. NOTA: Para este procedimento, utilizou-se um porta-seringa manual, com calibração de 1,6 nL. Um injetor automatizado também pode ser usado.</li>
	<li>Encha a seringa com água dupla destilada para limpar e testar o fluxo de fluido.</li>
	<li>Descongelar alíquotas de AAV (sorotipo 5) coquetel no gelo. Os AAVs são melhor armazenados a -80 °C para manter o título viral para uma boa expressão.</li>
	<li>Encha a seringa montada com 1.000 nL de solução AAV (10 mM em soro fisco tamponado de fosfato (PBS), pH 7.4). Dispense 10 nL da solução AAV para confirmar o fluxo do líquido antes de baixar a agulha em um local de injeção.</li>
	<li>Use um micromanipulador para baixar a agulha estereoticamente na profundidade desejada (coordenada DV). Depois de baixar a agulha para a profundidade desejada, deixe a seringa permanecer no lugar por 10 minutos antes da injeção. NOTA: Para este procedimento, a agulha foi abaixada no VTA a uma profundidade (DV) de 4,5 mm da superfície pial do cérebro. Para outras áreas cerebrais, use a coordenada dorsoventral apropriada (consulte o atlas cerebral do camundongo).</li>
	<li>Injete 600-800 nL de AAV no VTA. O volume de injeção pode ser ajustado dependendo do tamanho do local alvo.<ol>
<li>Entregar a solução AAV à taxa de 60 nL/min (intervalo de 3 min).</li>
		<li>Para expressar eYFP e hChR2 em neurônios e projeções de glutamato VTA, injete AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP. NOTA: O método de recombinação de Cre-lox também pode ser usado dependendo do objetivo do experimento.</li>
		<li>Deixe a agulha permanecer no lugar por 15 minutos após a injeção de AAV. Isso reduzirá a difusão e o backflow.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire a agulha da seringa e, em seguida, suturar a incisão para fechar a ferida.</li>
	<li>Administre antibióticos e analgésicos como parte dos cuidados pós-operatórios. Coloque o mouse em uma plataforma acolchoada quente e monitore o animal até acordar. NOTA: Após 3 semanas de injeção, a expressão AAV pode ser observada pela detecção de fluorescência de proteína repórter (eYFP) em seções cerebrais de camundongos. Além disso, experimentos de fotostimulação podem ser realizados após 3 semanas(Figura 2).</li>
</ol>4. Configuração para gravações neurais in vivo com optogenética
NOTA: Esta seção descreve os passos para gravação neural aguda com o rastreamento optogenético de um circuito cerebral (projeção de neurônio glutamato VTA para o CA1). Se necessário, verifique o sistema (amplificador e conexões) para problemas de ruído elétrico e aterramento antes de iniciar esta etapa. Realizar esta etapa em uma gaiola faraday pode ajudar a eliminar o ruído elétrico na gravação.
<ol><li>Às 3 semanas após a injeção de AAV, anesthetize camundongos por injeção de uretano intraperitoneal (0,2 mg/kg). ATENÇÃO: O uretano é cancerígeno e deve ser manuseado com cautela enquanto usa equipamento de proteção. Além disso, administrar anestesia de uretano nesta concentração não é sobrevivência.</li>
	<li>Fixar a cabeça do animal em um quadro estereotático como descrito anteriormente (etapa 2.2, Figura 3A). Faça uma craniotomia para expor a dura (Figura 3A). Use uma ferramenta de perfuração (tamanho de bit: 0,8 mm, velocidade: 15.000 rpm) para remover parte do osso parietal.<ol>
<li>A craniotomia deve ter cerca de 3 mm x 4mm de largura. Aplique gotas de fluido cerebrospinal artificial (aCSF) sobre esta área para evitar o ressecamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sob um microscópio de dissecção (digital), use uma ponta de agulha dobrada (27 G) para extiridar a dura exposta. Tenha cuidado para não separar a delicada cobertura de pial e tecidos cortical nesta área.</li>
	<li>Furar o osso occipital (tamanho do bit: 0,8 mm, velocidade: 10.000 rpm) para segurar o parafuso moído (parafuso Phillips da cabeça da panela; M0,6 x 2,0 mm).</li>
	<li>Conecte um fio moído de aço inoxidável. NOTA: Outros tipos de fios também podem ser usados(Figura 3b).</li>
	<li>Para fotostimulação combinada (VTA) e gravação neural (CA1), use um aparelho estereotaxista multi-trilho equipado com micromanipuladores ultrafinas (10 μm ou 1 μm). Monte a fibra óptica e a sonda neural de gravação em micromanipulador de alcance de 10 μm e 1 μm de alcance, respectivamente.<ol>
<li>Se necessário, use um adaptador de teste de estágio da cabeça(Figura 3c). NOTA: No protocolo atual, um estágio de cabeça de 32 canais foi equipado com um adaptador para conter um eletrodo de gravação de 4 canais(Figura 3d). O fio moído de aço inoxidável foi soldado à porta de conexão terrestre do adaptador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nas coordenadas AP: -3,08 mm ML: 0,5 mm, abaixe a fibra óptica de 400 μm de diâmetro no VTA.<ol>
<li>Antes de baixar a fibra óptica, conecte a ferrule a um cabo de fibra óptica (com aço inoxidável ou ferrule cerâmico) ligado a uma fonte LED acoplada a fibra. NOTA: Certifique-se de que a intensidade da luz e o foco estão definidos conforme desejado. A escolha da fonte de luz LED deve corresponder às opsinas que estão sendo direcionadas. Aqui, um driver LED de 470 nm (luz azul) foi usado para fotoativação hChR2(Figura 4a).</li>
		<li>Para sincronizar o pulso de luz com a gravação neural, conecte o driver LED e o controlador de gravação digital in porta a um pulsar de lógica transistor-transistor (Figura4b). Isso pode ser conseguido usando um divisor BNC. NOTA: O uso de um pulsar TTL proporciona a flexibilidade de definir digitalmente a frequência e duração do trem de pulso desejados. No protocolo atual, pulsos de luz de 10 ms foram acionados a 50 Hz18. Para o controle TTL do driver LED, mude o motorista para "acionamento". Neste modo, a intensidade da luz pode ser regulada girando o "botão". A frequência de estimulação pode ser ajustada para acomodar variáveis experimentais e pode variar de 1 a 100 Hz. Para rastreamento de circuito neural, recomenda-se uma frequência de estimulação de >20 Hz.</li>
		<li>Ajuste o botão para determinar a intensidade efetiva que pode gerar uma resposta sem produzir artefatos fotoelétricos. Se necessário, reposicione a fibra óptica para eliminar artefatos19. NOTA: O driver LED usado para o protocolo atual produz potência leve de ~21,8 mW.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Gravação neural
<ol><li>Use uma sonda neural aguda com uma haste de 15 a 50 μm de espessura, medindo pelo menos 5 mm de comprimento. NOTA: A gravação de estruturas cerebrais profundas exigirá sondas neurais com uma haste mais longa. No presente estudo, foi utilizada uma sonda com comprimento de haste de 20 mm.</li>
	<li>Conecte o estágio da cabeça do pré-amplificador ao controlador de gravação através de um cabo SPI (Serial Periférico Interface, interface periférica). Verifique a iluminação colorida dos LEDs nas portas do controlador de gravação. Os LEDs verdes e amarelos indicam tensão adequada na placa do amplificador conectado. Led vermelho indica um controle de estágio de cabeça de software de trabalho(Figura 5b).</li>
	<li>Utilizando um micromutor, posicione os locais de contato do eletrodo na camada celular piramida do CA1 (AP: -1,94mm, ML: +1,0mm, DV: +1,1 a 1,2mm). NOTA: A fibra óptica e o eletrodo podem ser posicionados em outras regiões cerebrais desejadas para fotostimulação e gravação.</li>
</ol>6. Configurações do amplificador e filtro
<ol><li>Conecte o sistema do amplificador do controlador de gravação a um computador através de uma porta USB 3.0. Conecte o estágio da cabeça ao amplificador usando o cabo SPI. Inicie o software do controlador. Se não estiver conectado corretamente, o sistema exibirá uma mensagem "dispositivo não encontrado".</li>
	<li>Clique em Executar para ver a atividade nos canais. Cada forma de onda é plotada como a tensão (eixo y) versus o tempo (eixo x). Dependendo da região de interesse, ajuste a tensão e as escalas de tempo para ajustar o display de forma de onda.</li>
	<li>Se apenas alguns canais estiverem ativos, desabilite canais nãouso para reduzir o tamanho do arquivo no disco de armazenamento.</li>
	<li>Defina a taxa de amostragem e as frequências de corte editando parâmetros de largura de banda no software de aquisição. Para gravação uni unitária, defina as frequências de corte superior e inferior para 300 Hz e 5.000 Hz, respectivamente. Altere a taxa de amostragem do amplificador para 30 kS/s. NOTA: Escolher uma alta taxa de amostragem produzirá um tamanho maior de arquivo.</li>
	<li>Antes de gravar, verifique a integridade dos canais de eletrodos medindo a impedância a 1.000 Hz. Isso pode ser feito lançando a função na interface do usuário (software do controlador). Um canal de trabalho deve ter um valor de impedância que varia de 0,1 a 5 MΩ.</li>
	<li>Se uma saída de áudio (alto-falante) estiver conectada à porta ANALOG OUT, ajuste o ganho e o silenciador para um som de pico ideal.</li>
	<li>Para exibir o marcador do trem de pulso TTL na gravação de pico, habilite o display para o marcador DIGITAL IN. Para gravar o carimbo de tempo do trem de pulso, habilite a exibição do canal DIGITAL IN antes do experimento principal. NOTA: Geralmente há mais de um canal "DIGITAL IN" (1 ou 2). Certifique-se de que o cabo BNC do pulsador TTL esteja conectado à porta "DIGITAL IN" selecionada para exibição no software do controlador de gravação.</li>
	<li>Para visualização em tempo real da forma de onda de pico, abra a janela do escopo de pico e defina o limiar usando o clique do mouse.</li>
	<li>Inspecione o nível de ruído monitorando o Root Mean Square (RMS in μV). Para gravação de pico limpo, é preferível que o limiar de pico neural seja de pelo menos 5x RMS.</li>
	<li>Uma vez concluída a configuração, selecione o formato de saída do arquivo. NOTA: Aqui, o pico neural ca1 foi registrado em formato .rhd. Outros formatos de arquivo (.rhs e .dat) também podem ser selecionados para corresponder aos formatos de arquivo permitidos pelo software de análise.</li>
</ol>7. Gravação e configurações optogenéticas in vivo
<ol><li>Abra o software de controle de pulso (TTL), que exibe vários parâmetros de pulso ajustáveis. Selecione a porta COM apropriada no software. Ajuste os parâmetros de pulso ajustando as configurações trem e grupo. NOTA: A condição de pulso deve ser determinada considerando variáveis experimentais e design.</li>
	<li>No software do controlador do amplificador, clique em Executar para detectar picos neurais no hipocampo ou área cerebral desejada. Se necessário, ajuste a profundidade do eletrodo para detectar neurônios viáveis e ativos.</li>
	<li>Uma vez detectada atividade de tensão extracelular, observe os picos de linha de base por 15 minutos e monitore os sinais vitais do animal. Além disso, teste o pulso de luz para detectar neurônios responsivos dentro do CA1 ou região alvo anatômica desejada. NOTA: Verifique se há artefatos fotoelétricos e elimine ajustando a intensidade da luz ou a posição da fibra óptica.</li>
	<li>Regisso da linha de base por ~10 min antes de acionar o pulso de luz na frequência desejada(Figura 5a,b). Isso permitirá a comparação das taxas de disparo ou estouro com e sem iluminação. NOTA: No presente estudo, a atividade de linha de base foi registrada por 10 minutos sem iluminação, seguida de iluminação a 50 Hz(Filme 1).</li>
</ol>8. Análise
<ol><li>Converta o arquivo .rhd em formato de saída Nex5.</li>
	<li>Nome do arquivo do processo. Arquivo Nex5 em um software de classificador offline para detectar trens rasteres e formas de onda de uma única unidade(Figura 5a-b).<ol>
<li>Selecione o canal desejado na janela de entrega. NOTA: Os dados de pico registrados continuamente podem ser visualizados em uma janela separada do OFSS. A escala de tempo também pode ser ajustada. Se um tetrode for usado, o OFSS pode ser definido para classificar os 4 canais como um tetrode.</li>
		<li>Defina o nível de tensão para extração de forma de onda de cruzamento de limiar. ATENÇÃO: Utilize um mínimo de 5x RMS para detecção adequada de picos.</li>
		<li>Detecte formas de onda e realize a classificação de picos usando o método de busca de vale (automático) ou K -means (semiautomático). Quando necessário, mescla unidades que ocupam regiões semelhantes do espaço de Análise de Componentes 3D-Principal (PCA).</li>
		<li>Exportação classificada . Nex5 arquivos para análise posterior(Figura 5c-d). NOTA: Os resultados da análise do intervalo interspique, da taxa de disparo e da taxa de estouro podem ser exportados para outras plataformas de análise.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Detecção de fluorescência da expressão AAV
<ol><li>Após a gravação, eutanize o animal em uma câmara isoflurane.</li>
	<li>Realizar perfusão transcárvia com PBS de 10 mM (~10 mL), seguido de paraformaldeído tamponado de fosfato de 4% (PB-PFA, ~10 mL).</li>
	<li>Remova todo o cérebro intacto e fixe-o em 4% PB-PFA por 48 h.</li>
	<li>Transfira o cérebro fixo para 4% pb-PFA contendo 30% de sacarose para criopreservação a 4 °C. Depois de 72 h, se sectionia o cérebro em um criostat e monte fatias em um slide revestido de gelatina. NOTA: No protocolo atual, foram selecionadas seções contendo a parte fechada do hipocampo (rostral) para demonstrar terminais rotulados por AAV no DG, CA3 e CA1.</li>
</ol>

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<li>McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neurons+promote+hippocampal+reactivation+and+spatial+memory+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence.</a> Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).</li>
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<li>Mei, Y., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+and+approaches+for+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Molecular tools and approaches for optogenetics.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).</li>
<li>Zingg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-Mediated+Anterograde+Transsynaptic+Tagging%3A+Mapping+Corticocollicular+Input-Defined+Neural+Pathways+for+Defense+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors.</a> Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).</li>
<li>Aravanis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+neural+interface%3A+in+vivo+control+of+rodent+motor+cortex+with+integrated+fiberoptic+and+optogenetic+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology.</a> Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Na última década, o projeto de construções AAV avançou significativamente. Como tal, promotores mais específicos de neurônios foram incorporados em uma matriz de sorotipos AAV para uma especificação de transfecção melhorada14. Combinando genes para proteínas de fluorescência, transportadores, receptores e canais de íons, bibliotecas de AAV agora existem para imagem, neuromodulação e detecção de atividade sináptica. Em construções AAV disponíveis comercialmente, uma combinação de canais de fluorofo...

Na última década, uma série de ferramentas genéticas foi desenvolvida para aumentar a especificidade da modulação do tipo neurônio, e o mapeamento de redes neurais complexas1. Notavelmente, vírus neurotrópicos com uma capacidade inerente de infectar e replicar em células neuronais foram implantados para expressar ou ablate proteínas específicas em subtipos de neurônios. Ao abrigar proteínas de fluorescência ou indicadores de atividade sináptica geneticamente codificados, os vetores AAV transfectados rotulam e delineiam redes neurais nas regiões cerebrais2,3. A escolha de um promotor na construção AAV direciona a expressão do vetor em tipos de neurônios com algum nível de especificidade (expressãodependente do promotor). No entanto, através da recombinação de Cre-lox, os construtos AAV são implantados com maior especificidade para rotulagem de neurônios4,5,6,7. Note-se que as proteínas de opsinas microbianas fotoativadas e as proteínas de fluorescência embaladas em vetores AAV podem ser expressas em vários subtiposde neurônios 8, e são ideais para imagens, rastreamento de circuito do tipo neurônio e fotomodulação9,10.
Os AAVs constroem estereoticamente injetados em uma região cerebral (ou núcleo) impulsiona a expressão da proteína repórter nos terminais soma, dendrite e axônios. A expressão neural da AAV abrigando um gene repórter (eYFP) facilita a rotulagem de corpos celulares neurônios e o rastreamento anatômico de projeções de e para outras regiões cerebrais11,12,13,14. Os construtos AAV-eYFP que transportam opsina controlada por luz (por exemplo, hChR2), podem ser implantados como uma ferramenta para imagens6,15 e rastreamento fisiológico baseado em estimulação de projeções neurais para atingir áreas cerebrais in vivo16. Dependendo do sorotipo AAV, a direção da rotulagem de neurônios pode ser anterograda ou retrógrada11,12. Estudos anteriores estabeleceram que o AAV5 viaja anterogradavelmente em neurônios12. Assim, a fotostimulação de corpos celulares expressando hChR2 produz efeitos pré-sinápticos em outros lugares do cérebro (alvo)17.
Aqui, o AAV (sorotipo 5) com um promotor CaMKIIα foi usado para expressar eYFP (repórter) e hChR2 (opsin) em neurônios glutamato VTA e projeções axonais. Os resultados deste estudo demonstram a distribuição dependente de camadas dos terminais pré-sinápticos de VTA-glutamato nas regiões hipocampal CA1, CA3 e DG. Além disso, a fototimulação dos neurônios de glutamato VTA aumentou as taxas de disparo de ca1 multi-unidades e uni unidades in vivo quando comparada com os valores da linha de base. Este protocolo utiliza ferramentas acessíveis e softwares comercialmente disponíveis que podem aumentar a qualidade dos dados obtidos a partir de experimentos de rastreamento de circuito neural.

<table><tbody><tr><td>3% de peróxido de hidrogênio</td><td>Fisher químico</td><td>H312</td><td></td></tr><tr><td>AAV-CaMKII&alpha;-ChR2-eGYP</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #26969</td><td></td></tr><tr><td>Cabo</td><td>BNC Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC Splitter</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceramic Split Mating Sleeve para &Oslash; Virolas de 1,25 mm.</td><td>Thorlabs</td><td>ADAL1-5</td><td></td></tr><tr><td>Broca</td><td>Dremel</td><td>LR 39098</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas revestidas com gelatina</td><td>Fisher scientific</td><td>OBSLD01CS</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de Hamilton (Neuros)</td> <td>WPI Inc.</td><td>06H</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de estágio de cabeça</td><td>Neuronexus</td><td>Adpt-Q4-OM32</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de silício de alta impedância</td><td>Neuronexus</td><td>Q1x1-tet-5mm-121-CQ4</td><td></td></tr><tr><td>INTAN 512ch Controlador de gravação</td><td>INTAN</td><td>RHD2000</td><td></td></tr><tr><td>solução de iodo</td><td>Dynarex</td><td>1425</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Driver de LED Ketamine</td><td>Spectrum</td><td>K1068</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz LED (470 nm) - luz azul</td><td>Thorlabs</td><td>M470F3</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>M0-203</td><td></td></tr><tr><td>Fibra óptica</td><td>Thorlabs</td><td>CFMLC14L05</td><td></td></tr><tr><td>Parafuso philips de cabeça de panela (M0.6 X 2mm)</td> <td>Amazon</td><td>M0.6 X 2mm</td><td></td></tr><tr><td>Headstage do pré-amplificador (32 canais)</td><td>INTAN</td><td>C3314</td><td></td></tr><tr><td>Quadro estereotáxico</td><td>Kopf</td><td>1530</td><td></td></tr><tr><td>TTL pulsador</td><td>Prizmatix</td><td>4031</td><td></td></tr><tr><td>Uretano</td><td>Sigma</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61430</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Empresa </td><td>Versão</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad</td><td>Software versão 8</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de Gravação Intan</td><td>Intantech</td><td>versão 2.07</td><td></td></tr><tr><td>Neuroexplorer</td><td>Nex Technologies</td><td>versão 5.215</td><td></td></tr><tr><td>Plexon Offline Spike Sorter</td><td>Plexon Inc</td><td>versão 4.5</td><td></td></tr><tr><td>ACSF Composição:</ ACSF forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>oxigenado com 95% de oxigênio/5% de CO2 constantemente borbulhando através do ACSF (ACSF; em mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 e 25 Glicose).</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rastreamento anatômico e funcional in vivo dos terminais de glutamato da Área tegmental ventral no hipocampo

Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

A modulação optogenética de subsu populações de neurônios no cérebro permitiu aos pesquisadores dissecar circuitos neurais in vivo e ex vivo. Isso fornece uma premissa para determinar o papel dos tipos de neurônios dentro de um circuito neural, e sua significância na codificação de informações em relação ao aprendizado. Da mesma forma, o método pode ser usado para testar a significância fisiológica de duas ou mais regiões cerebrais conectadas em animais acordados e anestesiados. O presente estudo demonstra como os neurônios de glutamato VTA modulam a taxa de disparo de neurônios piramidários putativos no CA1 (hipocampo) de camundongos anestesiados. Este protocolo emprega rotulagem dependente de adeno (AAV) de neurônios glutamato VTA para o rastreamento de terminais de glutamato pré-sináptico VTA nas camadas do hipocampo. Expressão de opsina controlada pela luz (channelrhodopsin; hChR2) e proteína de fluorescência (eYFP) abrigada pelo vetor AAV permitiu rastreamento anterograde de terminais de glutamato VTA, e fotostimulação de corpos celulares neurônios de glutamato VTA (no VTA). Eletrodos de silício agudos de alta impedância foram posicionados no CA1 para detectar respostas multi-unidades e uni unidades à fotostimulação VTA em vivo. Os resultados deste estudo demonstram a distribuição dependente de camadas dos terminais de glutamato VTA pré-sinápticos no hipocampo (CA1, CA3 e DG). Além disso, a fotostimulação dos neurônios glutamato VTA aumentou a taxa de disparo e estouro de unidades piramigráficas ca1 putativas in vivo.

Rastreamento de anterogrado
A expressão AAV foi verificada por imagens de imunofluorescência de proteína repórter (eYFP) no VTA de C57BL/6 camundongos 21 dias após a injeção(Figura 2). A rotulagem anterograda bem sucedida de projeções de glutamato VTA pré-sináptico no hipocampo também foi verificada pela detecção de eYFP nas camadas do DG, CA3 e CA1 (Figura 6a-d; Filme 2 e 3).
<p class="jove_conte...

O protocolo atual demonstra um método simples para traçar projeções de glutamato da área tegmental ventral (VTA) para o hipocampo. A fotostimulação dos neurônios de glutamato VTA foi combinada com a gravação de CA1 para demonstrar como terminais de glutamato VTA modulam a taxa de disparo piramipário putativo ca1 in vivo.

Rastreamento Anatômico e Funcional In Vivo dos Terminais de Glutamato da Área Tegmental Ventral no Hipocampo

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a ...

O protocolo atual analisa um método acessível e direto para rastreamento neuroanatômico e eletrofisiológico combinado de neurocircuitos in vivo. A técnica permite o mapeamento de terminais adjuntos de uma população específica de neurônios para um local alvo. Da mesma forma, o mapa anatômico desses terminais pode ser verificado por estimulação optogenética durante o registro extracelular no local alvo.Este protocolo pode ser aplicado para estudar vários circuitos neurais associados à função sensorial, motora e cognitiva. A realização deste procedimento requer algum conhecimento de cirurgia estereotáxica de roedores e manuseio de eletrodos neurais delicados. A conexão do sistema de gravação para evitar ruídos nas gravações.A demonstração visual destaca as etapas básicas na configuração de um sistema de LED acessível para optogenética in vivo. Além disso, mostra como conectar o amplificador com o driver de LED para gravação sincronizada e estimulação em um mouse anestesiado. Coloque uma almofada de aquecimento na estrutura estereotáxica de forma que o corpo do rato fique sobre ela, o que ajudará a manter a temperatura corporal durante todo o procedimento e, em seguida, fixe suavemente

combined-vivo-anatomical-functional-tracing-ventral-tegmental-area

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra uma abordagem de alimentação com anticorpos para estudar o tráfego de receptores de glutamato em culturas neuronais primárias do hipocampo. Essa abordagem permite a observação de populações de receptores nas membranas plasmática e interna. A discriminação entre esses subconjuntos é obtida marcando os receptores antes e depois da permeabilização da membrana, usando o mesmo anticorpo primário, mas anticorpos secundários conjugados a diferentes fluoróforos.

Uma técnica in vitro para estudar o tráfego de receptores de glutamato em neurônios do hipocampo

Este vídeo demonstra o processo de preparação de tecidos ventrais, hipocampo e núcleo accumbens de cérebros de camundongos para co-cultura. Os neurônios estendem as projeções para formar conexões sinápticas entre os tecidos ventral do hipocampo e do núcleo accumbens. Este método permite estudar as interações neuronais entre essas duas regiões do cérebro, oferecendo insights sobre cognição, comportamento e distúrbios neurológicos.

Co-cultivo do hipocampo ventral e do núcleo accumbens

Fonte: Kamei, R., et. al., Imagem crônica de dois fótons in vivo da microglia no hipocampo de camundongos. J. Vis. Exp. (2022)O vídeo demonstra o processo de configuração e imagem para microscopia in vivo de dois fótons da dinâmica microglial no hipocampo CA1 (Cornu ammonis 1) e giro denteado, garantindo o alinhamento óptico ideal e a avaliação da integridade estrutural.

Imagem in vivo de dois fótons da dinâmica microglial no hipocampo de camundongos

O objetivo deste manuscrito é estudar o hipocampo e os subcampos do hipocampo usando ressonância magnética. O manuscrito descreve um protocolo para segmentar o hipocampo e cinco subestruturas do hipocampo: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/giro denteado, estratos radiatum/lacunoso/molecular e subículo.

Alta resolução In Vivo Manual Protocolo Segmentação para hipocampo humano subcampos Utilizando Ressonância Magnética 3T

Descreve-se a combinação de UV induzida por foto-ativação focal de compostos neuro-ativa com célula inteira patch-clamp e multi-fotão imagem de transientes de cálcio intracelular em dendritos e espinhas dos neurônios do hipocampo em fatias de tecido agudas do cérebro do rato.

Multi-photon intracelular de sódio Imagem Combinado com mediada por UV uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais CA1

Nós descrevemos uma técnica para identificar neurônios e seus processos via anterógrada ou retrógrada tracer injeções em núcleos cerebrais usando uma preparação in vitro. Nós modificamos um método existente de i n vitro tracer eletroporação, aproveitando fluorescente etiquetado ratos mutantes e equipamentos ópticos de base, a fim de aumentar a precisão de rotulagem.

Neuronal Tracing em explantes cérebro guiadas a laser

Este protocolo descreve um conjunto de métodos para identificar a conectividade funcional específica do tipo de célula de entradas de longo alcance de regiões cerebrais distantes usando estimulações optogenéticas em fatias de cérebro ex vivo.

In vivo intracerebral injeções Estereotaxicas para estimulação Optogenética de entradas de longo alcance em fatias de cérebro de rato

Este método descreve uma preparação crônica que permite o acesso óptico ao hipocampo de camundongos vivos. Esta preparação pode ser utilizada para realizar imagens ópticas longitudinais de plasticidade estrutural neuronal e plasticidade celular evocada por atividade ao longo de um período de várias semanas.

Imagem latente longitudinal do dois-fotão do hipocampal dorsal CA1 em ratos vivos

Este trabalho descreve um método para observação crônica in vivo da microglia em repouso no CA1 do hipocampo de camundongos usando cirurgia precisamente controlada e microscopia de dois fótons.

In vivo Imagem crônica de dois fótons da microglia no hipocampo de camundongos

O giro dentado do hipocampo desempenha funções essenciais e distintas na aprendizagem e na memória. Este protocolo descreve um conjunto de procedimentos robustos e eficientes para imagens de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado em camundongos em movimento livre.

Imagem de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado do hipocampo em camundongos 

Aprenda a rastrear projeções de glutamato da VTA para o hipocampo usando optogenética e gravações eletrofisiológicas in vivo em camundongos. Este método permite mapear circuitos neurais e analisar a modulação sináptica em tempo real.

Rastreamento Anatômico e Funcional In Vivo dos Terminais de Glutamato da Área Tegmental Ventral no Hipocampo

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