Name: Imagens Intranuclear Actin Rods em Embriões de Drosophila estressados de calor vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprenda a técnica de microinjeção em embriões de Drosophila para visualizar a montagem de bastonetes de actina intranuclear sob estresse térmico. Este método permite estudar a resposta ao estresse celular em biologia do desenvolvimento.

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Os autores reconhecem com gratidão o trabalho de Liuliu Zheng e Zenghui Xue, que ajudaram a pioneira nesta técnica no laboratório Sokac, bem como Hasan Seede, que ajudou na análise. O trabalho deste estudo é financiado por uma bolsa do NIH (R01 GM115111).

<ol><li>Figard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin-mediated+Actin+Stress+Response+is+maladaptive+in+heat-stressed+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos.</a> Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).</li>
<li>Ashworth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2Fcofilin+mediates+actin+cytoskeletal+alterations+in+LLC-PK+cells+during+ATP+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).</li>
<li>Vandebrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+rod+composition+and+actin+dynamics+in+inherited+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).</li>
<li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF%2Fcofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).</li>
<li>Bamburg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2FCofilin-actin+rods+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Alzheimer+Research%22%5BJournal%5D)">ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases.</a> Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).</li>
<li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease.</a> Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).</li>
<li>Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+actin-ADF%2Fcofilin+rods+transiently+retards+decline+of+mitochondrial+potential+and+ATP+in+stressed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons.</a> AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).</li>
<li>Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+nuclear-cytoplasmic+shuttling+affects+cofilin-actin+rod+formation+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress.</a> Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).</li>
<li>Iida, K., Iida, H., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+induction+of+intranuclear+actin+rods+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).</li>
<li>Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+cofilin+accompanies+heat+shock-induced+nuclear+accumulation+of+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).</li>
<li>Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+KKRKK+sequence+is+involved+in+heat+shock-induced+nuclear+translocation+of+the+18-kDa+actin-binding+protein%2C+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin.</a> Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).</li>
<li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+cofilin-actin+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).</li>
<li>Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin%2C+development%2C+and+nature+of+intranuclear+rodlets+and+associated+bodies+in+chicken+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).</li>
<li>Feldman, M. L., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranuclear+rods+and+sheets+in+rat+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus.</a> Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).</li>
<li>Nishida, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+is+a+component+of+intranuclear+and+cytoplasmic+actin+rods+induced+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells.</a> Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).</li>
<li>Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+ADF+and+cofilin+in+intranuclear+actin+rods+of+cultured+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).</li>
<li>Xue, Z., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back-to-back+mechanisms+drive+actomyosin+ring+closure+during+Drosophila+embryo+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).</li>
<li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuf%2C+a+Rab11+effector%2C+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li>
<li>Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formins+filter+modified+actin+subunits+during+processive+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Formins filter modified actin subunits during processive elongation.</a> Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).</li>
<li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2477(2011).</li>
<li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+wound+assay+and+in+vivo+localization+of+epidermal+wound+response+reporters+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 81, 50750(2013).</li>
<li>Carreira-Rosario, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering+homologous+recombination+constructs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), 50346(2013).</li>
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<li>Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+tracking+endogenous+mRNAs+in+live+Drosophila+melanogaster+egg+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), 58545(2019).</li>
<li>Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+of+early+Drosophila+embryos+measured+by+high-speed+video+microrheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology.</a> Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).</li>
<li>Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMollinari%2C+C+%22Microinjection+and+Transgenesis%3A+Strategies+and+Protocols%22">Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols</a>. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).</li>
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<li>Oesterle, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOesterle%2C+A+%22Pipette+Cookbook+2018%3A+P-97+and+P-1000+Micropipette+Pullers%22">Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers</a>. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).</li>
<li>Powsner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+temperature+on+the+durations+of+the+developmental+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Zoology%22%5BJournal%5D)">The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster.</a> Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).</li>
<li>Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress+Orchestrates+Cell+Polarity+to+Promote+Embryonic+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing.</a> Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

A importância deste método é que utiliza o protocolo bem estabelecido de microinjeção em embriões Drosophila 21,22,23,24,25,26,27 para viabilizar novas pesquisas sobre o ASR e a montagem da haste actin. Uma grande vantagem de injetar G-actinRed em embriões vivos é que o A...

Este protocolo descreve como injetar G-actinRed para visualizar a montagem de hastes de actina intranuclear em embriões estressados pelo calor que estão passando por uma Resposta de Estresse Actina indutível (ASR)1. Desenvolvemos este protocolo para auxiliar estudos do ASR, que em embriões leva à morfogênese interrompida e à viabilidade reduzida, e em tipos de células humanas adultas está associado a patologias incluindo insuficiência renal2,miopatias musculares3,e Alzheimer e Doença de Huntington4,5,6,7,8. Este ASR é induzido por numerosos estresses celulares, incluindo choque térmico9,10,11, estresse oxidativo4,6, síntese ATP reduzida12, e huntingtin anormal ou β-amilóide oligomerização4,5,6,7,9,13,14,15,16. Uma marca registrada do ASR é a montagem de hastes de actina aberrantes no citoplasma ou núcleo das células afetadas, que é impulsionada pela hiperativação induzida pelo estresse de uma proteína interativa de actina, Cofilin1,5,6,10. Infelizmente, permanecem as principais lacunas de conhecimento em relação ao ASR. Por exemplo, a função das hastes de actin não é conhecida. Não entendemos por que as hastes se formam no citoplasma de alguns tipos de células, mas o núcleo de outros. Também não está claro se o ASR é protetor ou mal adaptável para células ou embriões submetidos a estresse. Finalmente, ainda não sabemos os mecanismos detalhados subjacentes à hiperativação de Cofilin ou ao conjunto de hastes actin. Assim, este protocolo fornece um ensaio rápido e versátil para sondar o ASR visualizando a formação e dinâmica da haste actin no sistema experimental altamente tratável do embrião de mosca de fruta viva.
O protocolo para microinjetar G-actinRed em embriões Drosophila vivos foi inicialmente desenvolvido para estudar a dinâmica das estruturas normais de actina citoplasmática17 durante eventos de construção de tecidos. Nesses estudos, descobrimos que a injeçãovermelha G-actin não afetou negativamente os processos de desenvolvimento precoce no embrião, incluindo citocina ou gastraculação17,18. Em seguida, modificamos o protocolo, adaptando o manuseio de embriões e a injeçãovermelha G-actin para permitir a imagem de hastes de actina em embriões estressados pelo calor submetidos ao ASR1. Outros métodos além da injeção de G-actinRed podem ser usados para visualizar actina em embriões. Esses métodos dependem da expressão de proteínas fluorescentes (FPs) marcadas para atuar ou para domínios de proteínas de ligação de actina, como Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP e Moesin-GFP (revisada em19). No entanto, o uso dessas sondas FP requer cautela, pois podem estabilizar ou interromper algumas estruturas de actina, não rotular igualmente todas as estruturas actin20, e no caso de actin-GFP, são altamente superexpressas – problemáticas para a análise da montagem de haste que não só é dependente do estresse, mas também atua na concentração dependente1. Assim, g-actinred é a sonda preferida para estudos de vara em embriões de mosca, e o grande tamanho do embrião permite sua fácil injeção.
O fluxo de trabalho deste protocolo é semelhante a outras técnicas de microinjeção bem estabelecidas que têm sido utilizadas para injetar proteínas, ácidos nucleicos, drogas e indicadores fluorescentes nos embriões de Drosophila 21,22,23,24,25,26,27. No entanto, após a microinjeção do G-actinRed aqui, os embriões são expostos a um leve estresse térmico para induzir o conjunto de hastes de actina ASR e intranuclear. Para laboratórios com acesso a moscas e uma plataforma de injeção, este método deve ser facilmente implementável e adaptável para linhas específicas de estudo em relação ao ASR, incluindo sua indução por diferentes estresses ou modulação em diferentes origens genéticas.

<table><tbody><tr><td>Trifosfato de adenosina (ATP)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A23835G</td><td>Componente do tampão G Suco de</td></tr><tr><td>maçã, Mott's, 64 fl oz</td><td>Mott's</td><td>014800000344</td><td>Componente de pratos de suco de maçã</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>Componente de pratos de suco de maçã</td></tr><tr><td>Alvejante, PureBright Germicida, hipoclorito de sódio a 6,0%</td><td>KIK International</td><td>059647210020</td><td>Para embriões descorionantes</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C1016500G</td><td>Componente do tampão G</td></tr><tr><td>Filtro de células, 70 &mu; m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>Para a recolha de embriões descorionados</td></tr><tr><td>Microscópio confocal, LSM 880 34 canais com Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>0000001994956</td><td>Para a imagem de imagens de hastes de actina intranucleares</td></tr><tr><td>Dessecante</td><td>Drierite</td><td>24001</td><td>Para dessecar embriões</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação, Stemi 508 Estereoscópio com zoom 8:1</td><td>Zeiss</td><td>4350649000000</td><td>Para organizar embriões em cunha de ágar</td></tr><tr><td>Agulha de dissecação, 5 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>08965A</td><td>Para organizar embriões em cunha de ágar</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1725</td><td>Componente do tampão G</td></tr><tr><td>Fita Dupla Face, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in</td><td>3M</td><td>021200010323</td><td>Para fazer cola de embriões</td></tr><tr><td>Gaiola de coleta de embriões</td><td>Genessee Scientific</td><td>59100</td><td>Para abrigar moscas adultas e coletar embriões Pinças</td></tr> de <tr><td>ponta fina, Pinça Dumont, Estilo 5</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>72701D</td><td>Para organizar embriões em cunha de ágar</td></tr><tr><td>Capilares de vidro, vidro borosílico, fino 1 mm x 0,75 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW1004</td><td>Para microagulhas</td></tr><tr><td>Óleo de halocarbono 27</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H8773100ML</td><td>Para hidratação de embriões</td></tr><tr><td>Incubadora de estágio aquecido</td><td>Zeiss</td><td>4118579020000, 4118609020000, 4118609010000</td><td>Para imagens confocais</td></tr><tr><td>Limpadores de tecidos de laboratório, KimWipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>Limpadores de tecidos de laboratório</td></tr><tr><td>Microscópio de luz, Invertoskop 40C Contraste de fase invertida microscópio, recondicionado</td><td>Zeiss</td><td>Microscópio de injeção</td><td>descontinuado</td></tr><tr><td>Metil-4-hidroxibenzoato</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H36471KG</td><td>Componente de placas de suco de maçã</td></tr><tr><td>Microinjetor, FemtoJet4x</td><td>Eppendorf</td><td>5253000025</td><td>Microinjetor</td></tr><tr><td>Micro pontas de carregador, epT.I.P.S. 20 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Para carregar microagulhas</td></tr><tr><td>Micromanipulador e estágio de injeção com mostradores x,y,z para ajuste da agulha</td><td>Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)</td><td>Personalizado</td><td>Para realizar microinjeções</td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta, Modelo P-97, Flaming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P97</td><td>Para puxar tubos capilares para fazer microagulhas</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura do microscópio 24x50-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>Para montagem de embriões</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio, Lilás Colorfrost, Pré-limpo, 25 x 75 x 1mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037081</td><td>Para montagem de embriões para injeção</td></tr><tr><td>n-Heptano</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3601</td><td>Componente de cola de embrião</td></tr><tr><td>Objetiva, 10x</td><td>Zeiss</td><td>Descontinuado</td><td>10x objetiva para microscópio</td></tr> <tr><td>de injeçãoObjetiva, C-apocromático 40x/1,2 W Korr. Objetiva de água FCS</td><td>Zeiss</td><td>4217679971711</td><td>40x para objetiva confocal</td></tr><tr><td>, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Cor DIC M27 para imersão em óleo, água, óleo de silicone ou glicerina (D=0-0,17 mm) (WD=0,57 mm em D=0,17 mm)</td><td>Objetiva de imersão mista Zeiss</td><td>4208529871000</td><td>25x para objetiva confocal</td></tr><tr><td>, Plan-Apocrhomat 63x/1,40 Óleo DIC f/ELYRA</td><td>Zeiss</td><td>4207829900799</td><td>objetiva de óleo 63x para objetiva confocal</td></tr><tr><td>Pincel, Robert Simmons Expression E85 Pontiagudo Redondo tamanho 2</td><td>Daler-Rowney</td><td>038372016954</td><td>Para transferência de embriões</td></tr><tr><td>Toalhas de papel, toalhas de papel Kleenex C-fold, branco</td><td>Kimberly-Clark</td><td>884266344845</td><td>Para filtro de células de borrão</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur, 5 3/4 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820A</td><td>Para cobrir embriões com óleo</td></tr><tr><td>Placa de Petri, vidro, 100 x 20 mm</td><td>Corning</td><td>3160102</td><td>Para câmara de incubação húmida</td></tr><tr><td>Placa de Petri, plástico, 60 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384092</td><td>Para placas de sumo de maçã</td></tr><tr><td>Pipeta, Eppendorf Referência 0.5-10 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>2231000604</td><td>Para carregar a ponta da pipeta de microagulhas</td></tr><tr><td>, xTIP4 250 &mu; L</td><td>Biotix</td><td>63300006</td><td>Para adicionar cola de embrião à lamínula</td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>VWR</td><td>55411050</td><td>Para cortar cunha de ágar-ágar, fita, pontas de pipeta</td></tr><tr><td>Actina globular conjugada com rodamina, plaquetas humanas (não músculo; 4x10 &mu; g)</td> <td>Citoesqueleto, Inc.</td><td>APHR-A</td><td>G-actin^Red</td></tr><tr><td>Scintillation vial, 20 mL Borosillicate de vidro com revestimento de polietileno e tampas de ureia</td><td>Fisher Scientific</td><td>033377</td><td>Para fazer cola de embriões</td></tr><tr><td>Frasco com tampa de rosca, 16 oz</td><td></td><td>Nalgene 000194414195</td><td>Para dessecar embriões</td></tr><tr><td>Microscopia eletrônica de estágio Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>602104PG</td><td>Para calibrar o volume de injeção de G-actina</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>840971KG</td><td>Componente de pratos de suco de maçã</td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T15031KG</td><td>Componente de G buffer</td></tr><tr><td>Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz</td><td>Lesaffre Yeast Corporation</td><td>117929157002</td><td>Componente de pasta de levedura</td></tr></tbody></table>

imagens intranuclear actin rods em embriões de drosophila estressados de calor vivo

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

O objetivo deste protocolo é visualizar hastes de actina intranucleares que se reúnem em embriões de melanogaster Drosophila vivos após estresse térmico. As hastes actina são uma marca registrada de uma Resposta ao Estresse Actin (ASR) conservada e indutível que acompanha patologias humanas, incluindo doenças neurodegenerativas. Anteriormente, mostramos que o ASR contribui para falhas de morfogênese e viabilidade reduzida do desenvolvimento de embriões. Este protocolo permite o estudo contínuo dos mecanismos subjacentes à montagem da haste actin e do ASR em um sistema modelo altamente favorável à imagem, genética e bioquímica. Os embriões são coletados e montados em uma tampa para prepará-los para injeção. A actina globular conjugada por rhodamina(G-actin Red) é diluída e carregada em uma microacela. Uma única injeção é feita no centro de cada embrião. Após a injeção, os embriões são incubados a temperatura elevada e as hastes de actina intranuclear são então visualizadas por microscopia confocal. A recuperação da fluorescência após experimentos de fotobleaching (FRAP) pode ser realizada nas hastes de actin; e outras estruturas ricas em actina no citoplasma também podem ser imagens. Descobrimos que o G-actinRed polimeriza como g-actina endógeno e não interfere, por si só, no desenvolvimento normal de embriões. Uma limitação deste protocolo é que deve-se tomar cuidado durante a injeção para evitar ferimentos graves no embrião. No entanto, com a prática, injetar G-actinRed em embriões de Drosophila é uma maneira rápida e confiável de visualizar hastes de actina e pode ser facilmente usada com moscas de qualquer genótipo ou com a introdução de outros estresses celulares, incluindo hipóxia e estresse oxidativo.

Um fluxo de trabalho esquemático de manuseio de embriões é retratado na Figura 1, e um cronograma para um experimento típico é apresentado na Tabela 1. Uma estimativa para um bom resultado experimental é que para cada 10 embriões injetados, pelo menos metade dos embriões vistos estará no estágio correto de desenvolvimento, não danificado, e exibirá um ASR robusto com estresse térmico a 32 °C. Este ASR será evidenciado pela montagem de hastes de actina intranuclear, como mos...

O objetivo deste protocolo é injetar actina globular conjugada por Rhodamine em embriões Drosophila e montagem de haste de actina intranuclear de imagem após estresse térmico.

Imagens Intranuclear Actin Rods em Embriões de Drosophila estressados de calor vivo

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Nosso protocolo é significativo porque usa a técnica bem estabelecida de microinjeção em embriões de Drosophila para permitir novas pesquisas sobre a resposta ao estresse de actina e a montagem da haste de actina que a acompanha. A principal vantagem dessa técnica é que podemos estudar a resposta ao estresse da actina em uma variedade de contextos, como uma tela mutante ou sob diferentes condições de estresse. Um indivíduo que nunca realizou essa técnica antes pode ter dificuldades para manusear os embriões e realizar a microinjeção.Recomendamos praticar essas etapas até que o usuário se sinta confortável. A demonstração visual desse método é crítica porque as etapas de manuseio, posicionamento e montagem do embrião para microinjeção e imagem podem não ser claras apenas com as instruções escritas. Prepare copos de coleta de embriões e pratos de ágar suco de maçã de acordo com as instruções do manuscrito.Para promover a postura de ovos mais generosa, monte copos de coleta com moscas dois dias antes do experimento. Adicione pelo menos 100 moscas fêmeas e 50 machos a cada copo de coleta e cubra-o com um prato de suco de maçã. Preparar uma solução de trabalho de vermelho de actina G e guardá-la no gelo até que seja carregada na microagulha.Deixe as moscas colocarem embriões por 30 minutos nas placas de suco de maçã com pasta de fermento a 18 graus Celsius. Enquanto as moscas estão pondo, corte uma fatia retangular de quatro por um centímetro de ágar suco de maçã com uma lâmina de barbear e coloque-a em uma lâmina de vidro de 25 por 75 milímetros. Colha a placa da coleção e descorione os embriões despejando solução de água sanitária fresca na placa e girando-a por um minuto.Umedeça as cerdas de um pincel com água destilada e, em seguida, use-o para transferir embriões descorionados e lavados da cesta de coleta para a fatia de ágar suco de maçã preparada na lâmina de vidro. Use uma pinça de ponta fina ou uma agulha de dissecação para organizar 10 embriões em linha reta ao longo do eixo longo da cunha retangular de ágar. Disponha os embriões da cabeça à cauda de forma que o lado dorsal fique voltado para o pesquisador.Corte meio centímetro da ponta de uma pipeta P200 com uma lâmina de barbear e mergulhe-a na cola do embrião. Cubra generosamente uma região de cinco milímetros ao longo da borda longa de uma lamínula retangular de 24 por 50 milímetros e deixe secar com o lado da cola para cima. Depois que a cola do embrião secar, coloque delicadamente a lamínula com o lado voltado para baixo em cima da fileira de embriões alinhados no ágar, deixando dois a três milímetros de espaço entre a borda da lamínula e a fileira de embriões.Vire a lamínula para que os embriões fiquem voltados para cima. Eles devem ser presos em uma linha ao longo de uma longa borda da lamínula com sua região ventral voltada para a borda mais próxima. Coloque a lamínula em cima de 150 gramas de dessecante azul fresco em um frasco de rosca de 16 onças e aperte bem a tampa.Dessece os embriões por 8 a 10 minutos, depois remova a lamínula do frasco dessecante e prenda cada lado curto da lamínula em uma lâmina de microscópio com o embrião voltado para cima. Adicione duas a três gotas de óleo de carbono oco 27 com uma pipeta Pasteur para cobrir os embriões alinhados e protegê-los de mais desidratação. Enquanto os embriões estão dessecando, carregue o sobrenadante vermelho de G-actina previamente preparado na microagulha com uma ponta de microcarregador.Prenda a microagulha ao porta-agulha e aperte o parafuso. Coloque a lâmina com os embriões montados no microscópio stage e use os controles de microagulha para trazer a agulha para o mesmo plano focal que os embriões. Insira a microagulha no embrião de modo que ela atinja o embrião no meio de sua região ventral no equador do embrião.Quando a ponta da microagulha estiver visível no meio do embrião, acione a injeção. Após a injeção, remova lentamente a microagulha. Mova o palco e execute a injeção nos outros embriões.Depois de todos os embriões terem sido injetados, coloque a lâmina com os embriões em uma câmara de incubação úmida e feche a tampa. Remova a lâmina com os embriões injetados da câmara de incubação úmida. Trabalhando rapidamente, retire delicadamente os pedaços de fita dupla-face que foram usados para colar a lamínula na lâmina.Cole dois pedaços de fita dupla face de 2,5 centímetros de comprimento e corte a fita ao meio no sentido do comprimento para fazer duas tiras. Cole 2/3 do comprimento de cada tira de fita na primeira lamínula, apagando cada lado dos embriões. Deixe 1/3 das tiras de fita penduradas na borda da primeira lamínula onde os embriões estão presos.Coloque delicadamente uma segunda lamínula retangular em cima das tiras de fita para colocar os embriões entre as lamínulas, alinhando as bordas de 25 milímetros, mas mantendo as bordas de 50 milímetros deslocadas uma da outra em um centímetro. Confirme se o aquecido stage está na temperatura apropriada. E se estiver usando um microscópio invertido, adicione líquido de imersão na lente objetiva selecionada.Coloque o sanduíche de lamínula no palco com cuidado, certificando-se de que a nova superfície de imagem seja a que toca o líquido de imersão. Concentre-se em um embrião que está em celularização, depois mude para o modo de aquisição de laser no microscópio confocal e ajuste a potência e o ganho do laser, o tamanho do quadro, o lado a lado e as configurações de projeção conforme desejado. Faça imagens de visão de superfície através dos planos focais dos núcleos do embrião para encontrar bastonetes de actina intranucleares.Os bastonetes devem aparecer em várias orientações como listras brilhantes ou pontos dentro dos núcleos comparativamente escuros. A resposta ao estresse de actina e embriões estressados pelo calor é evidente pela montagem de bastonetes de actina intranucleares. Os bastonetes de actina aparecem em diferentes orientações dentro dos núcleos e podem ser visualizados através de vários planos focais.Em comparação, os embriões de controle incubados a 18 graus Celsius não exibem bastonetes de actina. A porcentagem de núcleos contendo bastonetes pode ser quantificada e experimentos FRAP podem ser realizados nos bastonetes. Um exemplo de um gráfico de recuperação de fluorescência para uma região branqueada versus não branqueada de uma haste de actina é mostrado aqui.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a formação da haste de actina depende da temperatura. Para as etapas seguintes à microinjeção, é crucial manter os embriões na temperatura de incubação desejada. Após a microinjeção, o pesquisador pode realizar FRAP para confirmar a falta de renovação da F-actina nas hastes de actina ou para quantificar as mudanças na renovação da F-actina que ocorrem em outras estruturas ricas em actina.

imaging-intranuclear-actin-rods-live-heat-stressed-drosophila

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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A contratilidade da actomiosina desempenha um papel importante na morfogênese celular e tecidual. No entanto, é um desafio manipular agudamente a contratilidade da actomiosina in vivo . Este protocolo descreve um sistema optogenético que inibe rapidamente a contratilidade da actomiosina mediada por Rho1 em embriões de Drosophila , revelando a perda imediata da tensão epitelial após a inativação da actomiosina in vivo.

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Este protocolo descreve a marcação e a injeção de fluorescência personalizadas baseadas em anticorpos em embriões iniciais de Drosophila para permitir imagens vivas de proteínas de baixa abundância ou modificações pós-traducionais que são difíceis de detectar usando abordagens tradicionais de GFP/mCherry-tag.

Visualizando Proteínas de Baixa Abundância e Modificações Pós-Traducionais em Embriões Vivos de Drosophila Via Injeção de Anticorpos Fluorescentes

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para realizar imagens ao vivo da divisão assimétrica de células-tronco germinativas (GSCs) no nicho ovariano de Drosophila. Usamos uma linhagem transgênica que expressa de forma ubíqua uma fusão de proteína fluorescente verde (GFP) da proteína do espectrossomo Par-1.

Imagem ao vivo estendida de nichos de células-tronco germinativas de Drosophila melanogaster fêmea

Aprenda a técnica de microinjeção em embriões de Drosophila para visualizar a montagem de bastonetes de actina intranuclear sob estresse térmico. Este método permite estudar a resposta ao estresse celular em biologia do desenvolvimento.

Imagens Intranuclear Actin Rods em Embriões de Drosophila estressados de calor vivo

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