Avaliação da morte celular usando supernanato livre de células de probióticos em culturas esferoides tridimensionais de células cancerígenas colorretais
13 de junho de 2020
Aqui são apresentados métodos para entender os efeitos anticânculos do supernatante livre de células Lactobacillus (LCFS). As linhas de células cancerígenas colorretais mostram mortes celulares quando tratadas com LCFS em culturas 3D. O processo de geração de esferoides pode ser otimizado dependendo do andaime e os métodos de análise apresentados são úteis para avaliar as vias de sinalização envolvidas.
Este protocolo foi otimizado para facilitar a investigação do efeito anticancerígeno do sobrenadante livre de células de Lactobacillus em vários tipos de esferóides de células de câncer de cólon. Esta técnica é a primeira abordagem que investiga os efeitos anticancerígenos do LCFS em esferoides de câncer de cólon sob condições de mimetismo in vivo. Comece colocando uma placa de ágar MRS esterilizada em autoclave em uma câmara anaeróbica de hidrogênio a 37 graus Celsius com 20 partes por milhão de oxigênio e inoculando a placa com estoque bacteriano de Lactobacillus recém-descongelado.
Adicione dois a três mililitros de caldo MRS, suplementado com l-cisteína ao tubo e sele o tubo com a rolha de borracha butílica e a tampa do tubo. Em seguida, use um laço para coletar uma única colônia e coloque a colônia em um tubo de cultura de 1,5 mililitro contendo 500 microlitros de PBS. Ressuspenda a colônia homogeneamente dentro da solução salina e carregue toda a suspensão bacteriana em uma seringa de um mililitro.
Insira a agulha no centro da tampa do tubo de cultura e entregue a colônia no meio. Coloque a cultura em uma incubadora agitada a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 200 rotações por minuto. Após dois dias, medir o OD620 da cultura num espectrofotómetro.
Quando o OD620 for igual a dois, sedimente as bactérias por centrifugação e lave o pellet de bactérias com PBS. Após a segunda centrifugação, ressuspender as bactérias em quatro mililitros de RPMI 1640, suplementado com soro bovino fetal a 10% sem antibióticos e colocar as bactérias na incubadora agitada por quatro horas a 100 rotações por minuto. No final da incubação, pelete as bactérias por centrifugação e filtre o sobrenadante recuperado através de um filtro de 0,22 mícron para armazenamento de menos 80 graus Celsius.
Para preparar linhagens celulares de câncer colorretal para a formação de esferoides, cultive as células de interesse como monocamadas em placas de Petri de 100 milímetros na incubadora de cultura de células. Quando as células atingirem uma confluência de 70 a 80%, lave as culturas duas vezes com quatro mililitros de PBS por lavagem antes de separar as células com um mililitro de 0,25% de tripsina-EDTA por prato. Após dois minutos, verifique se há dissociação em um microscópio óptico.
Se as células se desprenderem, neutralize a reação enzimática com cinco mililitros de meio de crescimento. Colete as células por centrifugação em um tubo cônico de 15 mililitros por cultura de células e ressuspenda suavemente os pellets com três mililitros de meio de crescimento por tubo. Em seguida, conte o número de células viáveis por exclusão de azul de tripano.
Após a contagem, dilua as células para uma a duas vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro de concentração em meio fresco e adicione metilcelulose às células até uma concentração final de 0,6%. Transfira as células para um reservatório estéril e use uma pipeta multicanal para dispensar 200 microlitros de células para cada poço de uma microplaca de fundo redondo de 96 poços de fixação ultrabaixa. Em seguida, colocar a placa na incubadora de cultura de células durante 24 a 36 horas antes de verificar a formação de esferoides por microscopia de luz.
Para o tratamento com LCFS, dilua em série a solução de estoque de LCFS descongelada preparada em meio de crescimento fresco para concentrações de 25, 12,5 e 6% e use uma pipeta de 200 microlitros para remover cuidadosamente o máximo de sobrenadante possível de cada poço das culturas de linha de células de câncer colorretal plaqueadas. Em seguida, adicione suavemente 200 microlitros de meio de crescimento suplementado com LCFS em triplicado a cada conjunto de células cancerígenas e retorne a placa à incubadora por mais 24 a 48 horas. Uma concentração de metilcelulose de 0,6% transforma as células da linha de células cancerígenas testadas em esferóides compactos, indicando que os esferoides podem ser gerados a partir de vários tipos de câncer colorretal usando este protocolo.
Os esferoides cultivados com 25% LCFS exibem superfícies rompidas e uma viabilidade celular diminuída de maneira dose-dependente. De fato, as células co-cultivadas com LCFS demonstram níveis mais altos de expressão de iodeto de propídio em comparação com as células de controle viáveis. A análise de PCR da transcriptase reversa, Western blotting e análise de citometria de fluxo anexina V/7-AAD também podem ser realizadas para avaliar os efeitos do LCFS na apoptose das células cancerígenas.
Certifique-se de manusear os esferóides com cuidado ao remover o meio de crescimento, pois os esferoides podem quebrar facilmente, impossibilitando a observação do efeito do tratamento com LCFS. Após este procedimento, ensaios de viabilidade celular, PCR quantitativo em tempo real, Western blotting e análise FACS podem ser realizados para caracterizar o efeito anticancerígeno do LCFS em maior detalhe.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para investigar os efeitos anticâncer do sobrenadante livre de células de Lactobacillus (LCFS) em esferoides de câncer de cólon. O estudo otimiza a geração de esferoides e avalia as vias de sinalização envolvidas na morte celular.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa em Câncer
Contexto
- Sabe-se que o Lactobacillus possui potenciais benefícios para a saúde.
- Os sobrenadantes livres de células podem conter compostos bioativos.
- O câncer colorretal continua sendo um desafio significativo para a saúde.
- Culturas celulares 3D mimetizam melhor as condições in vivo.
Objetivo do Estudo
- Explorar os efeitos anticâncer do LCFS em esferoides de câncer de cólon.
- Otimizar técnicas de geração de esferoides.
- Analisar as vias de sinalização envolvidas nos efeitos observados.
Métodos Utilizados
- Preparação de placas de ágar MRS em uma câmara anaeróbica.
- Inoculação das placas com estoque bacteriano de Lactobacillus.
- Cultivo de bactérias em caldo MRS suplementado com l-cisteína.
- Coleta e ressuspendimento das colônias bacterianas para tratamento.
Resultados Principais
- Linhas celulares de câncer colorretal exibiram morte celular quando tratadas com LCFS.
- Métodos otimizados de geração de esferoides melhoraram os resultados experimentais.
- As vias de sinalização envolvidas na morte celular foram efetivamente analisadas.
- O estudo fornece uma abordagem nova para a pesquisa de tratamento do câncer.
Conclusões
- O LCFS mostra potencial como agente anti-câncer.
- As técnicas de cultivo 3D são essenciais para modelagem precisa.
- São necessárias mais pesquisas para compreender totalmente os mecanismos envolvidos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite que equipes de P&D de biofármacos avaliem sobrenadantes derivados de probióticos quanto à atividade anticâncer em modelos fisiologicamente relevantes de câncer colorretal tridimensionais. Ao utilizar o sobrenadante livre de células de Lactobacillus fermentum (LCFS) em culturas estáveis de esferoides, o método auxilia na desmistificação mecanicista de candidatos a produtos naturais e melhora a confiança preditiva nos esforços de validação de alvos. A abordagem conecta a triagem em estágio de descoberta com relevância translacional, modelando interações do microambiente intestinal que influenciam a viabilidade das células cancerígenas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses terapêuticas relativas a metabólitos microbianos e seu impacto nas vias de morte celular em câncer colorretal.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio de leituras de viabilidade dependentes da dose em modelos de esferoides tridimensionais.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao associar a apoptose induzida por LCFS a marcadores moleculares mensuráveis por meio de qRT-PCR, Western blot e FACS.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos em etapas subsequentes, utilizando formação reprodutível de esferoides em placas com aderência ultrabaixa.
- Resultados Quantitativos: Gera dados de resposta dose-dependente (25%, 12,5%, 6% de LCSF) que permitem a estimativa de IC50 e a modelagem de relações estrutura-atividade.
- Escalabilidade: Utiliza formato de 96 poços, compatível com manipulação automática de líquidos e triagem de viabilidade em alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela a fisiopatologia do câncer colorretal utilizando esferoides derivados de pacientes ou de linhagens celulares estabelecidas, que refletem a arquitetura tumoral in vivo.
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas científicas à validação pré-clínica, mantendo condições de cultivo tridimensionais consistentes entre as etapas dos ensaios.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Facilita critérios de prosseguimento ou interrupção com base na indução de apoptose e limiares de viabilidade observados em co-cultivos de esferoides.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se a fluxos de trabalho de descoberta precoce após a identificação do alvo e anterior à otimização de compostos líderes, fornecendo um sistema relevante para a doença para avaliar sobrenadantes bioativos de fontes microbianas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre mecanismos microbianos anticâncer e a elucidação de vias em modelos tridimensionais que predizem melhor as respostas in vivo.
- Triagem: Garante padronização e reprodutibilidade dos ensaios por meio de protocolos padronizados de formação de esferoides e tratamento com LCFS.
- Análises: Permite medições quantitativas de variáveis dependentes (viabilidade, marcadores de apoptose) que apoiam comparações estatísticas entre diferentes condições de tratamento e linhagens celulares.
- Pesquisa Translacional: Mantém a continuidade da triagem baseada em esferoides até a validação pré-clínica, preservando a fidelidade do cultivo tridimensional.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem de sobrenadantes de probióticos, extratos de alimentos fermentados ou terapêuticos derivados do microbioma em múltiplos tipos de câncer.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir falsos positivos provenientes de modelos 2D e capturar efeitos dependentes do microambiente.
- Valor Operacional: Padroniza os fluxos de trabalho de geração e tratamento de esferoides, melhorando a reprodutibilidade entre diferentes locais e reduzindo a variabilidade dos ensaios.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de riscos em intervenções direcionadas ao microbioma antes de estudos in vivo onerosos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de compostos naturais promissores com base na indução de apoptose e resposta à dose em modelos clinicamente relevantes.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura bacteriana anaeróbia, manipulação de esferoides tridimensionais e técnicas de ensaio de apoptose (qPCR, WB, FACS).
- Depende de instrumentação, incluindo câmaras anaeróbias, incubadoras com agitação, espectrofotômetros e citômetros de fluxo.
- Necessita padronização entre equipes distintas, como as de microbiologia e biologia do câncer, para garantir preparação consistente de LCFS e controle de qualidade dos esferoides.
- Envolve considerações de adaptação ao ser estendido a outras cepas bacterianas ou tipos de câncer além dos modelos de câncer colorretal.
- É limitado pela fragilidade dos esferoides durante a troca de meio, exigindo manipulação cuidadosa para manter a integridade estrutural e obter leituras precisas.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Bacterial Cell Culture and Lactobacillus Cell-Free Supernatant (LCFS) Preparation
2:18
Colorectal Cancer Cell Line Preparation
3:12
Spheroid Formation
3:49
3D colorectal Cancer Cell LCFS Treatment
4:26
Results: Representative Effects of LCFS Co-Culture on Spheroid Formation and Viability
5:22
Conclusion
