Name: Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análise de interação proteína-proteína de membrana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Aprenda a determinar o estado oligomérico nativo de proteínas de membrana usando nanopartículas de membrana celular nativa e microscopia eletrônica. Este método fornece dados estruturais precisos em ambiente semelhante à membrana celular nativa.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo fundo de startups VCU (para Y.G.) e pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número R01GM132329 (para Y.G.) O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. Agradecemos a Montserrat Samso e Kevin McRoberts pelo generoso apoio à gravação de vídeo.

1. Expressão proteica
<ol><li>Inocular 15 mL de mídia de caldo fantástico (TB) com antibióticos específicos para plasmídeos com células pLysS BL21(DE3) contendo o AcrB expressando plasmídeos em tubos de 50 mL durante a noite a 37 °C com agitação a 250 rpm.</li>
	<li>Verifique a densidade óptica da cultura overnight em 600 nm (OD600) e certifique-se de que ela tenha mais de 2,0.</li>
	<li>Diluir 5 mL de cultura celular em 1 L de mídia de TB contendo antibióticos específicos para plasmídeos e incubar a 37 °C com agitação até OD600=0,8 e, em seguida, induzir com IPTG que tem uma concentração final de 1 mM.</li>
	<li>Realizar indução a 20 °C com agitação por 20 h.</li>
	<li>Pelota para baixo das células usando centrifugação por 15 minutos a 4 °C e 4.000 x g.</li>
</ol>2. Lise celular e isolamento da membrana
<ol><li>Resuspenda a pelota de célula no Buffer A (Tabela 1, use buffer DDM A ou NCMNs Buffer A, dependendo do esquema de purificação a seguir) usando 80 mL para cada 20 g da pelota celular.</li>
	<li>Homogeneize as pelotas de células resuspended usando um homogeneizador do Dounce de vidro a 4 °C ou se à temperatura ambiente certifique-se de colocar no gelo imediatamente depois.</li>
	<li>Transfira a amostra para um béquer metálico no gelo e lise as células carregando-as em um homogeneizador de alta pressão a 4 °C e 1.500 bar.<ol>
<li>Repita o processo de carregar as células no homogeneizador e permitindo que elas passem pelo homogeneizador por 3-4 ciclos ou até que o lise comece a esclarecer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar o lysate a 15.000 x g para 30 min a 4 °C.</li>
	<li>Colete o supernatante e carregue em tubos ultracentrífugas e centrífuga a 215.000 x g por 1 h a 4 °C.</li>
	<li>Descarte o supernatante e colete as pelotas de membrana dos tubos ultracentrífugas. Armazene qualquer excesso de pelota de membrana a -80 °C.</li>
</ol>3. Preparação de nanopartículas de membrana celular nativa
<ol><li>Resuspend 1 g de pelota de membrana em 10 mL NCMNs Buffer A (Tabela 1).</li>
	<li>Homogeneize a amostra de membrana celular resuspended com um homogeneizador do Dounce de vidro a 20 °C.</li>
	<li>Transfira a amostra de membrana suspensa para um tubo de polipropileno de 50 mL e adicione a solução de estoque de polímeros ativos de membrana e nCMNs buffer A adicional para levar a amostra a uma concentração final de polímero ativo de membrana de 2,5% (w/v) (NCMNP1-1 ou NCMNP5-2). NOTA: As soluções de estoque de polímeros ativos de membrana devem ser feitas em água dupla destilada e podem ser mantidas em concentrações variadas, mas tipicamente 10% (w/v).</li>
	<li>Agite a amostra por 2h a 20 °C.</li>
	<li>Carregue a amostra em uma ultracentrifuagem e gire a 150.000 x g por 1 h a 20 °C.</li>
	<li>Enquanto a amostra está sendo ultra-centrífugas começam a equilibrar uma coluna Ni-NTA de 5 mL com 25 mL de NCMNs Buffer A.</li>
	<li>Colete o supernatante após a ultracentrifugação estiver completa e carregue-o em 5 mL de coluna Ni-NTA à temperatura ambiente com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min usando uma bomba de seringa.</li>
	<li>Lave linhas de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) com o suficiente NCMNs Buffer B(Tabela 1) para lavar completamente o sistema e, em seguida, conectar a coluna à máquina FPLC.</li>
	<li>Lave a coluna com 30 mL de NCMNs Buffer B com uma taxa de fluxo de 1 mL/min e colete o fluxo através.</li>
	<li>Lave a coluna com 30 mL de NCMNs Buffer C(Tabela 1) com uma taxa de fluxo de 1 mL/min e colete o fluxo através.</li>
	<li>Elute a proteína com 20 mL de NCMNs Buffer D(Tabela 1) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min e colete a amostra usando um coletor de frações e as frações cada uma sendo definidas para 1,0 mL.</li>
	<li>Armazene as amostras de proteína a 4 °C.</li>
	<li>Execute um ensaio de eletroforese de gel SDS-PAGE para verificar as amostras que correspondem aos picos observados no gráfico de eluição FPLC.</li>
</ol>4. Eletroforese de gel SDS-PAGE
<ol><li>Prepare a câmara de fundição fixando o vidro no aparelho de fundição.</li>
	<li>Prepare o gel de separação de 12% de acordo com a receita listada na Tabela 1. NOTA: Uma vez que temed é adicionado o gel irá polimerizar rapidamente, por isso só adicione esta uma vez pronta para derramar o gel.</li>
	<li>Despeje o gel, deixando 2 cm abaixo da parte inferior do pente para o gel de empilhamento.</li>
	<li>Remova as bolhas colocando a parte superior do gel com isopropanol 100% e espere o gel de separação polimerizar.</li>
	<li>Remova o isopropanol e lave os traços do isopropanol com água destilada.</li>
	<li>Prepare o gel de empilhamento de acordo com a receita listada na Tabela 1. NOTA: Uma vez que temed é adicionado o gel irá polimerizar rapidamente, por isso só adicione esta uma vez pronta para derramar o gel.</li>
	<li>Despeje o gel de empilhamento em cima do gel de separação.</li>
	<li>Adicione um pente à câmara para formar os poços e espere que o gel de empilhamento polimerize completamente.</li>
	<li>Coloque 1 μL de 1 M DTT em um tubo de microcentrífuga para cada amostra de fração que precisa ser executada no gel.</li>
	<li>Adicione 7 μL de 4x tampão de carga a cada tubo também.</li>
	<li>Adicione 20 μL de amostra das frações que precisam ser executadas no gel a cada tubo de microcentrifuuagem.</li>
	<li>Vórtice os tubos contendo as amostras.</li>
	<li>Gire os tubos de amostra usando um microcentrifuuge de mesa para 3 s e certifique-se de que toda a amostra tenha retornado ao fundo dos tubos.</li>
	<li>Prepare a célula de eletroforese de gel, fixando um de gel de poliacrilamida de 12% no lugar e preenchendo as câmaras internas e externas da célula com Tampão Tris-acetato-EDTA (TAE)(Tabela 1).</li>
	<li>Coloque o marcador de peso molecular na primeira faixa do gel com o volume apropriado exigido por suas instruções.</li>
	<li>Carregue 28 μL da amostra de cada tubo misturado com DTT e tampão de carga.</li>
	<li>Coloque a tampa da célula de eletroforese em cima da caixa e conecte a tampa na fonte de alimentação.</li>
	<li>Ligue a fonte de alimentação e coloque-a em 100 V e deixe-a funcionar por 20 minutos.</li>
	<li>Depois de 20 minutos, aumente a corrente de alimentação para 140 V e continue a executá-la por mais 30-40 minutos ou até que a faixa de corante tampão de carga atinja a parte inferior do de gel.</li>
	<li>Após completar a mancha de eletroforese e desfoca o gel para visualizar as faixas proteicas contidas dentro do gel.</li>
</ol>5. Purificação de proteínas usando DDM
NOTA: O objetivo de realizar este processo de purificação é servir como um controle para os experimentos que utilizam os polímeros ativos da membrana.
<ol><li>Resuspend 6-10 g de pelota de membrana, a partir da etapa 2.6, em DDM Buffer A (Tabela 1) utilizando 5 mL/g de pelota de membrana.</li>
	<li>Homogeneize a amostra resuspended com um homogeneizador do Dounce de vidro a 4 °C ou se à temperatura ambiente certifique-se de colocar gelo imediatamente depois.</li>
	<li>Transfira a amostra para um tubo de polipropileno de 50 mL e adicione DDM e buffer DDM adicional A para levar a amostra a uma concentração final de 2% DDM.</li>
	<li>Agite a amostra por 2h a 4 °C.</li>
	<li>Carregue a amostra em tubos ultracentrífugas e centrífuga por 1h a 4 °C e 150.000 x g.</li>
	<li>Enquanto a amostra está sendo ultra-centrífugas começam a preparar os 5 mL da coluna Ni-NTA lavando com 25 mL de Buffer DDM A (Tabela 1).</li>
	<li>Depois que a ultracentrifugação estiver completa, colete o supernatante e carregue-o na coluna Ni-NTA de 5 mL a 4 °C com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min usando uma bomba de seringa.</li>
	<li>Lave as linhas FPLC com buffer DDM suficiente B + 0,05% DDM(Tabela 1) para lavar completamente o sistema e, em seguida, anexar a coluna à máquina FPLC.</li>
	<li>Lave a coluna com 30 mL de DDM Buffer B + DDM 0,05% DDM com uma vazão de 1 mL/min e colete o fluxo através.</li>
	<li>Lave a coluna com 30 mL de DDM Buffer C + 0,05% DDM(Tabela 1) com uma taxa de fluxo de 1 mL/min e colete o fluxo através.</li>
	<li>Elute a proteína com 20 mL de DDM Buffer D + 0,05% DDM(Tabela 1) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min e colete o fluxo através de um coletor de frações e as frações cada uma sendo definidas para 1,0 mL.</li>
	<li>Selecione as frações que contêm o pico de elução para agrupamento e concentração usando um concentrador centrífugo e centrifugação a 4.000 x g e 4 °C até atingir 500 μL.</li>
	<li>Usando um loop de 500 μL, carregue a amostra na máquina FPLC e, em seguida, na coluna de exclusão de tamanho de 25 mL a 4 °C. Elute utilizando 30 mL de Buffer DDM E + 0,05% DDM(Tabela 1) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min e coletar como frações com os tamanhos de fração definidos para ser 0,5 mL por fração.</li>
	<li>Pegue as frações e meça a concentração proteica usando absorvância de 280 nm para confirmar a curva UV-Vis do gráfico de eluição FPLC.</li>
	<li>Colete 20 μL de cada fração amostral que corresponda aos picos observados no gráfico de eluição fplc e foi confirmado ser preciso com o teste de absortância.</li>
	<li>Congele o restante dessas frações amostrais usando nitrogênio líquido ou gelo seco em alíquotas desejadas e armazene amostras de proteínas a -80 °C.</li>
	<li>Execute um ensaio de eletroforese de gel SDS-PAGE como descrito anteriormente para verificar as amostras que correspondem aos picos observados no gráfico de eluição FPLC.</li>
</ol>6. Preparação negativa da grade de manchas
<ol><li>Coloque as grades que serão usadas para a preparação da amostra em um slide de vidro envolto em papel filtro com o lado carbono voltado para cima.</li>
	<li>Coloque o deslizamento de vidro com as redes de microscópio eletrônico na câmara de um descarregador de brilho entre os dois eletrodos e substitua a tampa de vidro certificando-se de que está centrada e bem selada.</li>
	<li>Execute a máquina de descarregamento de brilho e certifique-se de que a luz roxa gerada pelo plasma esteja visível.</li>
	<li>Quando a máquina terminar de funcionar, espere até que a câmara tenha atingido a pressão atmosférica para remover a tampa de vidro e, em seguida, retornar o slide com as grades para o banco onde as amostras serão carregadas sobre eles.</li>
	<li>Ajuste a concentração das amostras de proteínas purificadas para cerca de 0,1 mg/mL diluindo a amostra com o buffer apropriado ou concentrando-se usando um concentrador centrífuga.</li>
	<li>Carregue 3,5 μL de amostra de proteína na rede de carbono de 10 nm de espessura e espere por 1 min.</li>
	<li>Remova o líquido da superfície da rede EM com um papel filtro.</li>
	<li>Lave a superfície da rede 3x pegando gotículas de 3 μL de água com a rede e removendo a água da rede com papel filtro entre a coleta de cada gota.</li>
	<li>Lave a superfície da rede 2x pegando gotículas de 3 μL de acetato de urânio fresco e filtrado de 2% e remova as soluções de lavagem na rede com papel filtro entre a captação de cada gota.</li>
	<li>Manche a rede com uma gota de 3 μL de acetato de urânio fresco e filtrado de 2% por 1 min.</li>
	<li>Remova a solução de acetato de urânio na superfície da rede EM com papel filtro e o ar seque a rede por pelo menos 1 min.</li>
	<li>Armazene a grade em uma caixa de grade para uso posterior.</li>
</ol>7. Imagem EM
<ol><li>Coloque a grade preparada no suporte da grade em uma bancada segura.</li>
	<li>Prepare o microscópio colocando os microscópios deguerr em uma caixa de poliestireno e encher o dewar 3/4 cheio de nitrogênio líquido.</li>
	<li>Confirme que a tampa de borracha da janela do microscópio está cobrindo-a e, em seguida, carregue o deguerr o microscópio colocando os fios de cobre na dewar até que ele se encaixe na plataforma.</li>
	<li>Encha o resto da de guerra com nitrogênio líquido e coloque uma tampa em cima da de guerra para cobri-la.</li>
	<li>Ligue a alta tensão, condiciona o microscópio e espere que o microscópio aqueça e estabeleça um nível de vácuo seguro para uso.</li>
	<li>Uma vez que o microscópio esteja pronto abra a válvula da coluna e confirme que o feixe está presente removendo a tampa de borracha na janela do microscópio.</li>
	<li>Verifique a estigma da viga espalhando-se para dentro e para fora ajustando a intensidade do feixe. Se o astigmatismo estiver presente, o feixe terá uma forma elíptica à medida que se afasta do cruzamento e o feixe deve ser a mesma forma oval em ambos os lados.</li>
	<li>Ajuste os binóculos do microscópio para ser a altura e distância certas de acordo com os olhos do observador.</li>
	<li>Verifique o posicionamento do feixe para os modos De Pesquisa, Focoe Exposição pedalando pelos três modos até que o feixe esteja central em cada um.</li>
	<li>Feche a válvula da coluna e prossiga para carregar o suporte da grade no microscópio eletrônico.</li>
	<li>Ajuste o microscópio à altura eucêntrica usando o recurso oscilador dos microscópios e ajustando o movimento do estágio usando o eixo Z até que não haja movimento lado a lado da amostra no centro.</li>
	<li>Usando o modo de pesquisa de baixa dose no microscópio procure na grade uma área desejável de contraste razoável com moléculas de amostra presentes para se concentrar na amostra.</li>
	<li>Concentre-se na amostra no modo Focus usando um tamanho de passo alto até que a amostra seja vista e, em seguida, diminua as etapas para encontrar o nível de foco correto.</li>
	<li>Zero e branco o feixe e, em seguida, certifique-se de que a almofada de borracha está cobrindo a janela do microscópio.</li>
	<li>Usando o modo Exposição, pegue a imagem da área de grade desejada para uma exposição de 1 s a uma ampliação de 62.000x e verifique a imagem obtida.</li>
	<li>Quando feito a imagem de uma grade feche as válvulas da coluna e remova o suporte da grade da coluna.</li>
	<li>Quando terminou a imagem todas as grades de juros desligam o microscópio desligando a energia do filamento e removendo o de guerra de nitrogênio líquido do microscópio.</li>
	<li>Coloque algo para absorver umidade no suporte onde o dewar sentou-se para pegar condensação das bobinas de cobre do microscópio.</li>
	<li>Ative o modo Ciclo Cryo e certifique-se de que a bomba turbo está desligada.</li>
</ol>

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</ol>

Y.G é listado como inventor do polímero ativo de membrana NCMNP5-2 e sistema NCMN.

As interações proteína-proteína são importantes para a integridade da estrutura e função das proteínas da membrana. Muitas abordagens foram desenvolvidas para investigar interações proteína-proteína. Quando comparadas com proteínas solúveis, as proteínas de membrana e seus PPIs são mais difíceis de estudar devido às propriedades intrínsecas únicas das proteínas da membrana. Essa dificuldade vem principalmente da exigência de proteínas de membrana para serem incorporadas em um ambiente nativo de bicamadas lipídicas para e...

As interações proteína-proteína (PPI) desempenham papéis fundamentais ao longo da biologia, desde a manutenção da estrutura e função das proteínas até a regulação de sistemas inteiros. Os PPIs vêm de muitas formas diferentes e podem ser categorizados com base em que tipos de interações formam. Uma dessas categorizações é homooligomerica ou heterooligomerica, baseada em se as interações são entre subunidades idênticas ou proteínas diferentes agindo como subunidades. Outra categorização baseia-se na força da interação se as interações levarem à formação de complexos estáveis ou estados complexos transitórios. Informações estruturais sobre os PPIs entre proteínas são cruciais na compreensão do mecanismo pelo qual as proteínas exercem sua função. Estima-se que mais de 80% das proteínas dependem de formação complexa para exercer suas funções funcionais1. Dado que a porcentagem de proteínas observadas para depender de PPIs para o bom funcionamento inato seu significado na biologia é facilmente aparente, mas ser capaz de investigar adequadamente as proteínas que se envolvem nessas interações tem permanecido desafiador devido a limitações nas técnicas disponíveis para observar experimentalmente quando as proteínas estão formando PPIs.
Há um alto grau de discordância entre os resultados de muitos PPIs experimentalmente determinados devido à alta quantidade de ruídos, falsos positivos e falsos negativos que são derivados de muitas das técnicas de determinação do PPI atualmente disponíveis. Isto é particularmente para o sistema de leveduras dois híbridos (Y2H), espectrometria tandem affinity purificação-massa (TAP-MS) e transferência de energia de ressonância fluorescência (FRET), que representam três dos métodos mais utilizados para a determinação do PPI2,3,4,5,6,7. Em comparação, técnicas de biologia estrutural proteica, como ressonância magnética nuclear (RMN), cristalografia de raios-X e microscopia eletrônica (EM), podem ser usadas para obter informações estruturais de alta resolução sobre interações proteína-proteína até o nível atômico e permitir a confirmação visual direta das interações ocorridas para uma proteína alvo de interesse. Todas as técnicas de pesquisa de determinação de PPI não estruturadas atualmente disponíveis (por exemplo, Y2H, TAP-MS e FRET) não têm essa capacidade e, além disso, sofrem com dificuldade em identificar interações fracas e transitórias entre as proteínas5. Essas deficiências são ainda mais aprimoradas ao estudar proteínas de membrana devido à complexidade adicional trazida pela variável adicional do ambiente lipídico que influencia a formação de estrutura quaternária adequada e montagem complexa heteromica.
As proteínas da membrana compõem uma grande parte do proteome e são conhecidas por desempenhar muitos papéis cruciais no bom funcionamento celular dentro de todos os organismos vivos. Apesar de as proteínas de membrana serem estimadas em 27% do genoma humano e constituir ~60% de todos os alvos atuais de medicamentos, há uma anomalia importante no número de modelos resolvidos para proteínas de membrana que compõem apenas ~2,2% de todas as estruturas proteicas publicadas8,9,10. A principal causa da discrepância na disponibilidade de informações estruturais está nas propriedades intrínsecas das próprias proteínas de membrana. Devido à sua baixa solubilidade, dependência de interações com um ambiente lipídico para manter a estrutura e a função nativas, e várias propriedades físico-químicas da própria membrana lipídica, as proteínas da membrana continuam a representar um problema substancial ao implementar técnicas de biologia estrutural para estudá-las. Dessas propriedades intrínsecas, a mais importante para obter informações estruturais precisas é a exigência de ter interações com seu ambiente lipídico natural para que eles mantenham sua estrutura e função nativas. O ambiente lipídico é uma parte tão integral da estrutura e função das proteínas de membrana que o conceito de memteina (uma combinação das palavras membrana e proteína) tem sido proposto como a unidade fundamental da estrutura e função membrana-proteína11. Apesar da importância das interações lipídica-proteínas, as técnicas de determinação do PPI atualmente disponíveis na estrutura exigem que as proteínas que estão sendo estudadas sejam solúveis ou solubilizadas com detergentes. A exposição a detergentes severos pode desnaturar as proteínas ou causar falsos positivos e negativos devido à delipidação, que pode induzir agregação, desnaturação de proteínas, dissociação de interações não covalentes e formação de estados oligomeóricos artificiais. Devido à necessidade de manter um ambiente lipídico natural para determinação precisa do estado oligomerico nativo das proteínas da membrana, desenvolvemos um sistema de nanopartículas de membrana celular nativa (NCMNs)12 com base no método Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13.
O SMALP usa copolímero de ácido estireno macho como polímero ativo de membrana para extrair e solubilizar proteínas de membrana. Poly (Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) é um polímero anfílico único devido à sua moiety hidrofóbica e diametralmente oposta moiety ácido hidrofílico masculino. Ele forma nanopartículas por adsorviar, desestabilizar e interromper a membrana celular em um mecanismo dependente de pH14. Esta atividade funcional de SMA é o que permite que ela seja utilizada como um sistema livre de detergente para extração e solubilização de proteínas de membrana. O sistema NCMN é distinto do sistema SMALP em vários aspectos. A característica mais única do sistema NCMN é que ele possui uma biblioteca de polímeros ativos de membrana com uma infinidade de polímeros que têm propriedades únicas que os tornam adequados para o isolamento de muitas proteínas de membrana diferentes que requerem condições diferentes para estabilidade e funcionamento nativo. O sistema NCMN também tem protocolos diferentes em comparação com o método SMALP quando se trata de preparar as nanopartículas. Um exemplo é que os NCMNs utilizam uma purificação de coluna de afinidade de níquel de um passo único para determinação da estrutura de alta resolução; o efeito desses diferentes protocolos pode ser observado ao comparar o protocolo NCMNs, que gerou estruturas AcrB 3.2 e 3.0 Å crio-EM, com estudo semelhante utilizando o método SMALP, que resultou em uma estrutura crio-EM AcrB em uma resolução12,15. Essas características únicas do sistema NCMN são as melhorias feitas no método SMALP previamente estabelecido e o tornam um candidato ideal para o estudo de PPIs.
O transporte multidroug efflux AcrB existe como homotrimer funcional em E. coli12. Uma análise mutagênica sugeriu que uma única mutação de ponto P223G, localizada em um loop responsável pela estabilidade do aparador AcrB, desestabiliza o estado do aparador e produz um monômero AcrB quando preparado com o detergente DDM, que poderia ser detectado com eletroforese de gel azul nativo16. No entanto, a análise FRET do mutante AcrB-P223G sugeriu que quando no ambiente de bicamadas lipídicas da membrana celular nativa, a maioria dos mutantes AcrB-P223G ainda existiam como um aparador e que os níveis de expressão tanto para o tipo selvagem AcrB quanto para AcrB-P223G são semelhantes. No entanto, apesar dos resultados da análise do FRET, um ensaio de atividade para o transportador mutante mostrou que a atividade diminuiu drasticamente quando comparada com o tipo selvagem16. Embora a tecnologia FRET tenha sido popularmente utilizada para a análise de interações proteína-proteína, pesquisas têm mostrado que ela pode frequentemente dar falsos positivos17,18,19,20.
Recentemente, foram determinadas estruturas crio-EM de alta resolução do aparador AcrB que mostraram a interação da AcrB com sua bicamada lipídica de membrana celular nativa associada através do uso das NCMNs12. Em princípio, os NCMNs podem ser facilmente utilizados para a análise de interações proteína-proteína encontradas na membrana celular nativa. Em um teste deste sistema, foram realizados experimentos para observar diretamente o estado oligomerico de AcrB-P223G com o uso de nanopartículas de membrana celular nativa e microscopia eletrônica de coloração negativa. Para comparar com as nanopartículas AcrB do tipo selvagem, utilizamos a mesma membrana polímera ativa (SMA2000 fabricada em nosso laboratório, que é indexada como NCMNP1-1 na biblioteca NCMN) usada para determinação de estrutura crio-EM de alta resolução de AcrB e polímeros alternativos encontrados na biblioteca NCMNs12. Com base nos resultados relatados anteriormente, esperava-se que a maioria do mutante AcrB-P223G existisse na forma de nanopartículas de membrana celular nativa trimeric21. No entanto, não foram encontrados aparadores AcrB presentes na amostra, como os observados com o tipo selvagem AcrB. Isso sugere que a maioria do AcrB-P223G não forma aparadores na membrana celular nativa como sugerido anteriormente.
Aqui relatamos uma análise detalhada do mutante E. coli AcrB-P223G em comparação com o tipo selvagem E. coli AcrB usando as NCMNs. Este estudo de caso da AcrB sugere que as NCMNs são um bom sistema para análise de interação proteína-proteína.

<table><tbody><tr><td><forte>Produtos Químicos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% Acrilamida/BIS SOL (37.5:1)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td></td></tr><tr><td>4x Tampão de Amostra Laemmli (Tampão de Carregamento)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético Glacial</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A38S-212</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de Amônio (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Goldbio</td><td>C-105-5</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 proteína mancha em pó</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Ditiotreitol) (> 99% puro) Livre de protease</td><td>Goldbio</td><td>DTT10</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Affymetrix</td><td>17525 1 KG</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Goldbio</td><td>I2481C100</td><td></td></tr><tr><td>Canamicina</td><td>Goldbio</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AA3622636</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetiletilenodiamina (EDTA)</td><td>Merck</td><td>8.03779.0100</td><td></td></tr><tr><td>NCMNS-P5-2</td><td>Ainda não disponível comercialmente</td><td>Enviar solicitação de obtenção ao autor</td><td></td>correspondente</tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>SDS (Dodecil Sulfato de Sódio)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>SMA2000</td><td>Cray Valley</td><td>Enviar solicitação de obtenção ao autor</td><td></td> correspondente</tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Goldbio</td><td>TCEP25</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Ótimo caldo Meio</td><td>Affymetrix</td><td>75856 1 KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0719</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Uranila</td><td>Ambinter</td><td>Amb22348393</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26S XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td>B14538</td><td></td></tr><tr><td>Avanti JXN-30</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34193</td><td></td></tr><tr><td>Grades de Microscópio Eletrônico de Carbono (10 nm)</td><td>Homogeneizador</td> de Tecido Con-Torque <td>Sciences CF300--TH</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eberbach</td><td>E7265</td><td></td></tr><tr><td>Mini Microcentrífuga Corning LSE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>07-203-954</td><td></td></tr><tr>Coletor de Frações de <td>Avestina</td><td></td><td></td><td>EmulsiFlex-C3</td></tr><tr><td>F9-R</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29003875</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Célula de Eletroforese Vertical</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8004</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Espectrofotômetro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Optima L-90K</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN LL-IM-12AB</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easiGlow Sistema de Limpeza de Descarga de Brilho</td><td>Ted Pella</td><td>91000S-230</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder</td> Fonte de Alimentação <td>Básica PowerPac Wheaton</td><td>358013</td><td></td></tr> Bomba <tr><td></td><td></td> de Seringa de Velocidade Variável Razel R99-E Bio-Rad <td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Razel Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai F20 200kV</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tipo 70 Ti Rotor de ângulo fixo</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>General Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Tubos de microcentrífuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>AKTA pure 25 L1 FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29018225</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS Cells</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C606003</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Tubo de Centrífuga Cônico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP 5 Coluna de ml</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17524802</td><td></td></tr><tr><td>pET-24a</td><td>EMD Biosciences</td><td>69749-3</td><td></td></tr></tbody></table>

sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análise de interação proteína-proteína de membrana

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

As interações proteína-proteína nos sistemas de membrana celular desempenham papéis cruciais em uma ampla gama de processos biológicos, desde interações célula-célula até transdução de sinais; desde a detecção de sinais ambientais até a resposta biológica; da regulação metabólica ao controle do desenvolvimento. Informações estruturais precisas das interações proteína-proteína são cruciais para a compreensão dos mecanismos moleculares dos complexos proteicos de membrana e para o desenho de moléculas altamente específicas para modular essas proteínas. Muitas abordagens in vivo e in vitro foram desenvolvidas para a detecção e análise de interações proteína-proteína. Entre eles, a abordagem da biologia estrutural é única na prática de fornecer informações estruturais diretas de interações proteína-proteína no nível atômico. No entanto, a biologia estrutural da proteína da membrana atual ainda está em grande parte limitada a métodos à base de detergente. A principal desvantagem dos métodos à base de detergente é que eles frequentemente dissociam ou desnaturam complexos proteicos de membrana de desnatura uma vez que seu ambiente de bicamadas lipídicas nativas é removido por moléculas de detergente. Estamos desenvolvendo um sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para biologia estrutural de proteína de membrana. Aqui, demonstramos o uso desse sistema na análise de interações proteína-proteína na membrana celular com estudo de caso do estado oligomerico da AcrB.

Utilizando os procedimentos aqui apresentados, foram purificadas amostras do tipo selvagem E. coli AcrB e E. coli mutante AcrB-P223G. As amostras foram então adsorvidas a redes de microscopia eletrônica de manchas negativas de carbono e manchadas usando acetato de urano com o método de mancha lateral22. Imagens de manchas negativas foram coletadas por meio de microscopia eletrônica de transmissão. A imagem de mancha negativa para a amostra do tipo selvagem AcrB purificada com DDM...

Apresentado aqui é um protocolo para a determinação do estado oligomerico de proteínas de membrana que utiliza um sistema de nanopartículas de membrana celular nativa em conjunto com microscopia eletrônica.

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análise de interação proteína-proteína de membrana

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Este protocolo ajudará os pesquisadores a determinar com mais precisão o estado oligomérico nativo das proteínas de membrana, utilizando o sistema de nanopartículas da membrana celular nativa em conjunto com a microscopia eletrônica. A vantagem dessa técnica é que ela fornece dados estruturais precisos de proteínas de membrana em um ambiente semelhante à membrana celular nativa e pode ser utilizada para futura determinação de estrutura de alta resolução. Demonstrando o procedimento estará Kyle Kroeck, um pós-doutorando do meu laboratório.Para preparar nanopartículas de membrana celular nativa, ressuspenda um grama do pellet de membrana de interesse em 10 mililitros de tampão NCMN A. Use um homogeneizador Dounce de vidro para homogeneizar a amostra de membrana celular ressuspensa a 20 graus Celsius e transfira a amostra suspensa para um tubo de polipropileno de 50 mililitros. Adicione a solução estoque de polímero ativo de membrana e o tampão NCMN A adicional à amostra até uma concentração final de 2,5% de polímero ativo de membrana e agite a solução por duas horas a 20 graus Celsius. No final da incubação, ultracentrifugar a amostra.Durante a centrifugação, equilibre uma coluna NTA de níquel de cinco mililitros com 25 mililitros de tampão NCMN A.At final da centrifugação, transfira o sobrenadante para a coluna e use uma bomba de seringa ajustada para uma vazão de 0,5 mililitro por minuto para carregar o sobrenadante na coluna a 20 graus Celsius. Lave as linhas da máquina de cromatografia líquida de proteína rápida com tampão NCMN B suficiente para lavar completamente o sistema e conectar a coluna à máquina de cromatografia. Lave a coluna com 30 mililitros de NCMN Buffer B a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto e colete o fluxo.Lave a coluna com 30 mililitros de NCMN Buffer C a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto e colete o fluxo. Eluir a proteína com 20 mililitros de Tampão D NCMN a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitro por minuto e usar um coletor de frações para coletar frações de um mililitro da amostra, depois armazenar as amostras de proteína a quatro graus Celsius usando SDS-PAGE para verificar as amostras que correspondem aos picos observados no gráfico de eluição de cromatografia líquida de proteína rápida. Para preparar grades de manchas negativas, enrole uma lâmina de vidro com papel de filtro com o lado de carbono voltado para cima e coloque as grades que serão usadas para a preparação da amostra na lâmina.Coloque a lâmina de vidro com as grades do microscópio eletrônico na câmara de um descarregador de brilho entre os dois eletrodos e recoloque a tampa de vidro, certificando-se de que a tampa esteja centralizada e bem vedada. Ligue a máquina de descarga de brilho e certifique-se de que a luz roxa gerada pelo plasma esteja visível. Quando a máquina terminar de funcionar, espere até que a câmara atinja a pressão atmosférica antes de remover a tampa de vidro e colocar a corrediça na bancada.Ajuste a concentração das amostras de proteína purificada para cerca de 0,1 miligramas por mililitro e carregue 3,5 microlitros da amostra de proteína na grade de carbono de 10 nanômetros de espessura. Após um minuto, use um pedaço de papel de filtro para remover o líquido da superfície da grade de microscopia eletrônica e lave a superfície da grade três vezes com uma gota de três microlitros de água por lavagem. Após a última lavagem com água, lave a superfície da grade mais duas vezes com três gotículas de microlitro de acetato de urânio a 2% filtrado fresco por lavagem.Após a última lavagem com acetato de urânio, manche a grade com uma gota de três microlitros de acetato de urânio a 2% filtrado fresco por um minuto. No final da incubação, use um novo pedaço de papel de filtro para remover a gota e seque a grade ao ar por pelo menos um minuto antes de armazená-la em uma caixa de grade para uso posterior. Aqui, imagens negativas de coloração obtidas usando microscopia eletrônica de transmissão, conforme demonstrado, podem ser observadas.A imagem negativa da coloração para a amostra de proteína B do canal de resistência da acraflavina do tipo selvagem purificada com detergente revela uma solução homogênea de partículas monodispersas com a proteína exibindo uma estrutura quaternária trimérica bem definida. Essas estruturas triméricas correspondem ao cromatograma de exclusão de tamanho observado após a purificação. Em comparação, na imagem de coloração negativa para o mutante P223G também purificado com detergente, uma solução heterogênea de nanopartículas polidispersas com propensão à agregação, mas sem trímeros nativos observáveis, pode ser observada.Esses resultados também são apoiados pela cromatografia de exclusão de tamanho. Resultados semelhantes foram observados para proteínas do tipo selvagem e mutantes após purificação com o polímero ativo de membrana NCMNP11. O uso do polímero NCMNP52 facilita a geração de nanopartículas de membrana celular nativa em tamanhos muito maiores, permitindo que vários trímeros da proteína B do canal de resistência da acraflavina sejam visualizados em uma única partícula de membrana celular nativa.Na amostra mutante, no entanto, nenhuma partícula trímera é observada, mesmo quando se olha para as grandes manchas de bicamada da membrana celular nativa. A análise SDS-PAGE das amostras de proteína purificada confirma a presença de resistência B à acraflavina em todas as amostras com pureza superior a 95% no peso molecular previsto da proteína. Ao modificar este protocolo para outras proteínas, é importante determinar experimentalmente a quantidade apropriada de fração de membrana e o comprimento, tempo e temperatura para o processo de solubilização.Se as imagens de sua amostra revelarem uma solução homogênea de partículas monodispersas com unidades estruturais bem definidas, a amostra pode ser usada para determinação de estrutura de alta resolução com microscopia crioeletrônica.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Interação proteína-proteína testes é indispensável para dissecção de funcionalidade da proteína. Aqui, nós apresentamos...

Protein Assay Overlay membrana: um protocolo para testar Interação entre proteínas solúveis e insolúveis In vitro</em

A abordagem bioquímica é descrita a identificação in vivo de interacções proteína-proteína (PPI), de proteínas de membrana. O método combina a proteína de ligação cruzada, de purificação por afinidade e espectrometria de massa, e é adaptável para quase qualquer tipo de célula ou organismo. Com esta abordagem, embora a identificação de IPP transientes torna-se possível.

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