Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análise de interação proteína-proteína de membrana

Este protocolo ajudará os pesquisadores a determinar com mais precisão o estado oligomérico nativo das proteínas de membrana, utilizando o sistema de nanopartículas da membrana celular nativa em conjunto com a microscopia eletrônica. A vantagem dessa técnica é que ela fornece dados estruturais precisos de proteínas de membrana em um ambiente semelhante à membrana celular nativa e pode ser utilizada para futura determinação de estrutura de alta resolução. Demonstrando o procedimento estará Kyle Kroeck, um pós-doutorando do meu laboratório.

Para preparar nanopartículas de membrana celular nativa, ressuspenda um grama do pellet de membrana de interesse em 10 mililitros de tampão NCMN A. Use um homogeneizador Dounce de vidro para homogeneizar a amostra de membrana celular ressuspensa a 20 graus Celsius e transfira a amostra suspensa para um tubo de polipropileno de 50 mililitros. Adicione a solução estoque de polímero ativo de membrana e o tampão NCMN A adicional à amostra até uma concentração final de 2,5% de polímero ativo de membrana e agite a solução por duas horas a 20 graus Celsius. No final da incubação, ultracentrifugar a amostra.

Durante a centrifugação, equilibre uma coluna NTA de níquel de cinco mililitros com 25 mililitros de tampão NCMN A.At final da centrifugação, transfira o sobrenadante para a coluna e use uma bomba de seringa ajustada para uma vazão de 0,5 mililitro por minuto para carregar o sobrenadante na coluna a 20 graus Celsius. Lave as linhas da máquina de cromatografia líquida de proteína rápida com tampão NCMN B suficiente para lavar completamente o sistema e conectar a coluna à máquina de cromatografia. Lave a coluna com 30 mililitros de NCMN Buffer B a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto e colete o fluxo.

Lave a coluna com 30 mililitros de NCMN Buffer C a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto e colete o fluxo. Eluir a proteína com 20 mililitros de Tampão D NCMN a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitro por minuto e usar um coletor de frações para coletar frações de um mililitro da amostra, depois armazenar as amostras de proteína a quatro graus Celsius usando SDS-PAGE para verificar as amostras que correspondem aos picos observados no gráfico de eluição de cromatografia líquida de proteína rápida. Para preparar grades de manchas negativas, enrole uma lâmina de vidro com papel de filtro com o lado de carbono voltado para cima e coloque as grades que serão usadas para a preparação da amostra na lâmina.

Coloque a lâmina de vidro com as grades do microscópio eletrônico na câmara de um descarregador de brilho entre os dois eletrodos e recoloque a tampa de vidro, certificando-se de que a tampa esteja centralizada e bem vedada. Ligue a máquina de descarga de brilho e certifique-se de que a luz roxa gerada pelo plasma esteja visível. Quando a máquina terminar de funcionar, espere até que a câmara atinja a pressão atmosférica antes de remover a tampa de vidro e colocar a corrediça na bancada.

Ajuste a concentração das amostras de proteína purificada para cerca de 0,1 miligramas por mililitro e carregue 3,5 microlitros da amostra de proteína na grade de carbono de 10 nanômetros de espessura. Após um minuto, use um pedaço de papel de filtro para remover o líquido da superfície da grade de microscopia eletrônica e lave a superfície da grade três vezes com uma gota de três microlitros de água por lavagem. Após a última lavagem com água, lave a superfície da grade mais duas vezes com três gotículas de microlitro de acetato de urânio a 2% filtrado fresco por lavagem.

Após a última lavagem com acetato de urânio, manche a grade com uma gota de três microlitros de acetato de urânio a 2% filtrado fresco por um minuto. No final da incubação, use um novo pedaço de papel de filtro para remover a gota e seque a grade ao ar por pelo menos um minuto antes de armazená-la em uma caixa de grade para uso posterior. Aqui, imagens negativas de coloração obtidas usando microscopia eletrônica de transmissão, conforme demonstrado, podem ser observadas.

A imagem negativa da coloração para a amostra de proteína B do canal de resistência da acraflavina do tipo selvagem purificada com detergente revela uma solução homogênea de partículas monodispersas com a proteína exibindo uma estrutura quaternária trimérica bem definida. Essas estruturas triméricas correspondem ao cromatograma de exclusão de tamanho observado após a purificação. Em comparação, na imagem de coloração negativa para o mutante P223G também purificado com detergente, uma solução heterogênea de nanopartículas polidispersas com propensão à agregação, mas sem trímeros nativos observáveis, pode ser observada.

Esses resultados também são apoiados pela cromatografia de exclusão de tamanho. Resultados semelhantes foram observados para proteínas do tipo selvagem e mutantes após purificação com o polímero ativo de membrana NCMNP11. O uso do polímero NCMNP52 facilita a geração de nanopartículas de membrana celular nativa em tamanhos muito maiores, permitindo que vários trímeros da proteína B do canal de resistência da acraflavina sejam visualizados em uma única partícula de membrana celular nativa.

Na amostra mutante, no entanto, nenhuma partícula trímera é observada, mesmo quando se olha para as grandes manchas de bicamada da membrana celular nativa. A análise SDS-PAGE das amostras de proteína purificada confirma a presença de resistência B à acraflavina em todas as amostras com pureza superior a 95% no peso molecular previsto da proteína. Ao modificar este protocolo para outras proteínas, é importante determinar experimentalmente a quantidade apropriada de fração de membrana e o comprimento, tempo e temperatura para o processo de solubilização.

Se as imagens de sua amostra revelarem uma solução homogênea de partículas monodispersas com unidades estruturais bem definidas, a amostra pode ser usada para determinação de estrutura de alta resolução com microscopia crioeletrônica.