Name: Pré-concentração baseada em papel e isolamento de microvesículos e exosóis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: Aprenda a fabricar o dispositivo XO Pad para pré-concentração e isolamento de microvesículos e exosomas sem produtos químicos. Este método de papel oferece taxas de recuperação superiores às técnicas convencionais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee foi apoiado por uma bolsa de pesquisa da Universidade Kwangwoon em 2019. Hyerin Kim foi apoiada pelo "Programa de Desenvolvimento de Competências para Especialistas da Indústria" do Ministério do Comércio, Indústria e Energia da Coreia (MOTIE), operado pelo Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (No. P0002397, programa HRD para Convergência Industrial de Dispositivos Inteligentes Vestíveis).

1. Fabricação de dispositivos
<ol><li>Defina a região a ser impressa em papel usando software de impressora(Tabela de Materiais). NOTA: O desenho possui 12 camadas padrão de cera nas quais os diâmetros das áreas de amostra circular gradualmente diminuem de 5 mm a 2 mm(Figura 1A).</li>
	<li>Imprima cera hidrofóbica nas regiões designadas em ambos os lados do papel de celulose(Tabela de Materiais)utilizando uma impressora de cera comercial(Tabela de Materiais)(Figura 1B).</li>
	<li>Coloque o papel impresso em cera em um forno de laboratório para 80 s a 120 °C. NOTA: Esta etapa permite que a cera atinja o interior do papel, obtendo um refluxo térmico da cera impressa. Com este protocolo de incubação, a resolução do padrão é ~2 mm. Assim, tenha cuidado para não imprimir padrões inferiores a 2 mm. Caso contrário, os padrões serão bloqueados pela cera.</li>
	<li>Corte o papel impresso em cera com um cortador para fazer dispositivos individuais(Figura 1C).</li>
	<li>Queda de 5 μL e 2 μL de membrana permeselétrica (por exemplo, Nafion; Tabela de Materiais) sobre as áreas amostrais nas camadas mais à esquerda e à direita, respectivamente (Figura 1D).</li>
	<li>Coloque as camadas revestidas com a membrana permseleção em uma placa quente a 70 °C por 30 minutos para evaporar o solvente de membrana permseletiva.</li>
	<li>Sele a superfície mais externa da camada revestida voltada para a solução tampão com fita sensível à pressão, deixando um pequeno orifício.</li>
	<li>Dobre o dispositivo individual impresso (ou seja, Exo-PAD) para frente e para trás ao longo das linhas brancas. NOTA: Ao dobrar o dispositivo, todas as áreas de amostra tornam-se convergentemente conectadas(Figura 1E). Este projeto convergente concentra as linhas de campo elétrico quando a tensão é aplicada para ICP, alcançando uma pré-concentração mais intensiva dos microvesculos e exosóis.</li>
</ol>2. Enriquecimento e foco espacial de microvesículos e exosóis pela polarização da concentração de íons
<ol><li>Carregar 15 μL da amostra de microvesculas e exosóculos (~3 x 1011 partículas/mL em 0,1x salina tamponada de fosfato [PBS] com 0,05% Tween 20) nas áreas convergentes da amostra por pipetação e esperar alguns segundos para garantir a motação completa de todas as áreas amostrais(Figura 1F).</li>
	<li>Coloque duas câmaras de acrílico em ambas as extremidades do Exo-PAD e aperte o Exo-PAD com segurança com pequenos clipes de aglutinante para evitar desdobramentos(Figura 1G).</li>
	<li>Encha as câmaras com 110 μL de PBS 0,1x e insira dois eletrodos Ag/AgCl(Figura 1H).</li>
	<li>Aplique 30 V nos eletrodos por 20 min utilizando um sistema de medição de fonte de tensão corrente(Tabela de Materiais). NOTA: A tensão aplicada gera o fenômeno ICP e, portanto, pré-concentra os microvesculos e exosóis nas camadas 8 e 9 do Exo-PAD.</li>
</ol>3. Isolamento dos microvesículos enriquecidos e exosóis
<ol><li>Separe o Exo-PAD dobrado das câmaras acrílicas e desdobre o dispositivo para isolar os microvesculas enriquecidas e exosóis das outras camadas(Figura 1I).</li>
	<li>Esmurra as áreas amostrais nas camadas 8 e 9, onde os microvesículos e exosóis são enriquecidos, para análise a jusante(Figura 1J).</li>
</ol>4. Análise de microscopia eletrônica de varredura
<ol><li>Fixar os microvesículos enriquecidos e exosóculos imergindo as áreas perfuradas em 2,5% glutaraldeído em 0,1 M tampão de cacodilato de sódio por 1h e em 1% de tetroxida de ósmio em 0,1 M de cacodilato de sódio por 1 h. ATENÇÃO: O tetroxida de ósmio é químico altamente venenoso e perigoso. Como o tetroxida de ósmio pode penetrar plásticos, ele deve ser armazenado em vidro. Qualquer manuseio de tetroxida de ósmio deve ser realizado em um capô de fumaça química com luvas de nitrito duplo.</li>
	<li>Desidratar os microvesculos fixos e exosóis com notas ascendentes de 200 etanol de prova (ou seja, 50%, 70%, 90% e 100%) por 30 min cada.</li>
	<li>Seque quimicamente a amostra imergindo-a em hexametiletiladisilazane em um desiccador por 30 minutos. ATENÇÃO: Hexametiletiladisilazane é um produto químico inflamável e sensível à umidade. Deve ser armazenado em uma área seca e bem ventilada longe das fontes de ignição.</li>
	<li>Cubra os microvesículos completamente secos e exosóis com ouro/paládio (~20 nm) através de imagens de microscopia eletrônica de varredura (SEM).</li>
</ol>5. Análise de rastreamento de nanopartículas
<ol><li>Esmurre as áreas amostrais nas camadas 6, 8 e 10 usando um soco de biópsia após 20 minutos de operação do dispositivo.</li>
	<li>Mergulhe cada área perfurada em solução tampão (0,1x PBS com 0,01% Tween 20).</li>
	<li>Vórtice por 10 min e centrífuga por 30 s a 6.000 rpm para resuspensar os microvesículos enriquecidos e exosóis.</li>
	<li>Remova as áreas perfuradas da solução e meça a concentração de microvesculas e exosóis por um instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)(Tabela de Materiais).</li>
</ol>

<ol><li>Edgar, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q+%26+A%3A+What+are+exosomes%2C+exactly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Q & A: What are exosomes, exactly.</a> BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).</li>
<li>Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+exosome+isolation+and+analysis%3A+Enabling+liquid+biopsy+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).</li>
<li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+-+vesicular+carriers+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).</li>
<li>Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles+in+normal+physiology%2C+pathophysiology%2C+and+renal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases.</a> Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).</li>
<li>Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+devices+for+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52722(2015).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origami-paper-based+device+for+microvesicle%2Fexosome+preconcentration+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles%3A+Extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-Free+Isolation+of+Exosomes+from+Extracellular+Vesicles+by+Microfluidic+Viscoelastic+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows.</a> ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).</li>
<li>Marczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+isolation+and+preconcentration+of+exosomes+by+ion+concentration+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization.</a> Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).</li>
<li>Livshts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation%3A+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li>
<li>Chiriacò, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-chip+for+exosomes+and+microvesicles+detection+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization.</a> Sensors. 18 (10), 3175(2018).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrokinetic+size-based+spatial+separation+of+micro%2Fnanospheres+using+paper-based+3d+origami+preconcentrator%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator.</a> Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).</li>
<li>Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+pre-concentration+with+high+enrichment+factors+at+a+fixed+location+in+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Embora o Exo-PAD tenha sido utilizado com sucesso para o enriquecimento e isolamento de microvesculas e exosóis, vários pontos críticos devem ser cuidadosamente considerados: 1) o tempo de incubação do forno e a temperatura durante a preparação do dispositivo, 2) tempo de processamento, 3) aplicação de tensão com números de camadas variados e diâmetros da área da amostra, e 4) aplicabilidade às amostras clínicas.
O tempo de incubação e a temperatura dado no protocolo são condições otimizadas p...

Microvesículos e exosóis são pequenas vesículas de membrana medindo 0,2−1 μm e 30-200 nm, respectivamente. Eles são secretados no ambiente extracelular por vários tipos diferentes de células1,,2,,3,,4,5. Eles contêm informações de células parentais na forma de subconjuntos de DNA, mRNA, miRNA, proteínas e lipídios, e circulam por todo o corpo através de vários fluidos corporais, como soro, plasma, urina, fluido cefalorraquidiano, fluido amniótico e saliva6,,7,,8,,9. Assim, técnicas de isolamento eficiente de microvesículos e exosóis de fluidos biológicos podem proporcionar amplas oportunidades nas áreas do diagnóstico, prognóstico e monitoramento em tempo real da doença, bem como no desenvolvimento de novas terapêuticas.
No entanto, o método de isolamento convencional para microvesículos e exosóis baseados na ultracentrifugação é extremamente demorado e causa perda e contaminação significativas da amostra. Isso porque envolve várias etapas de tubulação e carregamento e descarte de vários reagentes com ultracentrifugação repetida5,6,,10,,11,12. Além disso, o alto estresse de corte induzido pela ultracentrifugação (~100.000 x g) pode causar a lise física de microvesículos e exosóis, gerando baixas taxas de recuperação (5-23%)6,13,14. Portanto, uma técnica de isolamento altamente eficiente e discreta para microvesculas e exosóis deve ser desenvolvida para reduzir danos e perdas, alcançando assim taxas de recuperação mais elevadas.
Um dispositivo à base de papel origami (Exo-PAD) foi desenvolvido para um isolamento mais simples, suave e altamente eficiente de microvesículos e exosóis6. O design do Exo-PAD é um papel multi-dobrado com áreas de amostra conectadas em série que gradualmente diminuem de diâmetro. A técnica de polarização da concentração de íons (ICP), que é um fenômeno nano-eletrocinético que pré-concentra biomoléculas carregadas, foi integrada a este design único. O uso do Exo-PAD resultou em enriquecimento cinco vezes maior dos microvesículos e exosóis em camadas específicas e seu isolamento simplesmente desdobrando o dispositivo. Este artigo descreve o Exo-PAD em detalhes, desde a fabricação e operação geral do dispositivo até a análise de seu uso, para ilustrar o método e mostrar resultados representativos6.

<table><tbody><tr><td>Eletrodos Ag/AgCl</td><td>A-M Systems, Inc.</td><td>531500</td><td>Albumina de 0,15" de diâmetro</td></tr><tr><td>de soro bovino (BSA), conjugado Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A13101</td><td>BSA conjugado com Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)</td></tr><tr><td>Tampão carbonato-bicarbonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3041-50CAP</td><td>Tampão de carbonato</td></tr><tr><td>Software CorelDraw (Coral Co., Canadá)</td>Software de impressora <td>Corel Corporation</td><td></td><td>para definir impressão em cera região</td></tr><tr><td>ColorQube 8870</td><td>Xerox Corporation</td><td></td><td>Impressora de cera</td></tr><tr><td>Papel de cromatografia grau 1</td><td>Whatman</td><td>3001-861</td><td>Papel de celulose, dimensão: 20 * 20 cm</td></tr><tr><td>Padrões de exossomos marcados com fluorescência</td><td>HansaBioMed Life Sciences, Ltd.</td><td>HBM-F-PEP-100</td><td>Exossomo marcado com FITC (Ex/Em: 490/520 nm)</td></tr><tr><td>Keithley 2410 medidor de fonte de corrente/tensão</td><td>Keithley Instruments, Inc.</td><td></td><td>Atual&ndash; sistema de medição de fonte de tensão</td></tr><tr><td>Solução de resina perfluorada Nafion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31175-20-9</td><td>Membrana permselectiva, 20% em peso na mistura de álcoois alifáticos inferiores e água; contém 34% de água</td></tr><tr><td>Tecnologia NanoSight LM10</td><td>NanoSight Máquina</td><td></td><td>de análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH7.4)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010001</td><td></td></tr></tbody></table>

pré-concentração baseada em papel e isolamento de microvesículos e exosóis

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Microvesículos e exosóis são pequenas vesículas membranous liberadas para o ambiente extracelular e circuladas por todo o corpo. Por conterem várias biomoléculas derivadas de células parentais, como DNA, mRNA, miRNA, proteínas e lipídios, seu enriquecimento e isolamento são passos críticos para sua exploração como potenciais biomarcadores para aplicações clínicas. No entanto, métodos convencionais de isolamento (por exemplo, ultracentrifugação) causam perdas e danos significativos a microvesculas e exosóis. Esses métodos também requerem múltiplas etapas repetitivas de ultracentrifugação, carregamento e desolação de reagentes. Este artigo descreve um método detalhado para fabricar um dispositivo baseado em papel origami (Exo-PAD) projetado para o enriquecimento efetivo e isolamento de microvesículos e exosóis de forma simples. O design único do Exo-PAD, composto por camadas multi-dobradas semelhantes a acordeões com áreas de amostra convergentes, é integrado à técnica de polarização da concentração de íons, permitindo assim o enriquecimento de cinco vezes dos microvesículos e exosóis em camadas específicas. Além disso, os microvesículos enriquecidos e exosóis são isolados simplesmente desdobrando o Exo-PAD.

O tempo de operação deve ser otimizado para alcançar o rendimento máximo de recuperação dos microvesículos enriquecidos e exosóis. O tempo insuficiente não permite migração suficiente dos microvesículos e exosóis, o que diminui o enriquecimento, enquanto o tempo excessivo deteriora o foco espacial e, portanto, dispersa os microvesículos e exosóis. Assim, através da etapa de otimização do tempo, pode ser identificado o fator máximo de pré-concentração de microvesículos e exosóis e o local final onde microvesículos e exosó...

Apresentado é um protocolo para fabricar um dispositivo baseado em papel para o enriquecimento efetivo e isolamento de microvesículos e exosóis.

Pré-concentração baseada em papel e isolamento de microvesículos e exosóis

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Neste protocolo, descrevemos um método simples para fabricar um dispositivo baseado em papel chamado XO Pad, que foi projetado para o enriquecimento eficaz no isolamento de vesículas extracelulares. O XO Pad é um dispositivo simples que pode pré-concentrar e isolar vesícula extracelular sem o uso de quaisquer produtos químicos ou máquinas de trabalho, ao mesmo tempo em que mostra taxas de recuperação mais altas do que os métodos convencionais. Comece definindo a região a ser impressa com software de impressora.O desenho deve ter 12 camadas padronizadas de cera nas quais os diâmetros das áreas de amostra circular gradualmente diminuem de cinco a dois milímetros. Em seguida, imprima cera hidrofóbica nas regiões designadas em ambos os lados do papel de celulose. Coloque o papel impresso de cera em um forno de laboratório por 80 segundos a 120 graus Celsius, depois corte o papel impresso de cera com um cortador para fazer dispositivos XO Pad individuais.Solte um cinco e dois microliters de membrana seletiva perm nas áreas amostrais na maioria das camadas esquerda e direita, respectivamente. Coloque as camadas codificadas com a membrana seletiva perm em uma placa quente a 70 graus Celsius por 30 minutos para evaporar o solvente. Em seguida, sele a superfície mais externa da camada revestida voltada para a solução tampão com fita sensível à pressão, deixando um pequeno orifício.Dobre o dispositivo XO Pad para frente e para trás ao longo das linhas brancas para conectar convergentemente todas as áreas de amostra. Pipeta 15 microliters da amostra de microvesculas e exosóis nas áreas de amostra convergente e esperar alguns segundos para garantir a mochilão completa. Coloque duas câmaras de acrílico em ambas as extremidades do XO Pad e fixe-a com clipes pequenos para evitar o desenrolar.Encha as câmaras com 110 microliters de 0,1X PBS e insira dois eletrodos de prata. Em seguida, use um sistema de medição de fonte de tensão de corrente para aplicar 30 volts nos eletrodos por 20 minutos. Para isolar os microvesculas enriquecidos e exosóis, separe o XO Pad dobrado das câmaras acrílicas e desdobre o dispositivo para isolar as partículas enriquecidas das outras camadas.Esmurrem as áreas amostrais nas camadas oito e nove onde os microvesculas e exosóis são enriquecidos para análise a jusante. Um ensaio de migração de lapso de tempo de microvesículos e exosóis rotulados fluorescente foi realizado a fim de otimizar o tempo de operação para a recuperação máxima das partículas enriquecidas. As intensidades de fluorescência em todas as áreas amostrais foram quantificadas com o software ImageJ.Antes do processo de enriquecimento, microvesículos e exosóis foram dispersados em todas as áreas amostrais com diminuição gradual da intensidade. Após 10 minutos de processamento, as partículas migraram eletro-cineticamente e um plugue de pré-concentração instantâneo apareceu na camada sete. Quando o tempo chegou a 20 minutos, microvesículos e exosóis estavam fortemente focados nas camadas oito e nove e enriqueceram cinco vezes com base nas intensidades de fluorescência.A integridade dos microvesículos enriquecidos e exosóis na camada oito foi investigada com SEM. Significativamente mais partículas não danificadas foram observadas após o processo de enriquecimento. Também foi analisada a distribuição de tamanho dos microvesículos enriquecidos e exosóis.Posteriormente, analisou-se a concentração real dos microvesículos enriquecidos e exosóis nas áreas amostrais nas camadas seis, oito e 10. Na camada oito, os microvesculas e exosóis foram pré-concentrados por um fator de 5,58, mas não foi observada pré-concentração perceptível nas outras camadas. Para garantir a reprodutibilidade deste procedimento, seguiu com precisão o protocolo de tempo e temperatura de incubação do forno durante a verificação do dispositivo e o tempo de funcionamento do dispositivo, pois essas são as condições otimizadas.O XO Pad também pode ser usado para separar e isolar vesícula extracelular de amostras ricas em proteínas, como soro ou plasma, usando tampão de carbonato. Este protocolo pode fornecer uma ferramenta de preparação eficiente e simples, com suas capacidades de pré-concentração e isolamento necessárias para pesquisas clínicas, como diagnóstico, entrega de medicamentos, imunoterapia e outras terapêuticas.

paper-based-preconcentration-isolation-microvesicles

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este artigo demonstra métodos para o isolamento, purificação e detecção de exossomos, bem como técnicas para análise de seu conteúdo molecular. Estes métodos são adaptáveis ​​para o isolamento exossomo de ambos os meios de cultura celular e fluidos biológicos, e podem além da análise de conteúdo molecular também ser útil em estudos funcionais.

Isolamento e Caracterização de RNA-Contendo exossomos

Este protocolo detalha um método para isolar vesículas extracelulares (SVE), pequenas partículas membranoso liberados a partir de células, a partir de tão pouco como 10 amostras de soro ul. Esta abordagem evita a necessidade de ultracentrifugação, exige apenas alguns minutos de tempo de ensaio, e permite o isolamento de VE a partir de amostras de volumes limitados.

Os dispositivos à base de papel para o Isolamento e Caracterização de Extracelular Vesículas

O líquido biliar é uma fonte valiosa de vesículas/exossomos extracelulares que contêm biomarcadores potencialmente importantes. Este protocolo representa um método robusto para isolar exossomos da bile humana para análises adicionais, incluindo perfis de miRNA.

Isolamento e Caracterização do perfil de exossomas de bílis humana contendo MicroRNA-

Vesículas extracelulares presentes no sangue têm sido sugeridas como novos biomarcadores para várias doenças. Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento de grandes microvesículas derivadas da membrana plasmática de amostras de sangue periférico e sua posterior análise por citometria de fluxo convencional e Western Blotting.

Isolamento e caracterização de microvesículas a partir de sangue periférico

Aqui, apresentamos um protocolo para purificar exosomes do plasma e soro com reduzida co purificação de proteínas do sangue não-exosomal. O protocolo otimizado inclui ultrafiltração, tratamento com proteases e cromatografia de exclusão. Reforçada purificação de exosomes análises benefícios a jusante, incluindo a quantificação mais precisa de vesículas e caracterização proteômica.

Digestão de proteínas, ultrafiltração e cromatografia de exclusão para otimizar o isolamento do Exosomes do Plasma de sangue humano e soro

Este é um protocolo para isolar vesículas extracelulares do tecido (EVs) do fígado. O protocolo descreve um processo da dois-etapa que envolve a perfusão do colagenase seguida pelo ultracentlee diferencial para isolar EVS do tecido do fígado.

Isolamento de vesículas extracelulares teciduais do fígado

Este protocolo isola vesículas extracelulares (EVs) longe de virions com alta eficiência e rendimento através da incorporação de precipitação EV, ultracentlee gradiente de densidade, e captura de partículas para permitir um fluxo de trabalho simplificado e uma redução de partida requisitos de volume, resultando em preparações reprodutíveis para uso em todas as pesquisas EV.

Purificação de preparações de vesículas extracelulares de alto rendimento longe do vírus

Este protocolo demonstra como isolar pequenas vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (hUC-MSC-sEVs) com uma configuração simples de bancada em escala laboratorial. A distribuição de tamanho, concentração de proteínas, marcadores de sEVs e morfologia de hUC-MSC-sEVs isolados são caracterizados por análise de rastreamento de nanopartículas, ensaio de proteína BCA, western blot e microscópio eletrônico de transmissão, respectivamente.

Um Método Simples de Filtração de Bancada para Isolar Pequenas Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Humanas

Este protocolo fornece um método de isolamento rápido e específico para pequenas vesículas extracelulares, otimizando o tamanho do bico de pulverização de ar, a pressão do fluido da bainha, a pressão do fluxo da amostra, a tensão, o ganho e os parâmetros do limiar de disparo.

Otimização dos Parâmetros de Classificação por Citometria de Fluxo para Isolamento de Alto Rendimento e Purificação de Pequenas Vesículas Extracelulares

As vesículas extracelulares são imensamente promissoras para aplicações biomédicas, mas os métodos de isolamento atuais são demorados e impraticáveis para uso clínico. Neste estudo, apresentamos um dispositivo microfluídico que permite o isolamento direto de vesículas extracelulares de grandes volumes de biofluidos de forma contínua com passos mínimos.

Isolamento em Etapa Única de Vesículas Extracelulares de Amostras de Grande Volume com Dispositivo Microfluídico A4F Bifurcado

Este protocolo descreve o isolamento de pequenas vesículas extracelulares de músculos esqueléticos murinos e medula óssea usando digestão enzimática e cromatografia de exclusão de tamanho, permitindo a recuperação reprodutível de frações enriquecidas com vesículas de tecidos estruturalmente complexos e de baixo rendimento para análise molecular posterior.

Isolamento de Pequenas Vesículas Extracelulares do Músculo Esquelético Murino e Medula Óssea por Cromatografia de Exclusão de Tamanho

Aprenda a fabricar o dispositivo XO Pad para pré-concentração e isolamento de microvesículos e exosomas sem produtos químicos. Este método de papel oferece taxas de recuperação superiores às técnicas convencionais.

Pré-concentração baseada em papel e isolamento de microvesículos e exosóis

Explorar mais vídeos