Name: Cristalografia de Raios-X para Estudar a Transição do Estado Oligomérico da Termotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Aprenda cristalografia de raios-X para estudar transições oligoméricas da aminopeptidase TmPep1050 de Termotoga maritima. Este método acessível permite analisar estados de dimerização e dodecamerização em biologia estrutural.

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Agradecemos a Martine Roovers por revisar este artigo e fazer comentários construtivos. O acesso à linha de feixe Proxima 2 (síncrotron SOLEIL) estava dentro dos Grupos de Alocação de Blocos 20151139.

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo aqui descrito permite compreender a transição dimer-dodecamer de TmPep1050 no nível estrutural. A metodologia foi experimentada anteriormente para determinar a estrutura de ambos os oligômeros TmPep105011. O passo mais desafiador foi encontrar condições que promovessem a dissociação dos dodecamers em escurecimentos estáveis. Tais condições tinham que ser leves o suficiente para permitir a reassociação de dimers em dodecamers quando o cofator de íons metálicos foi adicionado. A separaçã...

A oligomerização é um processo predominante que dita as funções biológicas de muitas proteínas. Em Escherichia coli,estima-se que apenas 35% das proteínas são monoméricas1. Algumas proteínas, chamadas morfinas, podem até adotar vários estados oligomericos com subunidades com estrutura distinta em cada estado oligomerico2. A transição entre seus estados oligomericos é frequentemente uma média para regular a atividade proteica, pois cada estado oligomerico pode ter uma atividade ou função específica diferente. Vários exemplos de morfinas foram bem documentados na literatura, notavelmente o porfobilinogen synthase3, HPr kinase/fosphatase4, Lon protease5, lactato desidrogenase6, glicealdeído-3-fosfato desidrogenase7, pyruato kinase8, citrato synthase9, e ribonuclease A10. Recentemente, descrevemos o M42 aminopeptidase TmPep1050, outro exemplo de enzima com comportamento semelhante à morfina, cuja atividade depende de seus estados oligoméricos11. A transição entre seus estados oligoméricos é mediada por seus cofatores metálicos que induzem várias modificações estruturais das subunidades.
A família Aminopeptidase M42 pertence ao clã MH12,13, e é amplamente distribuída entre bactérias e Archaea14. As aminopeptidases M42 são enzimas dinucleares genuínas que degradam peptídeos até 35 resíduos de aminoácidos no comprimento15. Eles adotam uma estrutura peculiar em forma de tetraedro feita de 12 subunidades com seus locais ativos orientados para uma cavidade interna. Tal arranjo é frequentemente descrito como uma nano-compartimentação da atividade para evitar a proteólise descontrolada. A função fisiológica das aminopeptidases M42 pode estar associada aos peptídeos protealôs e hidrolise resultantes da degradação proteica16,17. Pyrococcus horikoshii possui quatro aminopeptidases M42, cada uma apresentando especificidades distintas, mas complementares18,19,20,21. Singularmente, heterocomplexos feitos de dois tipos diferentes de subunidades foram descritos em P. horikoshii, sugerindo a existência de complexos peptidasome22,23.
Várias estruturas de aminopeptidases M42 foram descritas na literatura11,16,18,19,20,24,25,26. A subunidade é composta de dois domínios distintos, um domínio catalítico e um domínio de dimerização. O domínio catalítico adota uma dobra de α/β comum conservada em todo o clã MH, sendo o domínio catalítico arquetípico o Aminopeptidase Ap1 do Vibrio proteolyticus27. O domínio de dimerização adota uma dobra16 semelhante a PDZ e pode ter, além de seu papel na oligomerização, um papel no controle do acesso substrato e vinculação na cavidade interna11. Como o bloco de construção básico é um dimer, o dodecamer é frequentemente descrito como a associação de seis dimers, cada escurecer sendo posicionado em cada borda do tetraedro16. A oligomerização das aminopeptidases M42 depende da disponibilidade de seus cofatores metálicos. Íons metálicos divalentos, muitas vezes Zn2+ e Co2+, estão catalíticos envolvidos na ligação de peptídeos e hidrólise. Eles são encontrados em dois locais de ligação distintos, ou seja, locais M1 e M2. Os dois íons metálicos também dirigem e ajustam finamente a oligomerização como demonstrado para PhTET2, PhTET3, PfTET3 e TmPep105011,24,28,29. Quando os cofatores metálicos estão esgotados, o dodecamer desmonta em dimers, como em PhTET2, PhTET3 e TmPep105011,16,28, ou mesmo monômeros, como em PhTET2 e PfTET324,29.
Apresentado aqui é um protocolo utilizado para estudar as estruturas de oligômeros TmPep1050. Este protocolo é um conjunto de métodos comuns, incluindo purificação de proteínas, triagem de atividade proteolítica, cristalização, difração de raios-X e substituição molecular. São enfatizadas sutilezas inerentes ao enfrentamento das metalloenzymias, oligomerização de proteínas, cristalização de proteínas e substituição molecular. Um caso de estudo também é apresentado para mostrar se os dodecamers TmPep1050 podem se dissociar ainda mais em monômeros ou não. Para abordar essa questão, uma variante TmPep1050, TmPep1050H60A H307A,foi estudada cujos locais de ligação metálica são prejudicados pela mutação de Seu-60 (local M2) e Seu-307 (local M1) para resíduos de Ala. Este protocolo pode ser acomodado para estudar outras aminopeptidases M42 ou quaisquer metalloenzymes com comportamento semelhante à morfina.

<table><tbody><tr><td>1,10-fenantrolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13, 137-7</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 ml Filtros Centrífugos Ultracel 30K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 Filtros Centrífugos Ultracel 30K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase Nuclease</td><td>Merck Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>CCP4</td><td>N/A</td><td></td><td>visite http://www.ccp4.ac.uk/</td></tr> <tr><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td> <td>Coot</td></tr><tr><td></td><td>N/A</td><td></td> sem EDTA <td>completo visite https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td></tr> <tr><td>Tela de cristal I</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td></td></tr><tr><td>Tela de cristal II</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Ferramenta Scientific</td><td>K1082</td><td></td></tr><tr><td>EasyXtal de 15 poços</td><td>NeXtal</td><td>132007</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli PPY cepa</td><td>N/A</td><td></td><td>ver referência 31</td></tr><tr><td>Escherichia coli XL1 cepa azul</td><td>Kit</td> de Calibração de Filtração <td>em Gel Agilent 200249</td><td></td></tr><tr><td>HMW</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4038-42</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Calibração de Filtração em Gel LMW</td><td>GE Ciências da Vida em Saúde</td><td>28-4038-41</td><td></td></tr><tr><td>Padrão de Filtração em Gel</td><td>Biorad</td><td>1511901</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Índice</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Litholoops</td><td>Dimensões Moleculares</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-leucina-p-nitroanilida</td><td>Bachem AG</td><td></td><td></td>40010720025</tr><tr><td>Natrix 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td></td></tr><tr><td>Natrix 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-117</td><td></td></tr><tr><td>Plug-in Neggia</td><td>Dectris</td><td>N/A</td><td>visite https://www.dectris.com/</td></tr> <tr><td>Tubos NeXtal JCSG Core Suite I</td><td>NeXtal</td><td>130724</td><td></td></tr><tr><td>Tubos NeXtal JCSG Core Suite II</td><td>NeXtal</td><td>130725</td><td></td></tr><tr><td>Tubos NeXtal JCSG Core Suite III</td><td>Tubos NeXtal</td><td>130726</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal JCSG Core Suite IV</td><td>NeXtal</td><td>130727</td><td></td></tr><tr><td>pBAD-TOPO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K430001</td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td>N/A</td><td></td><td>visita https://www.phenix-online.org/</td></tr> <tr><td>Phusion DNA polimerase de alta fidelidade</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Sal RX 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td></td></tr><tr><td>Sal RX 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Diálise SnakeSkin, 3.5K</td><td>MWCO ThermoFisher Scientific</td><td>88242</td><td></td></tr><tr><td>Fonte 15Phe</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17014702</td><td></td></tr><tr><td>Fonte 15Q</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17094705</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 grau de preparação</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17104301</td><td></td></tr><tr><td>Thermotoga maritima MSB8 cepa</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 43589</td><td></td></tr><tr><td>TmCD00089984</td><td>DNASU Plasmid Repository</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>XDS</td><td>N/A</td><td></td><td>visita http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td></tr> <tr><td>xdsme</td><td>N/A</td><td></td><td>visita https://github.com/legrandp/xdsme</td></tr></tbody></table>

cristalografia de raios-x para estudar a transição do estado oligomérico da termotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

As aminopeptidases M42 formam complexos funcionalmente ativos feitos de 12 subunidades. Seu processo de montagem parece ser regulado por seus cofatores de íons metálicos desencadeando uma transição dimer-dodecamer. Após a ligação de íon metálico, várias modificações estruturais ocorrem no local ativo e na interface de interação, moldando dimers para promover a auto-montagem. Para observar tais modificações, os oligômeros estáveis devem ser isolados antes do estudo estrutural. Relatado aqui é um método que permite a purificação de dodecamers estáveis e dimers de TmPep1050, um M42 aminopeptidase de T. maritima, e sua determinação estrutural por cristalografia de raios-X. Dimers foram preparados de dodecamers removendo íons metálicos com um agente quelaante. Sem seu cofator, os dodecamers tornaram-se menos estáveis e foram totalmente dissociados após o aquecimento. As estruturas oligomeméricas foram resolvidas pela abordagem de substituição molecular direta. Para ilustrar a metodologia, a estrutura de uma variante TmPep1050, totalmente prejudicada na ligação de íons metálicos, é apresentada sem mais quebra de dimers aos monômeros.

Para estudar uma possível dissociação dodecamer em monômeros em TmPep1050, os códons His-60 e His-307 foram substituídos por codons alanino usando um gene sintético. Este gene foi então clonado no vetor pBAD para expressão e purificação da variante TmPep1050 correspondente posteriormente chamada TmPep1050H60A H307A. A cromatografia de exclusão de tamanho(Figura 3B)mostrou que a proteína purificada tinha um peso molecular aparente de 56 kDa (peso molecular do monômero sendo 36,0 kD...

Este protocolo foi desenvolvido para estudar a transição dimer-dodecamer de TmPep1050, uma aminopeptidase M42, no nível estrutural. É um pipeline simples desde a purificação de proteínas até o processamento de dados de raios-X. A cristalogênese, a indexação do conjunto de dados e a substituição molecular foram enfatizadas através de um caso de estudo, a variante TmPep1050H60A H307A.

Cristalografia de Raios-X para Estudar a Transição do Estado Oligomérico da Termotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Este protocolo facilita o estudo de aminopeptidases com diferentes estados oligoméricos e atividades dependentes de oligomerização que são equilibradas entre dimers inativos e dodecamers ativos. Esta técnica convencional pode ser facilmente realizada em qualquer laboratório. E além de exigir acesso a uma instalação de cristalografia de raios-X ou raios-X, não requer dispositivos especiais.Com alguma adaptação, este método pode ser aplicado a qualquer outra proteína com uma atividade ou função que dependa de seu grau de oligomerização. Para processar os dados de raio-x, os usuários devem ter uma compreensão mínima da cristalografia. Convidamos os usuários a seguir os treinamentos, visitar o XDS Wiki e a assistir aos tutoriais da Phenix.Para realizar um ensaio de atividade, adicionar 25 microlitres de 100 mM L-Leucine p-Nitroanilide a 965 microliters de 50 milimilas MOPS, 250 micromolar cobalto dois cloreto e 10% metanol Pré incubar a mistura de reação em um banho seco de 75 graus Celsius, antes de diluir a enzima a uma concentração final de um micromolar com mops de 50 mililitros adicionais. Em seguida, adicione 10 microliters de uma enzima micromolar à mistura de reação e vórtice a solução resultante antes de retornar a reação ao banho seco de 75 graus Celsius por não mais do que uma hora. Quando a solução ficar amarela, pare a reação com um mililitro de ácido ácida de 20% e o vórtice da mistura antes de permitir que esfrie à temperatura ambiente.Em seguida, transfira uma alíquota da mistura de reação para uma célula espectrofotômetro e leia os absorventes a 410 nanômetros contra uma mistura de reação incubada sem enzima, como um controle negativo. Para a preparação da apoenzyme, adicione 10 microlitros de 1, 10-phenanthroline solução de estoque para 890 microlitros de 50 milimilas MOPS, 0,5 sulfato de amônio molar e 100 microlitros de TmPep1050 purificado. Verifique a perda de atividade usando o ensaio de atividade como demonstrado sem a adição de cloreto de cobalto dois.Após o ensaio, transfira a amostra para um tubo de diálise e diálise a amostra contra 200 mililitros de 50 mililitros mops e 0,5 sulfato de amônio molar a quatro graus Celsius. Troque o diálise com tampão fresco três vezes durante a diálise de 48 horas e colete a amostra do tubo de diálise. Utilizando unidades de ultra filtração com um corte de 30 kilodalton, concentre a amostra de volta a 100 microliters e verifique a concentração em um espectógrafo nano volume a 280 nanômetros.Para preparar os dimers diluem a apoenzyme a uma concentração de um micromolar em MOPS de 50 mililitros e 0,5 sulfato de amônio molar, e incubar a reação por duas horas em um banho seco de 75 graus Celsius. Em seguida, concentre a amostra de enzimas para quando pelo menos 50 microliter concentração e verifique o peso molecular por cromatografia de exclusão de tamanho. Para melhorar a forma, o tamanho e a cristalinaidade dos cristais proteicos, adicione o volume apropriado de solução de cristalização otimizada a uma gota de cristais para levar o volume de gotícula de cristal a 10 microliters.Transfira a gota para um micro tubo de 1,5 mililitro e adicione mais 90 microliters de solução de cristalização ao poço semeado. Para cada diluição de sementes, adicione 500 microliters de reagente de cristalização por poços ao número adequado de poços em uma placa de cristalização e misture dois microliters de amostra de proteína com dois microliters de reagente de cristalização e 0,2 microliters de sementes em um suporte de cristalização por poço. Em seguida, fixar os suportes em cada poço de reagente de cristalização.Para a colheita de cristais, encha um banho com nitrogênio líquido e mergulhe quaisquer frascos ou cestas usadas para manuseio de amostras no nitrogênio. Manusear nitrogênio líquido é perigoso pode causar queimaduras severas. Certifique-se de usar proteções individuais adequadas, como luvas criogênicas e óculos de proteção.Configure loops de colheita de amostras de diferentes tamanhos de acordo com o tamanho do cristal e use um binóculo para selecionar uma gota contendo cristais. Em seguida, use um laço para selecionar suavemente um cristal isolado de um poço e imediatamente mergulhe o laço em nitrogênio líquido antes de colocar o laço em um frasco adequado. Para medir as intensidades do ponto de difração, crie uma pasta a partir da qual o XDS será executado e localize o caminho para as imagens.Para executar xdsme, digite o comando em uma janela terminal. Após o término do XDS, verifique o arquivo lp correto e observe a probabilidade da determinação do grupo espacial, completude dos dados, a maior resolução, mosaico cristalino e qualidade dos dados. Depois de verificar o registro sem sentido XDS para obter a probabilidade de grupos espaciais, use os comandos para reexecutar xdsme com diferentes soluções de grupo espacial propostas pelo XDS, em uma pasta separada para evitar sobrepor o processo anterior.Depois de selecionar a melhor solução com base nas estatísticas de dados, digite os comandos para executar o XSCALE e XDSCONV. Para determinar a fase sem um item de dispersão anômeo, use coordenadas 4P X, Y, para preparar o modelo de partida para substituição molecular. A partir do arquivo PDB, use o editor de arquivos Phenix PDB para extrair o monômero A e para truncar seus aminoácidos em alanina.Execute X triagem com o arquivo de reflexão gerado por XDSCONV e a sequência como entradas. Verifique o arquivo de registro de Xtriage. Note a completude, o número de subunidades na unidade assimétrica, a anisotropia, a presença de anéis de gelo e a ocorrência de twinning.Para executar Phaser-MR em Phenix para substituição molecular, selecione o arquivo de reflexão, a sequência e o modelo 4P 4P Y inicial truncado em polialanina e clique em Executar. após a conclusão, verifique se um modelo foi encontrado e verifique a pontuação da substituição molecular. Uma pontuação do fator de tradução Z de pelo menos oito, indica que a solução está definitivamente correta.Depois de determinar a fase por substituição molecular, selecione Executar auto compilação e clique em Executar. Todos os arquivos necessários serão adicionados automaticamente. Após a conclusão, verifique o modelo em COOT e construa e refine o modelo manualmente, de acordo com o mapa de densidade eletrônica em COOT.Usando este modelo, a sequência e os dados de difração como entradas, refine o modelo com curadoria manual em Phenix, referindo-se à Phenix para ajudar a selecionar a estratégia certa. Após a verificação do refinamento dos resultados, o trabalho livre de refinamento e refinamento deve diminuir. Os indicadores molprobity devem ser respeitados e os outliers com baixa correlação de espaço real devem ser limitados.Quando o modelo mais refinado tiver sido gerado, execute o MolProbity no servidor e confira quaisquer outliers identificados pelo programa. A cromatografia de exclusão de tamanho pode ser usada para determinar o peso molecular aparente da proteína purificada. A condição de cristalização do peptídeo pode ser otimizada variando o pH versus a concentração PEG em torno da condição do mais fraco.Por exemplo, os melhores cristais TmPep1050 H60A H307A, foram obtidos em citrato de sódio molar 0,1 com pH de 5,2 e 20%PEG 3350 de concentração, após um ciclo de micro semeadura para melhorar a micro cristalina. Nesta análise, a indexação dos dados mostrou que o grupo espacial do cristal TmPep1050 H60A H307A era C2221, mas o XDS propôs outra solução, o grupo espacial MP. A estrutura do TmPep1050 H60A H307A, poderia ser concluída após vários ciclos de refinamento automatizado e manual.Confirmando o estado oligomerico com uma superfície de interface de 1.710 angstroms quadrados entre ambos os monômeros e uma energia livre de formação de interface de menos 16,2 quilocalorias por toupeira. Aqui, um close-up do site ativo TmPep1050 H60A H307A em comparação com o local ativo do dimer TmPep1050 e dodecamer pode ser observado. Ao construir um modelo, tome cuidado para construir apenas o que você vê na densidade de elétrons para evitar excesso de interpretação, os dados e ter tempo para polir seu modelo.O peso molecular do dimer e dodecamer também pode ser determinado pela espectrometria de massa nativa. E os métodos podem ser úteis para detectar oligômeros de transição.

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