Name: Diferenciação guiada de podocitos renais maduros de células-tronco pluripotentes induzidas humanas sob condições quimicamente definidas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprenda a diferenciar podócitos renais maduros a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando meio quimicamente definido. Este protocolo de 26 dias oferece alta eficiência sem manipulação genética.

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Este trabalho foi apoiado pela Escola Pratt de Engenharia da Duke University, a Divisão de Nefrologia da Duke Medical School, um Prêmio de Pesquisa de Uma Cadeira do Departamento de Medicina da Duke University, e um Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award to S.M.. M.B foi apoiado pelo Programa de Bolsas de Pós-Graduação em Pesquisa da Fundação Nacional de Ciência. Agradecemos ao Laboratório Bursac por nos fornecer generosamente a linha de células-tronco DU11, e o Laboratório Varghese da Universidade duke por compartilhar temporariamente suas instalações de cultura de tecidos com nosso grupo. Esta publicação é dedicada à Profª Laura L. Kiessling, Novartis Professora de Química do Instituto de Tecnologia de Massachusetts, em comemoração aos seus 60anos.

1. Preparação de reagentes
<ol><li>Diluir o suplemento de mídia de cultura celular hiPS (CCM) descontou em meio basal de cultura celular hiPS para obter uma solução 1x de hiPS CCM. NOTA: O suplemento CCM de 5x congelado requer um processo de descongelamento lento, idealmente em 4 °C durante a noite. As alíquotas do CCM 1x hiPS podem ser armazenadas por até 6 meses a -20 °C.</li>
	<li>Preparação da matriz de membrana de porão (BM) placas revestidas de 1 para a cultura celular hiPS: Descongelar matriz BM 1 durante a noite no gelo a 4 °C. Uma vez descongelado, prepare alíquotas com fatores de diluição adequados, conforme sugerido pelo fabricante. NOTA: Normalmente, as alíquotas são preparadas para diluição subsequente em 25 mL de DMEM/F12 frio em um tubo cônico de 50 mL seguido de mistura completa para dissolver completamente a matriz BM 1 e evitar a formação de cristais residuais.</li>
	<li>Transfira 1 mL da solução BM matrix 1 para cada poço de uma placa de 6 poços e incubar a 37 °C por 1-2 h ou a 4 °C pelo mínimo de 24h, envolto em filme de parafina. As placas revestidas da matriz BM 1 podem ser armazenadas a 4 °C por até 2 semanas.</li>
	<li>Preparação da matriz de membrana de porão (BM) 2 - placas revestidas: Diluir quantidades apropriadas de matriz BM 2 em 9 mL destilada estéril para preparar uma concentração final de 5 μg/mL. Adicione 700 μL da solução BM matrix 2 a cada poço de uma placa de 12 poços e incubar a placa em temperatura ambiente por 2h ou durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Prepare 100 soluções de estoque μg/mL cada uma de BMP7, Activin A e VEGF da seguinte forma: reconstitua bmp7 em água destilada estéril contendo 0,1% (wt/vol) BSA e reconstituir Activin A e VEGF separadamente em PBS estéril contendo 0,1% (wt/vol) BSA. Para evitar ciclos frequentes de congelamento, prepare 100 alíquotas de μL de cada solução de estoque e armazene a -20 °C por até 6 meses.</li>
	<li>Prepare uma solução de estoque de 10 mM de Y27632 dissolvendo 10 mg de Y27632 em 3,079 mL de água destilada estéril. Alíquota de 100 μL do estoque e loja a -20 °C por até 6 meses.</li>
	<li>Dissolver 2 mg de CHIR99021 em 143,4 μL de DMSO estéril para preparar uma solução de estoque de 30 mM. Prepare 5 alíquotas de μL e armazene a -20 °C por até 1 mês (ou de acordo com a recomendação do fabricante).</li>
	<li>Dissolva 10 mg de ácido retinóicotrans em DMSO estéril de 3,33 mL. Prepare 500 alíquotas de μL e armazene a -20 °C por até 6 meses.</li>
</ol>2. Preparação de meios de comunicação culturais
<ol><li>Prepare o meio de diferenciação de mesoderm reconstituindo soluções de estoque correspondentes para uma concentração final de 100 ng/mL Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 e 1x suplemento sem soro B27 em um volume apropriado de DMEM/12 com suplemento de glutamina. NOTA: O meio de diferenciação de mesoderm deve ser recém-preparado antes das etapas de diferenciação e em um volume apropriado para a escala do experimento (normalmente, 50 mL de meio é adequado para duas placas de 12 poços).</li>
	<li>Prepare o meio de diferenciação de mesoderme intermediário, reconstituindo soluções de estoque correspondentes para uma concentração final de 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 e 1x suplemento sem soro B27 no DMEM/F12 com suplemento de glutamina. NOTA: Se necessário, o meio pode ser suplementado com penicilina-estreptomicina de 1% (vol/vol). Ajuste o volume do meio usando DMEM/F12 com suplemento de glutamina. Este meio pode ser preparado em grandes lotes; no entanto, recomenda-se armazenar em alíquotas menores (por exemplo, 45 mL em tubos cônicos de 50 mL) para evitar ciclos repetidos de congelamento. Esta mídia pode ser armazenada a -20 °C por até 3 meses e pode ser descongelada a 4 °C durante a noite antes de ser usada.</li>
	<li>Prepare o meio de indução de podocito reconstituindo-se a uma concentração final de 100 ng/mL BMP7, 100 ng/mL activin A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x suplemento sem soro B27 e 0,1 μM de ácido retinóico totalmente trans em DMEM/F12 com suplemento de glutamina. Proteger o meio da luz (por exemplo, embrulhando recipiente com papel alumínio). NOTA: Este meio pode ser preparado em lotes grandes e armazenado no escuro a -20 °C por até 3 meses. As alíquotas congeladas devem ser descongeladas durante a noite a 4 °C antes de serem usada.</li>
	<li>Prepare 25 mL de solução neutralizante de trippsina adicionando FBS inativados de calor de 10% (vol/vol) em DMEM/F12 e filtro em condições estéreis.</li>
	<li>Para manutenção pós-diferenciação dos podocitos derivados de células-tronco, prepare o Meio Completo com mídia de manutenção de podocyte adicionando o suplemento ao meio basal de acordo com as diretrizes do fabricante e armazene a 4 °C por até duas semanas.</li>
</ol>3. Cultura celular hiPS livre de alimentadores usando meio de cultura de células hiPS
<ol><li>Aspire a solução residual da matriz BM 1 das placas pré-revestidas e lave os poços 3 vezes com 1 a 2 mL de DMEM/F12 aquecidos.</li>
	<li>Aspirado passou hiPS CCM das células hiPS e enxaguar as células 3 vezes com DMEM/F12 aquecido. Adicione 1 mL de solução de descolamento de células quentes e incubar por 1 min a 37 °C para ajudar a dissociar as células. Realizar a inspeção visual das células sob um microscópio de cultura tecidual e garantir que as bordas das colônias celulares apareçam arredondadas, em seguida, aspire rapidamente a solução de descolamento celular das células (garantindo que as colônias celulares ainda estejam presas à placa, embora vagamente). Enxágue suavemente as células uma vez com DMEM/F12 para remover a solução de descolamento celular.</li>
	<li>Adicione 3 mL de hiPS CCM às células hiPS (em cada poço de uma placa de 6 poços) que foram tratadas com a solução de desapego celular. Raspe colônias usando um levantador de células, e suavemente suspensão de células pipetas para cima e para baixo para desalojar as células frouxamente aderidas. Lave bem a placa para garantir que todas as células sejam colhidas. NOTA: Recomenda-se o uso de uma pipeta de 5 mL para evitar o excesso de tesoura nas células.</li>
	<li>Transfira 0,5 mL da suspensão da célula para cada poço de uma nova placa de 6 poços revestidos de matriz BM com 1 poço contendo 2 mL de ccm hips por poço. Mova a placa na forma de figura oito para distribuir colônias de células dentro de poços e incubar a 37 °C em uma incubadora de 5 % de CO2. Atualize o meio diariamente até que as células estejam prontas para serem passagem ou usadas para o experimento de diferenciação (aproximadamente 70 % de confluência). NOTA: O tamanho ideal da colônia para a passagem de rotina de iPSCs é entre 200-500 μm em condições livres de alimentador usando hiPS CCM (sem inibidor de ROCHA). Se as células forem individualizadas durante o tratamento com enzimas ou tampões de dissociação, o hiPS CCM pode ser suplementado com inibidor de ROCHA (por exemplo, 10 μM Y27632) para melhorar a viabilidade celular.</li>
</ol>4. Diferenciação de células hiPS em células de mesoderme (dias 0-2)
<ol><li>Enquanto as culturas celulares hiPS estão em fase de crescimento exponencial (aproximadamente dentro de 4 dias de cultura após a passagem, e cerca de 70% de confluência), inspecionam visualmente a presença de células espontaneamente diferenciadas dentro e ao redor das bordas das colônias. Se necessário, assepticamente raspar áreas de diferenciação.</li>
	<li>Aspirar hiPS CCM a partir de células hiPS e enxaguar as células 3 vezes com DMEM/F12 quente. Incubar as células com 1 mL de tampão de dissociação celular livre de enzimas por 10 min a 37 °C e verificar a dissociação sob um microscópio. Devido a diferenças inerentes entre diferentes linhas de células hiPS, o tempo real de incubação para o buffer de dissociação celular deve ser determinado para uma determinada linha celular.</li>
	<li>Raspe suavemente o poço com um levantador de células para desalojar células frouxamente aderidas e transferir a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL, seguido de tubulação para cima e para baixo várias vezes para individualizar as células hiPS.<ol>
<li>Leve a suspensão celular para o volume de 15 mL com DMEM/F12 quente e centrífuga por 5 min a 290 x g em temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspire suavemente o supernasciente e resuspenque as células com DMEM/F12 quente para mais uma rodada de centrifugação para remover os componentes residuais da matriz BM 1 e tampão de dissociação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspire as células supernascidas e resuspendas em 1 mL de meio de indução de mesoderme, conforme descrito acima. Conte o número total de células usando um hemocítômetro ou contador de coulter para determinar o volume apropriado do meio de diferenciação de mesoderme necessário para alcançar uma concentração de 1 x 105 células/mL.</li>
	<li>Aspirar a solução ECM a partir da matriz BM placas revestidas de 2 e enxaguar as placas duas vezes com DMEM/F12 quente. Misture a suspensão da célula hiPS suavemente por pipetar algumas vezes. Transfira 1 mL da suspensão celular para cada poço da matriz BM de 2 placas revestidas de 2 poços e, em seguida, agite suavemente as placas para distribuir as células de forma mais uniforme.</li>
	<li>Incubar a placa a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5%. Refrescar o meio de indução de mesoderm no dia seguinte. NOTA: Após 2 dias, as células de mesoderme derivadas de células hiPS estariam prontas para indução intermediária de mesoderme.</li>
</ol>5. Diferenciação das células de mesoderme derivadas de células hiPS em mesoderme intermediário (dias 2-16)
<ol><li>No dia 2 do protocolo de diferenciação, aspirar meio de indução de mesoderm e reabastecer com 1 mL por meio de indução de mesoderm bem intermediário.</li>
	<li>Atualizar o meio todos os dias para manter um limiar preciso de fatores de crescimento e pequenas moléculas para as células metabolicamente ativas. Se houver crescimento celular substancial e rápido esgotamento dos nutrientes da mídia (indicado pelo amarelamento da mídia), o volume do meio intermediário de diferenciação de mesoderme pode ser aumentado para 1,3 mL por poço das 12 placas do poço.</li>
	<li>Células de cultura por mais 14 dias para obter células intermediárias de mesoderme. Até o dia 16, essas células podem ser criopreservadas para uso posterior.</li>
</ol>6. Diferenciação de células mesoderm intermediárias derivadas de células hiPS em podocitos (dias 16 a 21)
<ol><li>Enxágüe as células intermediárias de mesoderme com DMEM/F12 quente seguido de incubação das células com 0,5 mL por poço de 0,05 % trypsin-EDTA por 3 min a 37 °C. Faça inspeção visual para garantir que as células estejam começando a se dissociar.</li>
	<li>Raspar células usando um levantador de células e pipeta a suspensão celular várias vezes usando uma ponta de pipeta de 1.000 μL para obter células individualizadas (ou pequenas moitas de) células. NOTA: Nesta fase, certifique-se de que as células estão totalmente dissociadas, pois as células agregadas podem não adquirir um fenótipo terminalmente diferenciado dentro da linha do tempo do protocolo.</li>
	<li>Adicione cerca de 2 mL por poço de solução neutralizante de trippsina para parar a atividade de trippsina.</li>
	<li>Transfira as células para um tubo cônico de 50 mL e leve o volume até 50 mL usando DMEM/F12 e, em seguida, centrifugar a suspensão celular por 5 min a 201 x g à temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspire as células supernascidas e resuspendas no meio de indução de podocito. Para obter resultados ideais, garanta uma densidade final de semeadura de aproximadamente 100.000 células/poço de uma placa de 12 poços. Adicione a suspensão da célula à matriz BM de placas revestidas de 2 e agite suavemente a placa para ajudar a distribuir as células de forma mais uniforme.</li>
	<li>Incubar células a 37 °C e 5% de CO2 e atualizar o meio diariamente por até 5 dias para obter podocytes até o dia 21. NOTA: Os podócitos derivados de células hiPS resultantes podem ser mantidos na cultura por 2-4 semanas adicionais usando meio completo com mídia de manutenção de podocyte. Uma vez em mídia de manutenção podocyte, as células podem ser alimentadas a cada dois dias e podem ser usadas para estudos subsequentes ou análises a jusante.</li>
</ol>

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</ol>

S.M. é um autor de uma patente pendente para métodos para a geração de podocitos renais a partir de células-tronco pluripotentes (pedido de patente dos EUA 14/950859). Os demais autores declaram que não têm interesses concorrentes.

Neste relatório, descrevemos um protocolo para a geração de podocitos glomerulares renais a partir de células hiPS. Os podocitos derivados de células hiPS apresentam características morfológicas e moleculares associadas ao fenótipo de podocito renal maduro13. Em publicações anteriores, mostramos que os podocitos derivados de células hiPS podem imitar a estrutura e a função de filtragem seletiva do glomerulus renal quando co-cultivado com células endoteliais microvasculares glomerulares em um dispo...

Os avanços na cultura das células-tronco pluripotentes humanas estão prontos para revolucionar a medicina regenerativa, a modelagem de doenças e o rastreamento de medicamentos, fornecendo aos pesquisadores uma fonte renovável e escalável de material biológico que pode ser projetado para obter quase qualquer tipo de célula dentro do corpo humano1. Essa estratégia é especialmente útil para o derivado de tipos de células especializadas e funcionais que, de outra forma, seriam difíceis de obter. As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPS)células 2,3,4,5 são particularmente atraentes devido à sua origem celular somática e ao potencial que representam para a medicina personalizada. No entanto, o desenvolvimento de métodos para derivar outras linhagens celulares de células hiPS permanece desafiador devido ao uso frequente de condições culturais mal definidas que levam à baixa eficiência e geração não específica de populações de células heterogênios6,7.
Apresentado aqui é um método para a derivação de podocitos renais maduros de células hiPS com especificidade e alta eficiência em condições quimicamente definidas. Ao considerar os papéis de múltiplos fatores dentro do microambiente celular, desenvolveu-se uma estratégia de diferenciação de células-tronco que envolveu a otimização de fatores solúveis apresentados no meio da cultura celular, bem como fatores insolúveis, como componentes da matriz extracelular ou substratos adesivos. Dada a importância da sinalização integrin no desenvolvimento e função podocyte, a expressão de receptores integrin na superfície celular foi inicialmente examinada. β1 integrins foram altamente expressos não apenas em células hiPS, mas também em seus derivados, incluindo mesoderme e células intermediárias de mesoderme8,9,10. Experimentos subsequentes confirmaram que ligantes que se ligam a β1 integrinos (incluindo laminina 511 ou fragmento de laminina 511-E8) suportam a adesão e diferenciação das células hiPS em podocitos quando usados em conjunto com a mídia indutiva solúvel descrita abaixo.
A indução do compromisso de linhagem celular foi iniciada pela primeira vez confirmando que as células hiPS cultivadas nas superfícies revestidas de laminina por dois dias na presença de um meio contendo Activin A, CHIR99021 e Y27632 O inibidor de rocha pode se diferenciar em células que expressam os primeiros marcadores de mesoderme HAND1, goosecoid e brachyury8,11. O tratamento das células de mesoderme por 14 dias com um meio suplementado com proteína morfogenética óssea 7 (BMP-7) e CHIR99021 possibilitou a derivação de células intermediárias de mesoderme que expressavam os marcadores celulares nefrão-progenitor do Tumor 1 (WT1), proteína relacionada 1 (OSR1)8,11, e gene de caixa emparelhada 2 proteína (PAX2)12. Para derivar os podocitos glomerulares renais maduros, as células mesoderm intermediárias foram tratadas por 4-5 dias com um novo meio composto por BMP-7, Activin A, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), ácido retinóicototalmente trans e CHIR99021. A citometria de fluxo e a imunossuagem foram utilizadas para confirmar que >90% das células resultantes apresentavam as características moleculares, morfológicas e funcionais do podocito renal maduro8,11,13. Essas características incluem o desenvolvimento de processos de pé primário e secundário; a expressão de genes específicos de linhagem podocyte, incluindo SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 e a expressão de proteínas incluindo podocina, nefrina e WT114,15,16. Além disso, verificou-se que os podocitos derivados de células hiPS podem ser mantidos na cultura por até quatro semanas in vitro usando um meiocomercialmentedisponível 8,11 que fornece uma flexibilidade adicional no tempo de experimentos a jusante. Para obter mais informações sobre os painéis de citometria de fluxo utilizados para determinar a pureza dos hiPS-podocytes, consulte nossa publicação anterior11.

<table><tbody><tr><td>Células</td> iPS humanas Cells<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DU11</td> A linha celular iPS DU11 (clone # 11 da Duke University) foi gerada no Duke University iPSC Core Facility e fornecida a nós pelo Bursac Lab da Duke University.<td></td><td></td><td> Esta linha foi testada para micoplasma e foi cariotipada pela última vez em julho de 2019 por nosso laboratório, e considerada cariotipicamente normal.</td></tr><tr><td>Fatores de crescimento e suplementos de mídia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>All-trans retinoic acid (500 mg)</td><td>72262</td> Suplemento sem soro B27 da <td>Stem Cell Technologies</td><td></td></tr><tr><td></td><td>17504044 Thermo</td><td>/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>04-0004</td><td>Stemgent</td><td>pode mostrar variação de lote para lote</td></tr> Kit <tr><td>Completo Médio com CultureBoost-R</td><td>4Z0-500-R</td><td>Sistemas de células</td><td>Meios de manutenção de podócitos</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>12634028</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 com suplemento GlutaMAX</td><td>10565042</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>DMEM/F12 com suplemento de glutamina</td></tr><tr><td>FBS inativado por calor</td><td>10082147</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Ativo humano A</td><td>PHC9564</td><td>Thermo/Life Tecnologias</td><td></td></tr><tr><td>Human BMP7</td><td>PHC9544</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Human VEGF</td><td>PHC9394</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>05850</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>hiPS meio de cultura de células (CCM)</td></tr> <tr><td>Penicilina&ndash; estreptomicina, líquido (100 vezes;)</td><td>15140-163</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Y27632 inibidor de ROCK</td><td>1254</td><td>Tocris</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&ndash; e Alexa Fluor 594&ndash; anticorpos secundários conjugados</td><td>A32744; A32754; A-11076; A32790</td><td>Thermo / Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury (T)</td> <td>ab20680</td><td>Abcam</td><td></td></tr><tr><td>Nephrin</td><td>GP-N2</td><td>Progen</td><td></td></tr><tr><td>OCT4</td><td>AF1759</td><td>R & D Systems</td><td></td></tr><tr><td>PAX2</td><td>71-6000</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>WT1</td><td>MAB4234</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>ECM Molecules</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragmento</td><td>N-892012</td><td>Iwai North America</td><td>Matriz de membrana basal (BM) 2</td></tr><tr><td>Matriz qualificada para hESC Matrigel, frasco de 5 mL</td><td>354277</td><td>BD Biociências</td><td>Matriz da membrana basal (BM) 1. Pode apresentar variação de lote para lote</td></tr><tr><td><forte>Enzimas e outros reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>A1110501</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Solução de desprendimento celular</td></tr><tr><td>BSA</td><td>A9418</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido (DMSO)</td><td>D2438</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DMSO é tóxico. Deve ser manuseado com capuz de segurança química</td></tr><tr><td>Tampão de dissociação celular livre de enzimas, Hank' s sal balanceado</td><td>13150016</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Solução de etanol, 70% (vol/vol), grau de biotecnologia</td><td>97065-058</td><td>O etanol VWR</td><td>é inflamável e tóxico</td></tr><tr><td>FBS</td><td>431097</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>28906</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>O PFA deve ser manuseado em uma capela de exaustão química com equipamento de proteção individual adequado, incluindo luvas, jaleco e óculos de segurança. Evite a inalação e o contato com a pele.</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>14190-250</td> Água destilada estéril <td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td></td><td>15230162</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>97062-208</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA, 0,05%</td><td>25300-120</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de aspiração, embaladas individualmente</td><td>29442-462</td><td>Centrífuga Corning</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-15R</td><td>B99516</td> Tubo de centrífuga cônico <td>Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>, 15 mL</td><td>352097</td><td>Tubo</td> de centrífuga cônico Corning<td></td></tr><tr><td>, 50 mL</td><td>352098</td><td>Caixas</td> criogênicas Corning <td></td></tr><tr><td></td><td>3395465</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Para armazenamento congelado alíquotas</td></tr><tr><td>EVOS M7000</td><td>AMF7000</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Microscópio fluorescente utilizado para adquirir imagens de células iPS fixas e coradas e seus derivados</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>100503-092</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i Incubadora de CO2</td><td>51030403</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Para a cultura e manutenção de rotina de células iPS e seus derivados</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer invertido equipado com câmera AxioCam 503</td><td>491916-0001-000(microscópio) ; 426558-0000-000(câmera)</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>Usado para adquirir imagens de contraste de fase de células iPS vivas e seus derivados em cada estágio de diferenciação de podócitos</td></tr><tr><td>Luvas de nitrilo Kimberly-Clark</td><td>40101-346</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes, grande</td><td>21905-049</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes, pequeno</td><td>21905-026</td><td>Ponteiras</td> de pipeta de barreira de precisão VWR <td></td></tr><tr><td>P10</td><td>P1096-FR</td> Ponteiras de pipeta de barreira <td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>P100 Ponteiras de pipeta de barreira</td><td>P1125</td> Ponteiras de pipeta de barreira <td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Ponteiras</td> de pipeta de barreira <td>P1126</td><td>Ponteiras</td> de pipeta de barreira Denville Scientific <td></td></tr><tr><td>P200</td><td>P1121</td><td>Ponteiras</td> de pipeta de barreira Denville Scientific <td></td></tr><tr><td>P200</td><td>P1122</td> Pipeta sorológica <td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>, 10 mL, embalada individualmente</td><td>356551</td><td>Pipeta</td> sorológica Corning<td></td></tr><tr><td>, 25 mL, embalada individualmente</td><td>356525</td><td>Pipeta</td> sorológica Corning<td></td></tr><tr><td>, 5 mL, embalada individualmente</td><td>356543</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip, 0,22 &mu; m, PES</td><td>SCGP00525</td><td>EMD Tubos</td> de Microcentrífuga Estéril Millipore <td></td></tr><tr><td></td><td>1138W14</td><td>Thomas Scientific</td><td>Para aliquoting fatores de crescimento</td></tr><tr><td>Cultura de tecidos&ndash; placas tratadas de 12 poços</td><td>353043</td><td>cultura de tecidos Corning</td><td></td></tr><tr><td>&ndash; placas de seis poços tratadas</td><td>353046</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>VWR jaleco branco techuni</td><td>10141-342</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Elevador de células de bisel largo</td><td>3008</td><td>Corning</td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciação guiada de podocitos renais maduros de células-tronco pluripotentes induzidas humanas sob condições quimicamente definidas

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

A doença renal afeta mais de 10% da população global e custa bilhões de dólares em gastos federais. As formas mais graves de doença renal e eventual insuficiência renal em estágio terminal são frequentemente causadas pelo dano aos podocitos glomerulares, que são as células epiteliais altamente especializadas que funcionam junto com células endoteliais e a membrana do porão glomerular para formar a barreira de filtragem do rim. Os avanços na medicina renal têm sido dificultados pela limitada disponibilidade de tecidos primários e pela falta de métodos robustos para a derivação de células renais humanas funcionais, como os podocitos. A capacidade de derivar podocitos de fontes renováveis, como células-tronco, poderia ajudar a avançar a compreensão atual dos mecanismos de desenvolvimento renal humano e doenças, bem como fornecer novas ferramentas para a descoberta terapêutica. O objetivo deste protocolo foi desenvolver um método para derivar podocitos maduros e pós-mitóticos de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPS) com alta eficiência e especificidade, e sob condições quimicamente definidas. Os podócitos derivados de células hiPS produzidos por este método expressam marcadores específicos de linhagem (incluindo nefrina, podocina e tumor 1 de Wilm) e exibem as características morfológicas especializadas (incluindo processos de pé primário e secundário) associadas a podocitos maduros e funcionais. Curiosamente, essas características especializadas estão notavelmente ausentes na linha celular podocito imortalizada amplamente utilizada no campo, o que sugere que o protocolo descrito aqui produz podocitos renais humanos que têm um fenótipo de desenvolvimento mais maduro do que as linhas celulares podocyte existentes normalmente usadas para estudar biologia renal humana.

O objetivo deste protocolo foi demonstrar que podocitos humanos maduros podem ser derivados de células hiPS em condições quimicamente definidas. Os dados apresentados neste manuscrito foram gerados por meio da linha de células DU11 hiPS17, que foram testadas pela primeira vez, e constataram estar livres de mycoplasma. A análise cromossômica também foi realizada, e as células foram encontradas karyotipicamente normais. Começando com as células hiPS DU11 indiferenciadas, a estratégia de diferenciaçã...

Apresentado aqui é um protocolo quimicamente definido para a derivação de podocitos renais humanos de células-tronco pluripotentes induzidas com alta eficiência (>90%) e independente de manipulações genéticas ou seleção de subpopulação. Este protocolo produz o tipo de célula desejada dentro de 26 dias e pode ser útil para testes de nefrocoxicidade e modelagem de doenças.

Diferenciação guiada de podocitos renais maduros de células-tronco pluripotentes induzidas humanas sob condições quimicamente definidas

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Os protocolos para a diferenciação de células-tronco em células renais funcionais permanecem indefinidos. Esse método produz podócitos maduros com especificidade e eficiência, fornecendo novas ferramentas para o estudo dos mecanismos da doença renal. Este método emprega meio de cultura celular e proteínas da matriz extracelular com uma composição quimicamente definida para produzir podócitos derivados de células iPS humanas com alta pureza sem usar seleção de subpopulação ou manipulação genética.Existem opções terapêuticas limitadas para pacientes com doença renal. Este método tem implicações para a modelagem e compreensão dos mecanismos da doença, o que pode facilitar o desenvolvimento de novos biomarcadores e terapêuticas. Para configurar uma cultura de iPSC humana sem alimentador, aspire a solução residual da matriz de membrana basal 1 de placas pré-revestidas e lave os poços três vezes com um a dois mililitros por poço de meio basal aquecido.Aspirar o meio de cultura celular gasto de uma cultura de iPSC humana e lavar as células três vezes com meio aquecido. Adicione um mililitro de solução de descolamento de células quentes a cada poço para uma incubação de um minuto a 37 graus Celsius. Depois de confirmar as bordas arredondadas da colônia de células sob um microscópio de cultura de tecidos, aspire rapidamente a solução de descolamento de células e enxágue suavemente as células com meio de cultura de células.Adicione três mililitros de meio de cultura iPSC humano às células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e use um levantador de células para raspar as colônias. Pipete suavemente a suspensão celular para desalojar quaisquer células frouxamente aderidas e lave bem a placa para garantir a colheita de todas as células. Transfira 500 microlitros de células para cada poço de uma nova matriz de membrana basal 1 placa de seis poços revestida contendo dois mililitros de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos por poço e mova a placa em forma de oito para distribuir uniformemente as colônias de células dentro dos poços.Coloque a placa na incubadora de cultura de células, atualizando o meio diariamente até que as células atinjam aproximadamente 70% de confluência. Se necessário, raspe assepticamente as áreas de diferenciação antes de aspirar o sobrenadante dos poços. Depois de lavar os poços três vezes, dissociar as células conforme demonstrado e puxar as suspensões celulares resultantes em um tubo cônico de 15 mililitros.Depois de misturar por pipetagem, elevar o volume final no tubo para 15 mililitros com meio quente e recolher as células por centrifugação. Ressuspenda o pellet em meio fresco para uma segunda centrifugação e ressuspenda as células em um mililitro de meio de indução do mesoderma para contagem. Após a contagem, ressuspenda as células a uma vez 10 elevado à quinta célula por mililitro de concentração do meio de indução do mesoderma e aspire a solução de matriz extracelular das placas revestidas com matriz de membrana basal 2.Enxágue as placas duas vezes com meio quente e misture a suspensão de células-tronco pluripotentes induzida pelo homem com pipetagem suave. Adicione um mililitro de células a cada poço da matriz da membrana basal 2 placas de 12 poços revestidas e agite suavemente as placas para distribuir as células de maneira mais uniforme. Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura de células.Nos dias 2-15 da diferenciação, substitua o meio de indução do mesoderma por um mililitro de meio de indução intermediário do mesoderma por alvéolo. Se for observado um crescimento celular substancial e uma rápida depleção de nutrientes, conforme indicado pelo amarelecimento do meio, o volume do meio intermediário de diferenciação do mesoderma pode ser aumentado para 1,3 mililitros por poço. No dia 16 de cultura, enxágue as células intermediárias do mesoderma com meio quente e incube as células com 500 microlitros de 0,05% de tripsina EDTA por poço por três minutos a 37 graus Celsius.Quando as células começarem a se dissociar, raspe as células com um levantador de células e misture suavemente as células pipetando. Pare a reação com cerca de dois mililitros de solução neutralizante de tripsina por poço e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros. Aumente o volume para 50 mililitros com meio e colete as células por centrifugação.Ressuspenda o pellet em meio de indução de podócitos em uma vez 10 elevado a quintas células por mililitro de concentração média e adicione as células às placas revestidas com matriz de membrana basal 2. Em seguida, agite suavemente a placa para ajudar a distribuir as células de maneira mais uniforme e coloque-as na incubadora por até cinco dias. Usando a estratégia de cultura demonstrada, as células-tronco podem ser primeiro diferenciadas em células do mesoderma que expressam Brachyury, seguidas pela diferenciação em células intermediárias do mesoderma positivas para PAX2 e, eventualmente, podócitos glomerulares renais maduros.Os podócitos derivados de células-tronco são positivos para WT1, bem como para o marcador de identificação de linhagem nefrina. Curiosamente, a localização subcelular da nefrina é predominantemente dentro dos processos do pé do podócito e do citoplasma celular, consistente com um fenótipo de podócito maduro. Células semeadas em densidades que excedem significativamente a densidade recomendada de uma vez 10 elevado a quinto células por poço de uma placa de 12 poços resultam em grandes aglomerados de células que não possuem o fenótipo morfológico esperado de podócitos maduros dentro do cronograma padrão do protocolo.A semeadura nas densidades recomendadas neste protocolo, no entanto, resulta em culturas de células com a morfologia desejada. Recomendamos o uso da proteína da membrana basal apropriada para o descolamento celular e a manutenção da densidade de semeadura celular correta para a indução do mesoderma e do podócito. Este método de diferenciação de podócitos pode ser integrado a sistemas microfluídicos de órgãos em chips ou tecnologias de bioimpressão 3D para desenvolver modelos funcionais do rim humano para triagem de drogas e testes de nefrotoxicidade.A falta de modelos apropriados de cultura celular impediu o progresso na compreensão dos mecanismos da doença renal. Este protocolo fornece aos pesquisadores uma fonte inesgotável de podócitos derivados de pacientes para modelagem de doenças.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste vídeo, descrevemos o protocolo para derivar podócitos renais humanos de células-tronco pluripotentes induzidas por meio da diferenciação celular sob condições químicas definidas. Os podócitos gerados podem ser usados para testes de nefrotoxicidade e modelagem de doenças.

Derivação de podócitos renais humanos de células-tronco pluripotentes induzidas: um procedimento para diferenciação direcionada de podócitos renais maduros de células-tronco

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Um método simplificado para gerar organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Apresentamos aqui um protocolo para projetar um sistema personalizado de organ-on-a-chip que recapitula a estrutura e a função da barreira de filtração glomerular renal, integrando células endoteliais epiteliais e vasculares geneticamente combinadas diferenciadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Este sistema de bioengenharia pode avançar a medicina de precisão renal e aplicações relacionadas.

Chip de glomérulo renal isogênico projetado a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Este manuscrito descreve um protocolo de duas etapas para gerar podócitos específicos do paciente a partir de fibroblastos dérmicos via reprogramação epissomal em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) e subsequente diferenciação em podócitos.

Geração de Podócitos Derivados do Paciente a partir de Biópsias de Pele

Este protocolo apresenta um método abrangente e eficiente para a produção de organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) utilizando condições de cultura em suspensão. A ênfase primária deste estudo reside na determinação da densidade celular inicial e da concentração do agonista WNT, beneficiando assim os investigadores interessados na pesquisa de organoides renais.

Geração de Organoides Renais em Suspensão a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas

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Microcápsulas de alginato como uma plataforma 3D para Propagação e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias (hESC) para diferentes linhagens

Este protocolo descreve o desenvolvimento, a expansão, e in vivo de imagens de células NK derivadas de hESCs e iPSCs.

Desenvolvimento, expansão e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)

Progenitores miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) são candidatos promissores para estratégias de terapia celular para tratar distrofias musculares. Este protocolo descreve transplantes e medidas funcionais necessárias para avaliar o enenxerto e diferenciação dos mesoangioblastos derivados do iPSC (um tipo de progenitores musculares) em modelos de camundongos de regeneração muscular aguda e crônica.

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Aprenda a diferenciar podócitos renais maduros a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando meio quimicamente definido. Este protocolo de 26 dias oferece alta eficiência sem manipulação genética.

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Diferenciação guiada de podocitos renais maduros de células-tronco pluripotentes induzidas humanas sob condições quimicamente definidas

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