Name: Medição contínua do ruído biológico em Escherichia Coli Usando microscopia de lapso de tempo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprenda a medir circuitos genéticos em Escherichia coli usando microscopia de lapso de tempo. Este método analisa o ruído biológico e a relação sinal-ruído em células individuais, avaliando o desempenho dos circuitos de forma contínua e econômica.

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Agradecemos ao Sr. Gil Gelbert (Faculdade de Engenharia Elétrica, Technion) por ajudar com o código MATLAB. Agradecemos ao Dr. Ximing Li (Faculdade de Engenharia Biomédica, Technion) por auxiliar na comprovação deste artigo. Esta pesquisa foi parcialmente apoiada pela Fundação Da Família Neubauer e pelo Ministério da Ciência de Israel, bolsa 2027345.

1. Preparação de mídia e cultura
<ol><li>Prepare a solução de estoque de 1.000x Carbenicillin (50 mg/mL) ou antibiótico relevante.<ol>
<li>. Pesar 0,5 g de carbenicilina. Adicione 10 mL de estéril H2O. Dissolva completamente.</li>
		<li>Esterilize o estoque de carbenicilina através de um filtro de seringa de 0,22 μm. Aliquot a solução antibiótica e armazene a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para preparar placas de caldo de lysogeny (LB), misture 5 g de triptona, 5 g de NaCl, 2,5 g de extrato de levedura e 7,5 g de ágar Bacto com 0,5 L de estéril H2O. Autoclave a solução a 121 °C por 20 min.<ol>
<li>Submerse parcialmente a mistura de gel derretido em um banho de água de 50 °C. Adicione 1.000 μL de carbenicilina (50 mg/mL).</li>
		<li>Prepare pratos de Petri em um ambiente estéril. Deixe os pratos para definir antes de guardá-los na geladeira.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para a mídia mínima M9, prepare soluções separadas de estoque dos seguintes: sais 5x M9 (56,4 g/L), 2 M de glicose e 2% de casaminoás sem biotina. Autoclave as soluções a 121 °C por 20 min.</li>
	<li>Para preparar 5 placas de Petri, misture 1125 mg de ágar de baixa fusão e 400 mg de ágar com 89,2 mL de mídia mínima (1x M9). Adicione 10 mL de 2% de casaminoácidos (2% [vol/vol]) em um frasco de 250 mL Erlenmeyer. NOTA: Certifique-se de derramar a mídia nos lábios internos do frasco.</li>
	<li>Micro-ondas a solução em rajadas curtas de 3 a 4 segundos. Repita até que a solução esteja clara. NOTA: Certifique-se de não atingir o ponto de ebulição.</li>
	<li>Coloque o frasco de 250 mL Erlenmeyer em um banho de água quente (60 °C) para misturar ainda mais por difusão, e deixe esfriar até que sua temperatura caia para cerca de 45-50°C.</li>
	<li>Acenda a chama no banco de rolar pratos.</li>
	<li>Adicione rapidamente todas as soluções na seguinte ordem: 800 μL de 50% de glicerol (0,4% [vol/vol]) 100 μL de tiamina (B1) 1100 μL de glicose (2M) 100 μL de Carbenicilina (50 mg/mL).</li>
	<li>Gire o frasco de Erlenmeyer para garantir a distribuição uniforme de todos os ingredientes em todo o ágar.</li>
	<li>Abra uma placa de cada vez ao lado da chama e comece a derramar.<ol>
<li>Deixe as placas no banco por alguns minutos até a solidificação inicial.</li>
		<li>Vire as placas de cabeça para baixo para evitar que a condensação da água escorra sobre o gel.</li>
		<li>Deixe as placas solidificarem à temperatura ambiente por cerca de 2h.</li>
		<li>Uma vez que as placas tenham solidificado e seco, elas podem ser armazenadas a 4 °C por cerca de 3 meses.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Estirpes bacterianas e plasmídeos construção
NOTA:O circuito genético contém uma parte; uma Proteína Fluorescente Verde (GFP) impulsionada por um promotor PtetO resultando em expressão constitutiva. Todos os plasmídeos deste trabalho foram construídos utilizando técnicas básicas de clonagem molecular e foram transformados em Escherichia coli 10β, utilizando um protocolo padrão de choque térmico24. A construção final foi transformada em escherichia coli MG1655 para testes.
<ol><li>Transforme o plasmídeo desejado em células Escherichia coli MG1655 com o protocolo de choque térmico padrão24.</li>
	<li>Cresça as células transformadas em uma placa de ágar LB durante a noite a 37°C. NOTA: É possível manter as placas de Petri da etapa 2.2 até 3 dias para uso de microscopia.</li>
	<li>Inocular uma única colônia em 5 mL de caldo LB complementado com os antibióticos relevantes em um tubo de vidro.</li>
	<li>Cresça células a 37 °C com velocidade de agitação de 250 rpm na incubadora por 2h até que o líquido esteja nublado.</li>
	<li>Prepare 1 mL de solução de diluição da seguinte forma: 892 μL de mídia mínima (1x M9) 8 μL de 50% de glicerol (0,4% [vol/vol]) 100 μL de 2% de ácidos Casamino (0,2% [wt/vol]) 1 μL de tiamina (B1) 11 μL de glicose (2 M) 1 μL de antibióticos relevantes<ol>
<li>Misture e gire para baixo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluir a cultura celular (1:30) da etapa 2.4 em um tubo de 2 mL adicionando 30 μL de crescimento de Escherichia coli a 1000 μL de solução de diluição (passo 2.5).</li>
	<li>Incubar o tubo por 1h com agitação (250 rpm) a 37 °C.</li>
	<li>Cresça 40 μL - 60 μL em placas M9 preparadas na etapa 1.10. Incubar a placa a 37 °C durante a noite. NOTA: A Densidade Óptica (OD600nm) para chapeamento deve ser em torno de 0,1.</li>
	<li>Coloque até três placas de fundo de vidro de 35 mm no banco. NOTA: Certifique-se de que o vidro da placa tenha a espessura correta das lentes do microscópio utilizadas.</li>
	<li>Prepare a cultura para semeadura em placas de gel, repita as etapas 2.3 a 2.6 para colônias de chapas preparadas nas medições do microscópio passo 2.9.</li>
	<li>Prepare a seguinte solução para fazer três placas de microscópio.<ol>
<li>Pré-aqueça o banho de água a 60 °C.</li>
		<li>Misture 112,5 mg de ágar de baixa fusão e 40 mg de ágar com 8,92 mL de mídia mínima (1x M9) e adicione 1 mL de 2% de álinoácidos (0,2% [vol/vol]) em um frasco Erlenmeyer de 25 mL. NOTA: Certifique-se de derramar a mídia nos lábios internos do frasco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Micro-ondas a solução em rajadas curtas de 2 a 3 segundos. Repita até que a solução esteja clara. NOTA: Certifique-se de não atingir o ponto de ebulição.</li>
	<li>Coloque o frasco de 25 mL Erlenmeyer em um banho de água quente (60 °C) para misturar ainda mais por difusão, e deixe esfriar no banco até que sua temperatura caia para cerca de 45-50 °C.</li>
</ol>3. Preparação de almofadas de agarose
<ol><li>Banco limpo com 70% de etanol. Estique a fita no banco limpo. Certifique-se de que a fita está lisa e nivelada.</li>
	<li>Prepare dois coverlips: um na fita e outro nas proximidades. Prepare um coverlid.</li>
	<li>Retire o frasco (preparado na etapa 2.14) do banho de água, limpe o exterior do frasco limpo e deixe esfriar até que sua temperatura caia para cerca de 45-50 °C.</li>
	<li>Para fazer a solução de gel, misture rapidamente todas as soluções na seguinte ordem: 80 μL de 50% de glicerol (0,4% [vol/vol]) 1 mL de 2% de casaminoácidos (0,2% [wt/vol]) 10 μL de tiamina (B1) 110 μL de glicose (2 M) 10 μL de antibióticos relevantes.</li>
	<li>Despeje 1,5 mL do gel na tampa e cubra-o com a segunda peça fazendo um "sanduíche".</li>
	<li>Devolva o Erlenmeyer ao banho de água quente. Cubra o sanduíche com a tampa e reserve o temporizador por 20 minutos.</li>
	<li>Ao mesmo tempo, incubar o tubo da etapa 2.11 para 1 h a 37 °C com agitação (250 rpm)</li>
	<li>Depois de 20 minutos vire o sanduíche (passo 3.5), cubra-o e deixe descansar por 1h. NOTA: Para melhores resultados deixe o "sanduíche" descansar a 4 °C durante a etapa 3.8.</li>
	<li>Semente Escherichia coli cultura a partir do passo 3.7 por pipetting a amostra para o prato de 35 mm. NOTA: A tubulação de 6 μL de células como pequenas gotas separadas dá os melhores resultados.</li>
	<li>Deixe as gotas secarem, por pelo menos 15 minutos e até 30 minutos.</li>
	<li>Exponha o gel solidificado do sanduíche do passo 3.8 deslizando o deslizamento de tampas para longe.</li>
	<li>Corte o sanduíche em pequenas almofadas individuais com soco ou ponta de biópsia.</li>
	<li>Incline-o suavemente sobre a amostra (passo 3.9). Deixe o prato por 20 minutos no banco.</li>
</ol>4. Preparando a amostra para imagens de microscopia
<ol><li>Retire o frasco do banho de água do passo 3.6. Limpe o lado de fora do frasco limpo e deixe esfriar até a temperatura ambiente (25 °C). NOTA: Remova o frasco na etapa 4.1 cerca de 3 minutos antes do temporizador terminar.</li>
	<li>Despeje 3 mL do gel constantemente para o perímetro da placa em um movimento circular. Deixe se solidificar por alguns minutos.</li>
	<li>Placas de vedação com fita adesiva e furar vários furos com agulha de 25 G. Vire todos os pratos para evitar que a condensação da água escorra no gel.</li>
	<li>Incubar todos os pratos a 4 °C por 30 min para permitir a solidificação total, evitando a mitose celular. NOTA: Deixe as amostras a 4 °C para medições sucessivas, não mais do que um dia.</li>
	<li>Inicie o microscópio por instruções do fabricante.</li>
	<li>Encontre o foco inicial usando a lente de amplificação mais baixa e engaje o sistema de foco automático (AFS).</li>
	<li>Use óleo se necessário, afogue a lente com óleo e espalhe-a cuidadosamente movendo a placa com um controlador de plataforma (não manualmente) e o AFS pode ser ativado novamente.</li>
	<li>Use seção transversal relativa na direção Z, seguindo a sugestão padrão para seções transversais de etapaS Z. NOTA: Tiramos imagens de campo brilhantes a cada 5 minutos e imagens fluorescentes a cada 20 minutos. Às vezes, o foco precisa ser ajustado durante os primeiros 30 minutos. Pré-aquecimento da caixa da incubadora de microscópio e óleo, enquanto a refrigeração da amostra tende a ajudar a reduzir a perda inicial de foco.</li>
</ol>5. Análise de dados
NOTA: Para processar dados de microscopia, projetamos um software baseado em computador no MATLAB. Este software facilita a identificação de limites celulares a partir de imagens e segmentos de tiff de campo brilhante e classifica as células por área. A saída desta análise de imagem pode ser usada como uma máscara em imagens de tiff fluorescentes para derivar níveis de intensidade celular e cancelar artefatos no domínio fluorescente, como halo celular devido a limites de resolução de microscópio. O software desenvolvido foi inspirado em trabalhos similares7,25,26,27,28,29,30 e fornece uma solução elegante sob medida para o laboratório.
<ol><li>Primeiro, defina os seguintes parâmetros em main_code.m.<ol>
<li>Defina a pasta das imagens de aquisição.</li>
		<li>Defina o período de tempo da imagem - passo de tempo do canal de campo brilhante em minutos.</li>
		<li>Defina a frequência GFP - taxa de aquisição de imagens GFP.</li>
		<li>Defina a resolução do microscópio (ou seja, quantos pixels são iguais a 1 μm).</li>
		<li>Defina o alcance da caixa de histograma - alcance da área celular. NOTA: O processo de classificação dos dados de acordo com a área celular é semelhante aos princípios de gating na análise de dados de citometria de fluxo. Os portões são colocados ao redor de populações de células com características comuns, geralmente dispersas e laterais dispersas, para isolar e quantificar essas populações de interesse. A microscopia permite portão, investigar e quantificar vários grupos celulares.</li>
		<li>Definir o kernel de convolução (3,3) - este parâmetro detecta limites celulares por limiar global(count_cells.m). NOTA: Esta configuração só é necessária ao alterar o laboratório ou o microscópio. O software requer que o canal de campo brilhante de entrada seja rotulado com índice c1, canal de fluorescência rotulado como c2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute main_code.m, que executará todos os outros scripts automaticamente(count_cells.m, cell_growth_rate.m).<ol>
<li>Programa segmenta automaticamente imagens de campo brilhante (ver Figura Suplementar 2-4).</li>
		<li>Combine a imagem de segmentação com imagem fluorescente (GFP) para extrair nível de intensidade por célula.</li>
		<li>Calcule o gráfico da quantidade de células por tempo e encaixe de acordo com o crescimento exponencial.</li>
		<li>Calcule a média e o desvio padrão (DST) para cada faixa de área celular.</li>
		<li>Calcule a relação sinal/ruído (SNR) para cada faixa de área celular.</li>
		<li>Plote e encaixe a distribuição da quantidade de células por intensidade.</li>
		<li>Calcule o coeficiente de Variância (CV) e compare com os dados do analisador de fluxo. NOTA: O software dará como saída as imagens finais de segmentação para ajustar conv_kernel em uma nova pasta "sua pasta/Segmentada". O software dará como saída os gráficos em uma nova pasta "sua pasta/gráficos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para comparar entre experimentos, use compare_experiments.m.<ol>
<li>Defina diretórios para os gráficos salvos e o endereço do diretório \CompareResult.</li>
		<li>Execute o arquivo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste trabalho, desenvolvemos um protocolo que permite o rastreamento computacional de células vivas Escherichia coli, seguindo níveis de divisão e fluorescentes durante um período de horas. Este protocolo nos permite quantificar a dinâmica estocástica dos circuitos genéticos em Escherichia coli medindo o CV e o SNR em tempo real. Neste protocolo, comparamos os comportamentos estocásticos de dois circuitos diferentes, como mostrado na Figura 10. Foi demonstrado que plasmídeos com baixo ...

A biologia sintética é um campo multidisciplinar que surgiu na última década e tem como objetivo traduzir princípios de design de engenharia em design biológico racional1,2,3, em um esforço para alcançar a integração multiprofissional e o processamento em células vivas para a compreensão da ciência básica4,5, aplicações diagnósticas, terapêuticas e biotecnológicas6,7,8,9,10. Nossa capacidade de quantificar a resposta de entrada-saída de circuitos genéticos sintéticos foi revolucionada pelos recentes avanços na tecnologia unicelular, incluindo o analisador de fluxo e imagens de células vivas usando microscopia automatizada de lapso de tempo11. Um analisador de fluxo é frequentemente usado para medir a resposta desses circuitos no estado estável1,12, e a microscopia invertida é usada para medir a resposta dinâmica de circuitos genéticos sintéticos ao nível de uma única célula3. Por exemplo, um dos primeiros trabalhos em biologia sintética envolveu a construção de redes osciladoras genéticas em células vivas usando loops de feedback negativos com um atraso3. Posteriormente, os circuitos osciladores genéticos foram aplicados para entender o controle metabólico no ambiente dinâmico das células vivas4. A microscopia de lapso de tempo automatizado é um método para caracterizar tais circuitos. Temos a hipótese de que as células hospedeiras, Escherichia coli,sincronizam ao formar micro colônias, permitindo a medição do sinal e o cálculo do ruído sem rastrear relações exatas entre mãe e filha.
O ruído é um aspecto fundamental e inerente dos sistemas biológicos, muitas vezes decorrentes de múltiplas fontes. Considere, por exemplo, reações bioquímicas envolvendo sinais originários do transporte de portadores aleatórios discretos, como a difusão de proteínas13. Estes sinais se propagam com flutuações aleatórias14. Outras fontes de ruído são disponibilidade de recursos, divisão celular e variações em condições ambientais como temperatura, umidade e pressão. Sinais biológicos que se propagam em circuitos genéticos sintéticos muitas vezes têm uma relação sinal-ruído muito baixa (SNR), o que perturba o desempenho de tais circuitos. Portanto, o design do circuito genético continua sendo um dos aspectos mais desafiadores da engenharia genética15. Por exemplo, ao contrário da maioria das abordagens que calculam apenas a expressão genética média (medida sobre toda a população celular), a variância do sinal medido é considerada para projetar comportamentos previsíveis através de redes genéticas sintéticas12. Como tal, os níveis de variabilidade ou ruído na expressão proteica desempenham um papel dominante no design e desempenho dos circuitos genéticos analógicos e digitais1,16,17.
Muitas abordagens foram desenvolvidas para quantificar a variabilidade célula-celular, inclusive em Escherichia coli3,7,18. Esses métodos são frequentemente usados para estudar a ativação genética e vias metabólicas, porém com menos foco no estudo da dinâmica do ruído estocástico, como medir e desembaraçar fontes específicas de ruído, especialmente para circuitos genéticos em células vivas onde este é um desafio fundamental19,20,21. Vários fatores, ambos herdados ao próprio circuito (intrínseco) e derivados das células hospedeiras (extrínsecos), podem perturbar o desempenho contínuo dos circuitos genéticos. Neste artigo, desenvolvemos um protocolo que visa quantificar o ruído total nas células Escherichia coli, incluindo as fontes de ruído intrínsecas e extrínsecas6,22. Quantificando o ruído total e avaliando o SNR23,o design dos circuitos genéticos pode ser melhorado. Este método pode ser modificado para medir fontes de ruído independentes separadamente, monitorando várias proteínas fluorescentes6,20. Para o protocolo aqui descrito, mantemos as condições ambientais bem controladas e medimos continuamente a atividade das células sem a influência de fatores externos. Medimos o sinal de proteínas fluorescentes em células únicas ao longo do tempo e simultaneamente as imagem sob um substrato agarose. As imagens resultantes são analisadas usando o MATLAB personalizado do laboratório.
Idealmente, a medição contínua da atividade em tempo real de proteínas fluorescentes dentro de uma célula produzirá dados precisos através do crescimento e divisão das células. No entanto, é desafiador adquirir tais dados. Isso se deve à degradação das proteínas fluorescentes, conhecidas como foto-branqueamento7,quando são expostas à radiação no processo de excitação. Além disso, as células Escherichia coli também são sensíveis à excitação, o que pode levar à fototoxicidade7. Ambas as questões limitam a quantidade de quadros fotográficos que podem ser adquiridos e o tempo entre as aquisições. Os tipos de substrato e médio (por exemplo, caldo de lysogeny) que é usado para cultivar as células durante a imagem também têm um papel crítico. Recomendamos fortemente o uso de meio mínimo, que minimiza o fundo não fluorescente e amplia o tempo de divisão celular.
Além disso, a amostra precisa ser preparada considerando os seguintes requisitos (1) A baixa taxa de divisão celular permite exposições menos frequentes para imagens próximas do ciclo de divisão e redução da probabilidade de fototoxicidade e fotobleaching. Estabelecemos o tempo de aquisição para cerca de metade do tempo de mitose previsto (2) A baixa densidade celular no início do experimento permite uma melhor uniformidade e rastreabilidade da divisão. A densidade celular é afetada pela razão de diluição das células Escherichia coli, que é um parâmetro significativo para o sucesso deste protocolo e precisa ser determinada para cada laboratório. Para estabelecer a razão, cada nova cepa de Escherichia coli ou mídia utilizada deve ser equipada com gráficos de taxa de crescimento(Figura Suplementar 1). Uma razão apropriada foi alcançada se as células podem crescer sem agitação adicional após uma curta incubação de uma densidade inicial de cerca de OD600nm = 0,1. As células nesta fase se dividirão de acordo com a temperatura do ambiente apenas (3) Restrição do movimento celular: o movimento celular depende fortemente da firmeza do substrato (agarose pad). A firmeza do substrato depende da quantidade de agarose total e do tempo de solidificação do gel. Os géis não podem ser deixados para solidificar durante a noite à temperatura ambiente, pois a Escherichia coli sofrerá mitose. Outros fatores que afetam a estabilidade do substrato incluem a quantidade de água na amostra e a umidade. Questões adicionais são discutidas detalhadamente nos Resultados Representativos. Este protocolo fornece muitos detalhes e gradualmente passa de um passo para outro. O protocolo oferece estabilidade longa para experimentos de imagem e fornece uma ferramenta básica de processamento de imagens.

<table><tbody><tr><td>Prato de vidro de 35 mm</td><td>com espessura fosca</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>correspondente à lente do microscópio.</td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Preparação Lonza</td><td>5004</td><td>LB AHL</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3007</td><td>indutor</td></tr><tr><td>de triptona Bacto&nbsp;</td><td>BD - Becton, Dickinson e Companhia&nbsp;</td><td>211705</td><td>LB preparação</td></tr><tr><td>Carb</td><td>Invitrogen</td><td>10177-012</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>Carb</td><td>Formedium</td><td>CAR0025</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>Casamino ácidos&nbsp;</td><td>BD - Becton, Dickinson e Companhia&nbsp;</td><td>223050</td><td>solução de mídia mínima</td></tr><tr><td>eclipse Ti</td><td>nikon</td><td></td><td>microscópio invertido</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>solução de mídia mínima</td></tr><tr><td>Glyserol</td><td>Bio-Lab</td><td>000712050100</td><td>substrato de mídia mínima</td></tr><tr><td>Immersol 518F</td><td>zeiss</td><td>44496000000000</td><td>óleo de imersão</td></tr><tr><td>M9 solução salina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td>solução de mídia mínima</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-Lab</td><td>214010</td><td>LB preparação</td></tr><tr><td>Ágar nobre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5431</td> fita de parafilme <td>de substrato de mídia mínima</td></tr><tr><td></td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>referido como fita em texto</td></tr><tr><td>Seaplaque GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50111</td><td>substrato de mídia mínima</td></tr><tr><td>thaymine B1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0376&nbsp;</td><td>Solução de mídia mínima</td></tr><tr><td>Extrato de Levedura</td><td>BD - Becton, Dickinson and Company&nbsp;</td><td>212750</td><td>LB preparação</td></tr></tbody></table>

medição contínua do ruído biológico em escherichia coli usando microscopia de lapso de tempo

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

O protocolo desenvolvido aqui oferece uma ferramenta para permitir o rastreamento computacional da divisão Escherichia coli e níveis fluorescentes ao longo de várias horas. O processo começa por triagem de colônias que sobrevivem em meios mínimos, assumindo que apenas Escherichia coli abrigando o plasmídeo correto será capaz de prosperar nas condições específicas. Uma vez que o processo de construção de grandes circuitos genéticos, exigindo a montagem de muitas partes de DNA, é desafiador, os componentes do circuito são frequentemente distribuídos entre vários plasmídeos em diferentes números de cópias que requerem o uso de vários antibióticos. Mutações no plasmídeo podem destruir a transcrição dos genes de resistência a antibióticos e interjeição com o gerenciamento de recursos na célula que leva à necrose. A colônia selecionada é definida em uma placa de Petri de fundo de vidro e alguns planos de foco são selecionados para rastreamento de microscopia em domínios de campo brilhante e fluorescentes. O protocolo mantém o foco da imagem por mais de 12 horas em condições iniciais que não podem ser reguladas, criando algumas dificuldades. Por exemplo, as células mortas começam a se acumular no campo de foco das lentes após algumas horas de imagem, o que faz com que as toxinas se acumulem e o sinal desfoque e decadeia. O esgotamento dos nutrientes introduz novos processos metabólicos e dificulta a resposta desejada do circuito. A temperatura do experimento reduz a eficácia dos indutores e antibióticos, o que pode danificar ainda mais a confiabilidade do sinal. O gel de mídia mínimo encolhe e seca, e como resultado o foco óptico muda ao longo do tempo. Desenvolvemos esse método para superar esses desafios na Escherichia coli,semelhante aos trabalhos anteriores que desenvolvem métodos análogos para outros microrganismos. Além disso, este método oferece um algoritmo para quantificar o ruído estocástico total em células não alteradas e alteradas, descobrindo que os resultados são consistentes com previsões de analisador de fluxo, como mostrado por um coeficiente semelhante de variação (CV).

O software analisa imagens de domínio de campo brilhante que são off-white e preto. A Escherichia coli vai parecer formas oblongas pretas em um fundo off-white e alcance dinâmico de luminância deve mostrar um pico em seu centro(Figura 1). Em imagens fluorescentes, as células podem ter um pequeno halo, mas células individuais com formas oblongas ainda podem ser resolvidas. Um evento de mitose deve ser detectado pela primeira vez após 30 minutos. O foco do microscópio deve permanecer ...

Este trabalho apresenta um método de microscopia que permite a imagem viva de uma única célula de Escherichia coli para análise e quantificação do comportamento estocástico de circuitos genéticos sintéticos.

Medição contínua do ruído biológico em Escherichia Coli Usando microscopia de lapso de tempo

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Este protocolo em ervas medição contínua de circuitos genéticos em E.coli e o cálculo da variabilidade do sinal e relação sinal-ruído em células bacterianas individuais para avaliar o desempenho do circuito. As principais vantagens desta técnica são que ela é facilmente adaptável a diferentes cepas e laboratórios, requer treinamento mínimo e sem equipamentos especiais, e é relativamente barata. O ruído é um papel significativo na determinação da funcionalidade dos sistemas biológicos.Atualmente, há interesse em construir circuitos genéticos em larga escala. Estes sistemas podem ser inibidos pelo ruído Certifique-se de secar bem as amostras, para manter as almofadas de frio a quatro graus Celsius pelo maior tempo possível, e para cortar e dividir as partes pacientemente e suavemente. Preparar as bactérias para a análise inocular uma única colônia de uma cultura E.coli transfeinada.Por exemplo, um circuito com um repórter GFP. Em um tubo de vidro contendo cinco mililitros de caldo LB complemento-o com os antibióticos relevantes. Cresça as células a 37 graus Celsius e 250 revoluções por minuto em uma incubadora agitada por duas horas até que o caldo esteja nublado.No final da incubação, gire um mililitro de solução de diluição em uma mini centrífuga de dois mililitros, e transfira 30 microliters de bactérias e todo o volume de solução de diluição em um novo tubo de dois mililitros. Em seguida, incubar a cultura por uma hora com agitação antes de semear 40 a 60 microliters desta suspensão em placas de cultura M9. Para preparar as bactérias para a análise, inocular uma única colônia de uma cultura E.Coli transfeinada.Por exemplo, um circuito com um repórter GFP em um tubo de vidro contendo cinco mililitros de caldo LB complementado com os antibióticos relevantes. Cresça as células a 37 graus Celsius e 250 revoluções por minuto em uma incubadora agitada por duas horas até que o caldo esteja nublado. No final da incubação, gire um mililitro de solução de diluição em um tubo de micro centrífugas mini mililitros e transfira 30 microliters de bactérias e todo o volume de solução de diluição em um novo tubo de dois mililitros.Em seguida, incubar a cultura por uma hora com agitação. Para preparar placas de microscópio, misture 112,5 miligramas de ágar de baixa fusão com 40 miligramas de ágar, e um mililitro de 2% de casaminoácido em um frasco erlenmeyer de 25 mililitros. Em seguida, adicione 8,92 mililitros de meio mínimo sobre os lábios internos de um frasco Erlenmeyer de 25 mililitros e micro-ondas a solução resultante em suma, duas a três rajadas de dois segundo.Em seguida, coloque o banho de água para 55 graus Celsius. Quando a solução estiver clara, coloque o frasco de 25 mililitros Erlenmeyer em um banho de água de 60 graus Celsius e deixe a solução de ágar esfriar até que sua temperatura caia para cerca de 45 a 50 graus Celsius. Enquanto o ágar esfriar, limpe o banco do laboratório com 70% de etanol e suavize um pedaço de fita de laboratório no banco limpo.Coloque uma tampa de vidro na fita e coloque uma segunda tampa de salto por perto. Adicione a solução de ágar resfriado aos antibióticos e solução apropriados. Despeje 1,5 mililitros de solução recém-preparada para gelar sobre o deslizamento de tampa colocado sobre a fita e coloque a segunda tampa escorregar sobre o gel, tomando cuidado para evitar bolhas.Devolva o Erlenmeyer ao banho de água quente e cubra os deslizamentos de cobertura por 20 minutos. Vire os deslizamentos de cobertura para uma incubação de uma hora a quatro graus Celsius. No final da incubação, retire os deslizamentos de cobertura do gel seco e corte uma pequena almofada da agarose.Durante a incubação, adicione seis gotículas de microliter da suspensão bacteriana preparada em um prato de 35 milímetros e deixe as gotas secarem por pelo menos 15 a 30 minutos. Em seguida, coloque cuidadosamente a almofada de cada vez em uma gota de bactérias e deixe as amostras fixarem por 20 minutos em temperatura ambiente. Para colocar a cama de ágar sem manchar a amostra, posicione cuidadosamente a almofada fria sobre a gota com toques suaves.Para imaginar as amostras, remova o frasco da água e deixe a solução em gel esfriar até a temperatura corporal. Despeje três milímetros do gel no perímetro da placa de amostra. Quando a agarose se solidificar, sele a placa com fita adesiva e use uma agulha de calibre 25 para colocar vários furos na fita.Em seguida, coloque a placa de cabeça para baixo a quatro graus Celsius por pelo menos 30 minutos para permitir que a agarose se solidifique totalmente, enquanto previne a mitose celular. Dentro de 24 horas, use um microscópio confocal de fluorescência para localizar a amostra na menor ampliação e engajar o sistema de foco automático do microscópio. Aplique óleo ao objetivo adequado e use o controlador da plataforma para mover a placa para espalhar cuidadosamente o óleo.Em seguida, acione o foco automático novamente e siga a sugestão padrão de seções transversais de passo Z para a imagem da amostra. O E.coli deve aparecer como formas oblongas pretas em um fundo off white. E o alcance dinâmico da luminância deve mostrar um pico em seu centro.Eventos de mitose podem ser detectados primeiro por microscopia de fluorescência após 30 minutos. Embora células individuais possam ser difíceis de detectar em baixa ampliação. Culturas de células bacterianas preparadas em uma proporção de diluição incorreta podem demonstrar um número imutável de células, e amostras preparadas sem vedação de placas podem apresentar encolhimento excessivo, resultando em perda de foco.As células também podem indentar o gel em sua busca por nutrientes, resultando no empilhamento das células bacterianas em cima umas das outras e comprometendo a monocamada celular, impedindo efetivamente a detecção celular e a medição confiável do sinal fluorescente. Como sugerido por esses dados, o estágio celular no ciclo de divisão não afeta o nível de ruído, pois diferentes faixas de área demonstram a mesma tendência. Além disso, não observada nenhuma alteração substancial na relação sinal-ruído entre gfp e gfp superfold, conforme ilustrado por esses dados representativos.Ao realizar este procedimento, tome cuidado para determinar a razão de diluição correta para a cepa bacteriana utilizada para o experimento. Comparar a relação sinal-ruído de cada circuito regulamentado com esta linha de base permite a seleção do melhor circuito de desempenho e pode revelar fenômenos interessantes

continuous-measurement-biological-noise-escherichia-coli-using-time

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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