Name: Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 51 s
Description: Aprenda a cultivar neurônios simpáticos de ratos embriônicos a partir de gânglios cervicais superiores para análises morfológicas e proteômicas. Este protocolo permite estudos detalhados de desenvolvimento neural.

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Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Desenvolvimento da Faculdade e pelo Programa de Pesquisa de Verão do Saint Mary's College of California. Os autores também gostariam de agradecer à Dra. Os autores também gostariam de agradecer Haley Nelson no Escritório de Comunicações Universitárias do Saint Mary's College of California por sua ajuda na produção e edição de vídeo.

Todos os procedimentos realizados em estudos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Saint Mary's College of California. As diretrizes de cuidado e uso de animais no Colégio Santa Maria foram desenvolvidas com base nas diretrizes fornecidas pelo Escritório de Bem-Estar Animal Laboratorial do Instituto Nacional de Saúde (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf e https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).
1. Preparação de meios culturais (também referido como meio de controle)
<ol><li>Adicione os seguintes ingredientes, na ordem listada abaixo, a um frasco estéril de 500 mL: 190 mL de DMEM de baixa glicose 1x, 10 mL de 20 mg/mL de gárbio bovino livre de ácido bovino (FAF-BSA) em DMEM, 2,8 mL de 200 mM L-glutamina, 4 mL de 100x de mistura insulina-selênio-transferrina, 0,4 mL de 125 μg/mL fator de crescimento nervoso (em estabilizador de proteína inerte de 0,2% no DMEM), e 200 mL do meio F-12 de Ham.</li>
	<li>Certifique-se de revestir a pipeta com o meio contendo FAF-BSA antes da adição de soluções que contenham proteínas, como insulina-selênio-transferrina e NGF para evitar a aderência de proteínas à pipeta.</li>
	<li>Gire o frasco para misturar os ingredientes após cada adição. Misture bem com uma pipeta de 25 mL após a adição de F-12.</li>
	<li>Aliquot a mídia de cultura em alíquotas de 10 mL e armazene a -80 °C. As alíquotas podem ser armazenadas por seis meses sem perda de atividade.</li>
</ol>2. Preparação de placas para cultivo de neurônios
<ol><li>Diluir um estoque de 1 mg/mL de poli-D-lysine (feito em tampão tris de 0,5 M, pH 8) a 100 μg/mL com água destilada estéril.</li>
	<li>Para análise proteômica ou genômica, de um a dois dias antes da dissecção, cubra placas de 6 poços com aproximadamente 2 mL de estéril 100 g/mL de poli-D-lysine (PDL). Isso é necessário para garantir a adesão celular ao poço. Enrole as placas com filme agarrado e armazene as placas durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Para análise morfológica e microscopia, coloque 12 mm2 tampas de vidro alemães pré-tratadas (que podem ser limpas usando tratamento de ácido nítrico como descrito anteriormente18 ou comprado) em cada um dos poços de uma placa de 24 poços.<ol>
<li>Cubra as tampas com 0,3 mL de estéril 100 g/mL de poli-D-lisina (PDL). Armazene as placas durante a noite a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>No dia da dissecção, antes do início da dissecção, remova a solução de poli-D-lysine dos poços e enxágue os poços cinco vezes com água destilada estéril, seguida por uma vez com DMEM de baixa glicose.</li>
	<li>Durante a digestão enzimática do gânglio (aproximadamente uma hora antes de emplacamento das células), aspire o DMEM das placas e substitua-o por 0,3 mL de mídia de controle. Armazene as placas a 35,5 °C abaixo de 5% de CO2 em uma câmara umidificada.</li>
</ol>3. Configuração de dissecação
<ol><li>Preparação de 200 mL de mídia para dissecção (referida como mídia de dissecção)<ol>
<li>Adicione 8 mL de 20 mg/mL de gória bovina livre de ácidos graxos (FAF-BSA) em DMEM de baixa glicose (com 1 mg/mL de glicose) e 2 mL de penicilina-estreptomicina de 100x a 193 mL de meio L-15 estéril de Leibovitz (ou qualquer meio tampão de ar)</li>
	</ol>
</li>
	<li>No capô, configurar os seguintes itens para dissecção: quatro tubos cônicos estéreis de 50 mL com cerca de 20 mL de mídia de dissecção em cada tubo, quatro pratos estéreis de 35 mm com 1,5 mL de mídia de dissecção, um tubo conônico estéril de 50 mL com 20 mL de mídia de dissecção para centrifugação, estéril de 15 mL conical tubo para centrifugação da grália , e um tubo estéril de 10 mL para a coleta das células dissociadas.</li>
	<li>Use um esterilizador de contas seca para esterilizar um par de fórceps finos (no.4 ou nº 5 fórceps) por pelo menos um minuto.</li>
</ol>4. Isolamento do gânglio cervical superior de filhotes de ratos embrionários
<ol><li>Remoção de embriões E21 do rato gestante NOTA: A remoção da buzina uterina pode ser realizada fora do capô se a área circundante estiver completamente esterilizada.<ol>
<li>Eutanize o rato grávida usando inalação de CO2. Tesourar a pele da região abdominal e limpar a pele na área com 70% de álcool para esterilizá-la.</li>
		<li>Usando um conjunto fresco de tesouras estéreis e fórceps, corte a pele e, em seguida, a camada muscular para expor os chifres uterinos contendo os embriões. Remova os chifres uterinos com os embriões usando um novo conjunto de tesouras e fórceps, tomando cuidado para não danificar os intestinos no processo.</li>
		<li>Transfira os chifres uterinos com os embriões em uma placa de Petri estéril de 150 mm2 e transfira-os para o capô.</li>
		<li>Usando um novo conjunto de fórceps e tesouras, remova os embriões do chifre uterino e separe os embriões das membranas amnióticas e da placenta.</li>
		<li>Para eutanásia dos embriões, corte a medula espinhal dos embriões ao longo da linha média sob o braço direito. Isso também reduzirá o sangramento da artéria carótida durante a remoção do SCG.</li>
		<li>Transfira esses embriões para os tubos cônicos preparados de 50 mL contendo mídia de dissecção. Certifique-se de que os embriões estão submersos na mídia. Cada tubo pode conter até 3 embriões.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento do gânglio cervical superior do embrião<ol>
<li>Transfira um filhote da mídia de dissecção para uma placa de Petri estéril de 150 mm2 meio cheia de substrato sólido (cera de parafina ou polímero de silicone), com sua superfície dorsal no substrato. Usando três agulhas estéreis de 23 G, fixe o filhote no prato com uma agulha sob cada braço e uma terceira agulha através da boca para hiperesturar cuidadosamente o pescoço.</li>
		<li>Corte a pele na região do pescoço usando fórceps finos estéreis (nº 4 ou nº 5 fórceps) para expor as glândulas salivares por baixo. Remova essas glândulas usando fórceps finos.</li>
		<li>Localize os músculos esternocleidomastoide e omoidóides perto da clavícula e traqueia, respectivamente. Primeiro corte os músculos esterocleidomastoides transversais e, em seguida, corte cuidadosamente o músculo omomóide fino usando fórceps finos. Uma vez removidos esses músculos, a bifurcação na artéria carótida na extremidade anterior será visível em ambos os lados da traqueia, com o SCG localizado sob este garfo na artéria carótida.</li>
		<li>Usando fórceps fechados, levante suavemente a artéria carótida para visualizar o SCG. Usando um fórceps em ambos os lados do SCG, retire a carótida e transfira-a para os pratos estéreis preparados de 35 mm2. Este tecido provavelmente conterá o SCG com a artéria carótida, o nervo vago com o gânglios de nodose, bem como outros segmentos de músculo ou gordura na área.</li>
		<li>Repita o processo de dissecção do outro lado. Remova os SCGs de todos os embriões antes de continuar com as etapas de dissecção restantes descritas abaixo. Distribua os tecidos isolados entre dois dos 35 mm2 pratos para facilitar o processamento das amostras de tecido.</li>
	</ol></li>
	<li>Pós-processamento do SCG<ol>
<li>Para separar o SCG do tecido dissecado, primeiro utilize fórceps finos para remover qualquer tecido ínteo, como gordura ou músculo, tomando cuidado para evitar a área próxima à bifurcação carótida.</li>
		<li>Uma vez que esses tecidos foram removidos, dois gânglios são visíveis. O gânglio de nodose é menor e circular, enquanto o SCG é em forma de amêndoa. Puxe suavemente o nervo vago para separar o nervo vago e o gânglios de nodose da carótida e, em seguida, separar o SCG da artéria carótida.</li>
		<li>Use fórceps finos para remover a cápsula que circunda o SCG. Transfira o SCG para um novo prato de cultura de 35 mm. Repita o processo com todas as amostras de tecido dissecada.</li>
		<li>Cubra uma pipeta de vidro esterilizada e plugada de algodão com mídia de dissecção para evitar que o tecido aduque nas paredes da pipeta. Use a pipeta para substituir a mídia de dissecção por estéril 2 mL de Collagenase tipo II (1 mg/mL)/dispase tipo II (5 mg/mL) em HBSS sem cálcio e magnésio, e incubar por 50 minutos a 37 °C para ajudar a quebrar os tecidos. NOTA: O tempo de incubação pode precisar ser otimizado com diferentes lotes de Colagenase/Dispase e geralmente varia de 40 minutos a uma hora.</li>
		<li>Durante a incubação, aspire o DMEM das placas e substitua-o por 0,3 mL de mídia de controle. Armazene as placas a 35,5 °C abaixo de 5% de CO2 em uma câmara umidificada.</li>
		<li>Após a incubação, transfira os SCGs em colagenase/dispase para um tubo cônico estéril de 15 mL. Use a mídia de dissecção para enxaguar as placas e transferir a solução para o tubo. Adicione mídia de dissecção suficiente para aumentar o volume para aproximadamente 10 mL.</li>
		<li>Centrifugar a 200 x g (1000 - 1200 rpm) por 5 minutos em temperatura ambiente para pelotar a amostra. Aspire o supernatante, tomando o cuidado de não desalojar a pelota. Resuspense a pelota com 10 mL de mídia de dissecção. Repita a centrifugação e descarte o supernatante.</li>
		<li>Substitua por 1 a 2 mL de meio de cultura. Usando uma pipeta pasteur estéril de ponta estreita e dobrada (pré-revestida com meio de cultura), dissociar mecanicamente as moitas triturando suavemente 5-6 vezes. Deixe os aglomerados maiores se contentarem por cerca de um minuto. Transfira a suspensão da célula supernante para um novo tubo de 10 mL.</li>
		<li>Repita este processo mais 3 vezes, com força crescente de trituração a cada vez para garantir a dissociação quase completa dos SCGs. Transfira o supernasce após cada rodada de trituração para um tubo de 10 mL com o sobrenante da primeira trituração.</li>
		<li>Adicione mídia cultural suficiente para aumentar o volume para 8 - 10 mL. Misture suavemente a suspensão celular e quantifique a densidade celular com um hemótmetro.</li>
		<li>Distribua a suspensão celular nos poços na densidade celular apropriada para os experimentos. Misture continuamente a suspensão da célula durante o processo de revestimento para garantir a distribuição uniforme das células nos poços. NOTA: Para análise morfológica, as células emplaquem cerca de 8.000 células/poço em 24 placas de poço e para protocolos genômicos e proteômicos, emplaquem as células até 30.000 células/bem.</li>
		<li>Transfira as placas para um desiccador de vidro com água estéril na parte inferior para criar uma câmara umidificada. Injete CO2 suficiente (cerca de 120 mL) para obter um ambiente de CO2 de 5% no desiccator, antes da vedação. Mantenha as placas a 35,5 °C. Isso é chamado de Dia 0 no protocolo. NOTA: Essas placas também podem ser mantidas em uma incubadora regular de CO2 de 5%. O método descrito acima minimiza as mudanças de temperatura e pH e também ajuda a evitar a contaminação cruzada.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Manutenção dos neurônios e tratamentos SCG cultivados
<ol><li>No dia 1 (24 horas após o revestimento), remova cuidadosamente metade da mídia cultural e substitua por 2 μM Ara-C (citosina β-D-arabinofuranoside, um agente anti-mitotístico). Deixe o tratamento nas células por 48 h. Normalmente, esse comprimento de tratamento é suficiente para eliminar células não neuronais na cultura.</li>
	<li>No dia 3, aspire suavemente metade do meio e substitua com meio de controle.</li>
	<li>No dia 4, as células estão prontas para tratamentos experimentais. Alimentar culturas a cada dois dias com o meio apropriado, substituindo suavemente metade do meio no poço por meio fresco.</li>
	<li>Neurônios SCG cultivados em meio livre de soro estendem apenas axônios. Se os experimentos requerem a presença de dendritos, trate as células com soro de bezerro fetal de 10%, 75-100 μg/mL de extrato de matriz de membrana do porão ou 50 ng/mL de proteína morfogenética óssea-7. O crescimento dendrático é observado dentro de 48 horas após o tratamento com arbor dendrítica elaborada observada dentro de uma semana de tratamento.</li>
</ol>6. Imunostaining cultivar neurônios SCG
<ol><li>Substitua gradualmente o meio de cultura celular no poço por 4% de paraformaldeído em tampão fosfato de 0,1 M, pH 7.2 em uma capa de fumaça.<ol>
<li>Remova metade da mídia cultural no poço e substitua-a suavemente por 4% de paraformaldeído. Em seguida, repita o processo pelo menos mais duas vezes, removendo dois terços da mídia no poço cada vez e substituindo por 4% de paraformaldeído. No final desse processo, a cor da mídia no poço deveria ter mudado de rosa para incolor.</li>
		<li>Uma vez que todo o meio tenha sido substituído por 4% de paraformaldeído, incubar os poços por 15 a 20 minutos em temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Com um processo semelhante ao descrito acima, substitua gradualmente a solução de paraformaldeído de 4% por soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS), pH 7.2. Deixe por 5 minutos. Enxágüe os poços mais duas vezes por 5 minutos cada com PBS.<ol>
<li>Uma vez removido o paraformaldeído de 4%, mova as placas para a bancada para posterior processamento. Este passo é um bom ponto de parada onde as placas podem ser armazenadas a 4 °C durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova toda a PBS. Adicione volume suficiente de 0,1% Triton X-100 em PBS para cobrir as células. Deixe nas culturas por 5 minutos para permeabiliizar os neurônios. O momento desta etapa é fundamental para garantir uma boa coloração, mantendo a integridade das células.</li>
	<li>Remova cuidadosamente a solução Triton X-100 e enxágue os poços três vezes por 5 minutos cada vez com PBS. Remova a solução PBS.</li>
	<li>Adicione 5% de BSA suficiente no PBS para cobrir as células e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos para reduzir a ligação de anticorpos não específicos.</li>
	<li>Remova a solução de bloqueio e substitua-a por um anticorpo monoclonal do rato contra a proteína MAP-2 diluída em 5% de BSA no PBS. Deixe o anticorpo primário nas células durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Remova e salve o anticorpo primário para reutilização. O anticorpo primário pode ser reutilizado pelo menos duas vezes sem perda de intensidade de detecção.</li>
	<li>Enxágüe três vezes com PBS suficiente para cobrir as células. Deixe pbs nas células por 10 minutos por enxágue.</li>
	<li>Remova a solução PBS e substitua-a por anticorpo secundário anti-rato IgG de cabra conjugado fluorescente a 1:1000 diluição em 5% de BSA no PBS. Incubar por 2 horas no escuro à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova o anticorpo secundário e substitua-o por PBS. Enxágüe os poços três vezes com PBS por 10 minutos por enxágue. Enxágüe os poços uma vez com água para remover os sais.</li>
	<li>Monte as tampas em lâminas de vidro contendo uma gota de montário aquoso que é apropriado para amostras fluorescentes rotuladas. Armazene os slides a 4 °C, em uma pasta de slides até estar pronto para a imagem.</li>
</ol>7. Preparação amostral para análise do proteome utilizando cromatografia líquida aliada à espectrometria de massa
<ol><li>Lise de neurônios cultivados<ol>
<li>Remova suavemente todos os meios de comunicação culturais dos poços. Substitua-o por soro fisiológico frio, estéril e sem fosfato livre de fosfato (PBS), pH 7.4. Retire rapidamente e substitua com PBS e deixe descansar por 5 minutos. Este passo é feito para remover quaisquer proteínas presentes na mídia cultural.</li>
		<li>Remova cuidadosamente todo o PBS de todos os poços para um tratamento específico. Repita o processo mais uma vez. Mantenha placas sobre gelo ao lise as células para minimizar danos neuronais e proteólise.</li>
		<li>Adicione 100 - 150 μL de 50 mM de bicarbonato de amônio, pH 7.5 (NH4HCO3) a um dos poços e raspar células usando um raspador de células estéril. Usando uma micropipette, transfira o líquido e repita o processo de raspagem com todos os poços para um tratamento específico. Examine os poços sob o microscópio depois de raspar para ter certeza de que a maioria das células foram removidas.<ol>
<li>Com o baixo número de neurônios, use um volume limitado para lise as células para garantir alta concentração suficiente para análise proteômica.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Congele a solução a -80 °C durante a noite para ajudar com a lise celular. Os lises podem ser armazenados nesta fase até estarem prontos para posterior processamento.</li>
		<li>Uma vez descongelado, esguiche as amostras através de uma seringa com uma agulha de 26 G ou 28 G para lise mecanicamente as células.</li>
		<li>Sonicar as amostras em um banho de água sônica duas vezes por 10 minutos. Adicione gelo ao banho de água para evitar superaquecimento e desnaturação de proteínas. Centrífuga por 5 minutos a 4 °C a 12.000 x g.</li>
		<li>Meça a concentração de proteínas. As concentrações típicas de proteína variam de 0,4 a 1 μg/μL</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da amostra e digestão de trippsina para análise de proteome<ol>
<li>Transfira um máximo de 60 μL do lysate ou 50 μg de proteína em um tubo DNase-, RNase e sem protease de 1,5 mL. Se o volume do lysato for inferior a 60 μL, adicione bicarbonato de amônio suficiente de 50 mM para compensar o volume.</li>
		<li>Adicione 25 μL de 0,2% de surfactante labile ácido e vórtice. Incubar o tubo em um aquecedor de bloco a 80 °C por 15 minutos. Centrifugar o tubo a 12.000 x g para 30 s.</li>
		<li>Adicione 2,5 μL de dithiothiothreitol e vórtice de 100 mM. Isso torna a proteína mais acessível para alquilação e digestão. Incubar o tubo a 60 °C em um aquecedor de bloco por 30 minutos. Esfrie a temperatura ambiente e centrífuga.</li>
		<li>Adicione 2,5 μL de iodoacetamida de 300 mM à amostra e vórtice. Este passo ajuda a aquilar os cisteínas e os impede de reformar os laços de dissulfeto. Incubar os tubos à temperatura ambiente no escuro por 30 minutos.</li>
		<li>Adicione trippsina de grau de espectrometria de massa (0,5 μg/μL) ao tubo em uma trippsina: razão proteica de 1:10. Digerir as amostras a 37 °C durante a noite.</li>
		<li>Adicione 10 μL de ácido trifluoroacético de 5% (TFA) e vórtice. Incubar as amostras a 37 °C por 90 minutos. Esta etapa é necessária para hidrolisar o surfactante labile ácido para evitar interferência durante a espectrometria de massa.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 12.000 x g a 4 °C por 30 minutos e transferir supernasal para um frasco de vidro transparente certificado pela cromatografia com tampas de teflon/silicone pré-fenda. As amostras podem ser armazenadas a -20 °C antes da análise da espectrometria de massa.</li>
		<li>Submeter os frascos de amostra à cromatografia líquida, juntamente com espectrometria de massa de alta definição.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo descreve os protocolos para cultivar neurônios simpáticos de gânglios cervicais superiores de filhotes de ratos embrionários. As vantagens de utilizar esse sistema modelo são que é possível obter uma população homogênea de neurônios fornecendo uma resposta semelhante aos fatores de crescimento, e como os requisitos do fator de crescimento para esses neurônios têm sido bem caracterizados, é possível cultivar esses neurônios in vitro em meios definidos, sob condições livres de soro10. Em...

Neurônios simpáticos derivados de gânglios cervicais superiores embrionários (SCG) têm sido amplamente utilizados como um sistema de cultura neuronal primária para estudar muitos aspectos do desenvolvimento neuronal, incluindo a dependência do fator de crescimento, interações neurônio-alvo, sinalização neurotransmissor, crescimento axonal, desenvolvimento de dendrite e plasticidade, sinápsogênese e mecanismos de sinalização subjacentes às interações nervo-alvo/neurônio-glia1,,2,,3,,4,,5,,6,,7,,8,,9. Apesar de seu pequeno tamanho (cerca de 10000 neurônios/gânglios), existem três razões principais para o desenvolvimento e uso extensivo desse sistema cultural serem i) sendo o primeiro gânglio na cadeia simpática, eles são maiores e, portanto, mais fáceis de isolar, do que o resto da gânglio simpático10; ii) ao contrário dos neurônios centrais, os neurônios no SCG são bastante homogêneos com todos os neurônios sendo derivados da crista neural, tendo um tamanho semelhante, dependência do fator de crescimento nervoso e sendo nor-adrenérgico. Isso os torna um modelo valioso para estudos morfológicos e genômicos10,,11 e iii) esses neurônios podem ser mantidos em um meio definido sem soro contendo fator de crescimento nervoso por mais de um mês10,12. Os neurônios SCG perinatal têm sido amplamente utilizados para estudar os mecanismos subjacentes à iniciação e manutenção dos dendritos2. Isso ocorre principalmente porque, embora os neurônios SCG tenham uma extensa arbor ndrítica in vivo, eles não estendem dendritos in vitro na ausência de soro, mas podem ser induzidos a cultivar dendritos na presença de certos fatores de crescimento, como proteínas morfogenéticas ósseas2,,12,,13.
Este artigo descreve o protocolo para isolar e culminar neurônios SCG de ratos embrionários. Nos últimos 50 anos, as culturas neuronais primárias do SCG têm sido utilizadas principalmente para estudos morfológicos com um número limitado de estudos examinando as mudanças genômicas ou proteômicas em larga escala. Isso se deve principalmente ao pequeno tamanho do tecido, resultando no isolamento de baixas quantidades de DNA ou proteína, o que dificulta a realização de análises genômicas e proteômicas nesses neurônios. No entanto, nos últimos anos, o aumento da sensibilidade à detecção permitiu o desenvolvimento de métodos para examinar o genoma, o miRNome e o proteome nos neurônios SCG durante o desenvolvimento do crescimento dendrítico14,,15,,16,17. Este artigo também descreverá o método de análise morfológica desses neurônios usando a imunocitoquímica e um protocolo para obter extratos de proteína neuronal para análise espectrométrica de massa.

<table><tbody><tr><td>2D nanoACQUITY</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>BMP-7</td><td>R& D Systems</td><td>354-BP</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Alumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Corning</td><td>CLS-3010</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar ou Nunc Placas de cultura de células de fundo plano</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200, 140675, 142475</td><td></td></tr><tr><td>Citosina- &beta;- D-arabinofuranosídeo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>D-fosfato tamponado salino (sem cálcio e magnésio)</td> <td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>Água Destilada</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - Baixa glicose + Glutamina, + piruvato de sódio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>Calbiochem</td><td>BSA Livre de Ácidos Graxos</td><td>126609</td><td>20 mg/mL estoque em baixa glicose DMEM</td></tr><tr><td>Fórceps Fina Dumont no.4 e no.5</td><td>Ted Pella Inc</td><td>5621, 5622</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps e Tesouras para Dissecção</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1328, 1329, 5002</td><td></td></tr><tr><td>Lábios de cobertura de vidro - 12mm</td><td>Neuvitro Corporation</td><td>GG-12</td><td></td></tr><tr><td>IgG Anti Camundongo Cabra Alexa 488 conjugado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32723</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de Nutrientes F-12 da Ham's</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765</td><td></td></tr><tr><td>Solção de sal balanceada Hank's (sem cálcio e magnésio)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14185</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Selênio-Transferrina (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 meio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>Mídia de montagem para lamínulas</td><td>de vidro Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931, P36934</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-MAP2 de camundongo (SMI-52)</td><td>BioLegend</td><td>SMI 52</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento nervoso</td><td>Envigo Bioproducts (anteriormente Harlan Bioproducts)</td><td>BT5017</td><td>Stock 125 &mu; g/mL em 0,2% de Prionex em DMEM</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>P1010</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Prionex</td><td>Millipore</td><td>529600</td><td>Solução de 10%, 100 mL</td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters Corporation</td><td>186001861</td><td>5 X 1 mg</td></tr><tr><td>Synapt G2 Espectrometria de Massa de Alta Definição</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trifluoro ácido acético - Grau de sequenciamento</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28904</td><td>10 X 1 mL</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Promega ou NEB</td><td>V511A, P8101S</td><td>100 &mu; g ou 5</td></tr><tr><td>frascos de recuperação total de águas</td> de 20 mg <td>Waters Corporation</td><td>186000385c</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing rat sympathetic neurons from embryonic superior cervical ganglia for morphological and proteomic analysis

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Neurônios simpáticos da gânglio cervical superior de rato embrionário (SCG) têm sido usados como um sistema modelo in vitro para neurônios periféricos estudarem crescimento axonal, tráfico axonal, sinápgeno, crescimento dendrático, plasticidade dendrítica e interações de alvo nervoso em sistemas de cocultura. Este protocolo descreve o isolamento e dissociação de neurônios da gânglio cervical superior dos embriões de ratos E21, seguido pela preparação e manutenção de culturas neuronais puras em meio livre de soro. Como os neurônios não aderem ao plástico não revestido, os neurônios serão cultivados em tampas de vidro de 12 mm ou em placas de 6 poços revestidas com poli-D-lisina. Após o tratamento com um agente antimitotico (Ara-C, citose β-D-arabinofuranoside), este protocolo gera culturas neuronais saudáveis com menos de 5% de células não neuronais, que podem ser mantidas por mais de um mês in vitro. Embora os neurônios SCG de ratos embrionários sejam multipolares com dendritos de 5-8 in vivo; sob condições livres de soro, esses neurônios estendem apenas um único axônio na cultura e continuam a ser unipolares durante a duração da cultura. No entanto, esses neurônios podem ser induzidos a estender dendritos na presença de extrato de membrana do porão, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), ou 10% de soro fetal da panturrilha. Essas culturas neuronais homogêneas podem ser utilizadas para coloração imunocitológica e para estudos bioquímicos. Este artigo também descreve o protocolo otimizado para coloração imunocitômica para microtúbulos associados à proteína-2 (MAP-2) nesses neurônios e para a preparação de extratos neuronais para espectrometria de massa.

Isolar e manter culturas neuronais de neurônios SCG embrionários As células dissociadas do SCG embrionário de rato foram banhadas em uma placa revestida de poli-D-lisina ou deslizamento de cobertura e mantidas em meios de cultura livre de soro contendo fator de crescimento b-nervo. As células dissociadas contendo uma mistura de neurônios e células gliais parecem circulares sobre o revestimento(Figura 1A). Dentro de 24 horas após o revestimento, os neurônios estendem peque...

Este artigo descreve o isolamento e a culminação de neurônios simpáticos de ratos embrionários da gânglio cervical superior. Também fornece protocolos detalhados para coloração imunocitoquímica e para preparação de extratos neuronais para análise espectrométrica em massa.

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

Neste vídeo, estaremos demonstrando a culminação da gânglio cervical superior de ratos embrionários para análise morfológica e proteômica. Antes de iniciar a dissecção, prepare o controle e a dissecação dos meios de comunicação. O meio de controle contém F-12 e DMEM de baixa glicose suplementado com uma mistura de insulina-selênio-transferrina, glutamina, fator de crescimento nervoso e BSA.O meio de dissecção contém L-15 complementado com pen-estreptococos e BSA. Consulte o manuscrito para obter protocolos detalhados para preparação da mídia. Preparação de placas para os neurônios de cultivo.Diluir um miligrama por mililitro de poli-D-lysine a 100 microgramas por mililitro com água destilada estéril. Para análise proteômica ou genômica, de um a dois dias antes da dissecção, cubra placas de seis poços com aproximadamente dois mililitros de 100 gramas estéreis por mililitro de poli-D-lysine. Isso é necessário para garantir a adesão celular ao poço.Enrole as placas com filme agarrado e armazene as placas durante a noite a quatro graus Celsius. No dia da dissecção, antes do início da dissecção, remova a solução de poli-D-lysine dos poços e enxágue os poços cinco vezes com água destilada estéril, seguida por uma vez com DMEM de baixa glicose. Durante a digestão enzimática do gânglio, aproximadamente uma hora antes de emplacamento das células, aspire o DMEM das placas e substitua-o por 0,3 mililitros de meio de controle.Armazene as placas a 35 graus Celsius abaixo de 5% de CO2 em uma câmara umidificada. No capô, configure os seguintes itens para dissecção. Quatro tubos cônicos estéreis de 50 mililitros com cerca de 20 mililitros de mídia de dissecção em cada tubo.Quatro pratos estéreis de 35 milímetros com 1,5 mililitros de mídia de dissecção. Um tubo cônico estéril de 50 mililitros com 20 mililitros de mídia de dissecção para centrifugação. Um tubo cônico estéril de 15 mililitros para centrifugar o gânglio, um tubo estéril de 10 mililitros para coletar as células dissociadas.Use um esterilizador de contas secas para esterilizar um par de fórceps finos por pelo menos um minuto. Todos os procedimentos realizados em estudos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Saint Mary's College of California. As diretrizes de cuidado e uso de animais no Saint Mary's College of California foram desenvolvidas com base em diretrizes fornecidas pelo Escritório de Bem-Estar Animal Laboratorial dos Institutos Nacionais de Saúde.Remoção de embriões E21 da rato grávida. Observe que a remoção da buzina uterina pode ser realizada fora do capô se a área circundante estiver completamente esterilizada. Eutanize um rato grávida com inalação de CO2.Tesourar a pele da região abdominal e limpar a pele na área com 70% de álcool para esterilizá-la. Usando um conjunto fresco de tesouras estéreis e fórceps, corte a pele e, em seguida, o músculo para expor os chifres uterinos contendo os embriões. Remova o chifre uterino com os embriões, utilizando um novo conjunto de tesouras e fórceps, tomando cuidado para não danificar os intestinos no processo.Transfira o chifre uterino com os embriões em placa de Petri estéril de 150 milímetros e transfira-os para o capô. Usando um novo conjunto de fórceps e tesouras, remova os embriões do chifre uterino e separe os embriões das membranas amnióticas e da placenta. Para eutanásia dos embriões, corte a medula espinhal dos embriões ao longo da linha média sob o braço direito.Isso reduzirá o sangramento da artéria carótida durante a remoção do SCG. Transfira esses embriões para os tubos cônicos preparados de 50 mililitros contendo mídia de dissecção. Certifique-se de que os embriões estão submersos na mídia.Cada tubo pode conter até três embriões. Isolamento do gânglio cervical superior do embrião. Transfira um filhote da mídia de dissecção para uma placa de Petri estéril de 150 milímetros meio cheia de substrato sólido com sua superfície dorsal no substrato.Usando três agulhas estéreis de calibre 23, fixe o pub no prato com uma agulha sob cada braço e uma terceira agulha através da boca para hiperextendar cuidadosamente o pescoço. Corte a pele na região do pescoço usando fórceps finos estéreis para expor as glândulas salivares por baixo. Remova essas glândulas usando fórceps finos.Localize os músculos estenicleidomastoide e omoidóides perto da clavícula e traqueia, respectivamente. Primeiro, corte os músculos estenicleidomastoides transversais. E então corte cuidadosamente o músculo omomóide fino usando fórceps finos.Uma vez removidos esses músculos, a bifurcação na artéria carótida na extremidade anterior, será visível em ambos os lados da traqueia com o SCG localizado sob este garfo na artéria carótida. Usando fórceps fechados, levante suavemente a artéria carótida para visualizar o SCG. Usando um fórceps em ambos os lados do SCG, retire a carótida e transfira-a para os pratos estéreis preparados de 35 milímetros.Este tecido provavelmente conterá o SCG com a artéria carótida, o nervo vago com o gânglios de nodose, bem como outros segmentos de músculo ou gordura na área. Repita o processo de dissecção do outro lado. Remova os SCGs de todos os embriões antes de continuar com as etapas de dissecção restantes descritas.Distribua os tecidos isolados entre dois dos pratos de 35 milímetros para facilitar o processamento das amostras de tecido. Pós-processamento do SCG. Para separar o SCG do tecido dissecado, primeiro utilize fórceps finos para remover qualquer tecido ínteo, como músculo ou gordura, tomando cuidado para evitar a área próxima à bifurcação carótida.Uma vez que esses tecidos foram removidos, dois gânglios são visíveis. O gânglio de nodose é menor e circular, enquanto o SCG tem forma de amêndoa. Puxe suavemente o nervo vago para separar o nervo vago e o gânglio nodose da carótida e, em seguida, separar o SCG da artéria carótida.Use fórceps finos para remover a cápsula que circunda o SCG. Transfira o SCG para um novo prato de cultura de 35 milímetros. Repita este processo com todas as amostras de tecido dissecado.Cubra uma pipeta de vidro esterilizada e plugada de algodão com mídia de dissecção para evitar que o tecido adque nas paredes da pipeta. Use a pipeta para substituir a mídia de dissecção por dois mililitros estéreis de colagenase tipo II, dispase tipo II em HBSS sem cálcio e magnésio e incubar por 50 minutos a 37 graus Celsius para ajudar a quebrar os tecidos. Observe que os tempos de incubação podem precisar ser otimizados com diferentes lotes de colagenase/dispase e geralmente varia de 40 minutos a uma hora.Após a incubação, transfira os SCGs e a colagem/dispase para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Use a mídia de dissecção para enxaguar as placas e transferir a solução para o tubo. Adicione mídia de dissecção suficiente para levar o volume a aproximadamente 10 mililitros.Centrifugar a 200 x g, 1.000 a 1.200 rpm por cinco minutos em temperatura ambiente para pelotar a amostra. Aspire o supernatante, tomando o cuidado de não desalojar a pelota. Resuspenque a pelota com 10 mililitros de mídia de dissecção, repita a centrifugação e descarte o supernatante.Substitua por um a dois mililitros de meio de cultura. Usando uma pipeta pasteur estéril de furo estreito, pré-revestida com meio de cultura, dissociar mecanicamente as moitas triturando suavemente cinco a seis vezes. Deixe os aglomerados maiores se contentarem por cerca de um minuto e transfira a suspensão celular supernacante para um novo tubo de 10 mililitros.Repita este processo mais três vezes com força crescente de trituração cada vez para garantir a dissociação quase completa dos SCGs. Transfira o supernante após cada rodada de trituração para o tubo de 10 mililitros com o sobrenante da primeira trituração. Adicione mídia cultural suficiente para trazer o volume para oito a 10 mililitros.Misture suavemente uma suspensão celular e quantifique a densidade celular com um hemótmetro. Distribua a suspensão celular nos poços na densidade celular apropriada para os experimentos. Misture continuamente a suspensão da célula durante o processo de revestimento para garantir a distribuição uniforme das células nos poços.Para análise morfológica, a placa das células em torno de 8.000 células por poço em uma placa de 24 poços. E para protocolos genômicos e proteômicos, assode as células até 30.000 células por poço. Transfira as placas para um desiccador de vidro com água estéril na parte inferior para criar uma câmara umidificada.Injete CO2 suficiente, em torno de 120 mililitros, para obter um ambiente de CO2 de 5% no desiccator, antes da vedação. Mantenha as placas a 35,5 graus Celsius. Isso é referido como o dia zero no protocolo.Essas placas também podem ser mantidas em uma incubadora regular de 5% de CO2. O método descrito acima minimiza as mudanças de temperatura e pH e também ajuda a evitar a contaminação cruzada. Manutenção dos neurônios e tratamentos SCG cultivados.Estas fotos mostram as células gânglios cervicais superiores dissociadas no dia zero, primeiro dia e quinto dia. A imagem do dia zero mostra as células ao chapeamento. As células banhadas no dia zero contêm uma mistura de células neuronais e não neuronais.No primeiro dia, 24 horas após o revestimento, remova cuidadosamente metade da mídia cultural e substitua por dois micromolar Ara-C, citosina D-arabinofuranoside, um agente anti-mitotístico. Deixe o tratamento nas células por 48 horas. Normalmente, esse comprimento de tratamento é suficiente para eliminar células não neuronais na cultura.No terceiro dia, aspire suavemente metade do meio e substitua com meio de controle. No quarto dia, as células estão prontas para tratamentos experimentais. Alimentar culturas a cada dois dias com o meio apropriado.Substituindo suavemente metade do meio no poço por meio fresco. O quadro do quinto dia mostra um crescimento axonal extenso sem crescimento dendrático observado. Para induzir o crescimento dendrítico, os neurônios podem ser cultivados em Matrigel ou tratados com 10% de soro ou 50 nanogramas por mililitro de proteína morfogenética óssea-7.A figura dois mostra alterações na morfologia neuronal dos neurônios SCG de ratos E21 após o tratamento com BMP-7. Micrografos de contraste de fase representativo em 10 X de ampliação mostram o corpo celular neuronal circular com axônios em neurônios de controle no painel A, e neurônios com múltiplos processos curtos de dendrite quando tratados com BMP-7 mostrados pelas setas no painel B.Neurônios cultivados SCGs após tratamentos apropriados podem ser usados para análise morfológica usando coloração imunocitômica para análise genômica e para estudos bioquímicos , como para análises proteômicas. Consulte o manuscrito para obter protocolos detalhados para imunosstaining e preparação de amostras para análise proteômica.A Figura Três mostra imunossuagem da proteína MAP-2 em ratos embrionários cultivados neurônios simpáticos. Os painéis A a D mostram neurônios SCG cultivados tratados com mídia de controle e painéis E a H mostram neurônios tratados com BMP-7 a 50 nanogramas por mililitro por cinco dias. Micrografos representativos mostrando a coloração imunocitoquímica dos neurônios com proteína associada a microtúbulos-2 em C e G, uma mancha nuclear em D e H com micrografias de contraste de fase em B e F, e emergem dos três canais em A e D.Milímbicos manchas de proteína associada a microtúbulos-2 está presente no corpo celular e axônios proximais de neurônios de controle no painel C.E manchas da proteína MAP-2 no corpo celular , e dendritos em neurônios tratados BMP-7 está no painel G.Aqui está uma amostra de gânglio cervical superior tratado com mídia de controle, que detectou 1.100 proteínas.A ontologia genética usando o banco de dados Panther descobriu que a maioria das proteínas eram citoplasmáticas. No entanto, havia proteínas e proteínas ligadas à membrana nas junções celulares na amostra. Esta análise também revelou que proteínas envolvidas em uma ampla gama de vias de sinalização neuronal foram detectadas na amostra.Em conclusão, depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de isolar e cultivar neurônios de gânglio cervical superior embrionários para análise morfológica e proteômica. Este trabalho foi financiado pelo fundo de desenvolvimento do corpo docente e pelo programa de pesquisa de verão no Saint Mary's College of California.

culturing-rat-sympathetic-neurons-from-embryonic-superior-cervical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este é um protocolo que descreve como isolar e cultura primária de neurônios simpáticos gânglios cervical superior (GCS) de filhotes de rato recém-nascido.

Protocolo para Neurônios Cultivar Sympathetic de Gânglios Superior Rat Cervical (SCG)

Nós descrevemos um protocolo para a utilização de proteína morfogenética óssea-7 (BMP-7) ou Matrigel para selectivamente induzir o crescimento dendrítica em primárias neurónios simpáticos dissociadas do gânglio cervical superior (SCG) de ratos neonatais.

Induzir o crescimento dendrítico no cultivadas neurônios simpáticos

O protocolo descreve um sistema de modelo eficiente e reprodutível para estudar vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) a latência e reactivação. O ensaio emprega homogéneos culturas de neurónios simpáticos e permite a dissecção molecular do vírus de neurónios-interacções usando uma variedade de ferramentas, incluindo a interferência de RNA e de expressão de proteínas recombinantes.

Um sistema de cultura primária Neuron para o Estudo da Herpes Simplex Virus latência e reativação

Este vídeo demonstra um procedimento para isolar neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) de embriões de ratos e co-cultivá-los com precursores de células de Schwann para gerar células de Schwann maduras. Os DRGs isolados são processados para isolar neurônios e células gliais. As células isoladas são cultivadas para purificar os neurônios, que são então co-cultivados com células semelhantes a células de Schwann (SCLCs) em um meio de co-cultura. A interação com os neurônios DRG leva à maturação...

Isolamento de neurônios DRG e cocultura com precursores de células de Schwann para gerar células de Schwann

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar e cultivar células dos gânglios da raiz dorsal (DRG) da coluna vertebral de ratos. Os DRGs excisados da coluna vertebral são tratados com enzimas e dissociados mecanicamente para obter uma suspensão unicelular. As células são cultivadas em um meio contendo inibidores e fatores de crescimento que limitam a proliferação de células gliais e promovem o crescimento neuronal, respectivamente.

Estabelecendo uma cultura de células de gânglios da raiz dorsal primária a partir de uma coluna vertebral de rato

Aqui descrevemos uma célula de Schwann (SC) ensaio de migração em que SCs são capazes de desenvolver ao longo dos axônios estendem.

Analisando o desenvolvimento de células de Schwann Murino Junto axônios em crescimento

Um protocolo para gerar um sistema de co-cultura consistindo de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), neurônios corticais primários e astrócitos é descrito. Este sistema de co-cultura permite a detecção da formação de contatos e circuitos sinápticos entre novos neurônios derivados de iPSC e neurônios corticais pré-existentes que expressam channelrhodopsina-2.

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

Os principais gânglios pélvicos contêm neurônios parassimpáticos e simpáticos que inervam os órgãos pélvicos. Aqui descrevemos um método de dissecção e fornecemos esquemas para identificação desses gânglios e seus nervos associados. Esses métodos podem ser aplicados à manipulação experimental desses gânglios in vivo ou à remoção pós-morte para estudos posteriores.

Dissecção de Gânglios Autônomos Pélvicos e Nervos Associados em Ratos Masculinos e Femininos

Alterações fisiopatológicas no sistema nervoso autônomo cardíaco, especialmente em seu ramo simpático, contribuem para o surgimento e manutenção de arritmias ventriculares. No presente protocolo, mostramos como caracterizar gânglios estelares murinos para melhorar a compreensão dos processos moleculares e celulares subjacentes.

Localização, Dissecção e Análise do Gânglio Murine Stellate

Este protocolo descreve a preparação detalhada e de baixa entrada da amostra para sequenciamento de núcleo único, incluindo a dissecção de gânglios cervicais e estelares superiores do rato, dissociação celular, criopreservação, isolamento do núcleo e bar codificação de hashtag.

Isolamento de núcleo de baixa entrada e multiplexing com anticorpos de código de barras de ganglia simpatizante do rato para sequenciamento de RNA de núcleo único

O presente protocolo descreve um modelo murino de ablação de inervação adrenérgica através da identificação e ressecção do gânglio cervical superior.

Técnica cirúrgica para ganglionectomia cervical superior em modelo murino

Aprenda a cultivar neurônios simpáticos de ratos embriônicos a partir de gânglios cervicais superiores para análises morfológicas e proteômicas. Este protocolo permite estudos detalhados de desenvolvimento neural.

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

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