Modelagem de Tumores Ósseos Primários e Metástases Ósseas com Implante de Enxerto Sólido de Tumor em Osso

Este estudo permite flexibilidade na criação de tumores ósseos primários ou metástases ósseas, colocando enxertos de tumores sólidos no osso. Esta técnica é um afastamento da injeção de suspensões de células tumorais no osso. Este método supera a limitação de injeções de células tumorais em suspensão de êmbolos pulmonares.

Outra vantagem é criar um modelo mais uniforme quando comparado à metástase óssea espontânea ou após injeção intravascular de células. Com base no implante de enxerto de tumor sólido, existem possibilidades além dos modelos humanos ou de camundongos, mas o uso de xenoenxertos derivados de pacientes que podem levar a terapias adaptadas a pacientes específicos. O foco principal é o uso em pesquisas sobre câncer, como microambiente tumoral, metástase, descoberta de medicamentos, genética do câncer e medicina de precisão.

A demonstração visual é fundamental para mostrar as principais etapas da criação do tumor subcutâneo, dissecção e criação do enxerto tumoral e implantação cirúrgica na tíbia. Para indução de tumor subcutâneo, colha a linha celular de interesse usando uma solução de dissociação celular apropriada e ressuspenda as células em uma concentração estéril de PBS de uma a duas vezes 10 a quinta células para 100 a 150 microlitros. Coloque as células no gelo.

Limpe a pele exposta com etanol a 70% e carregue as células em uma seringa de tuberculina equipada com uma agulha de calibre 27. Em seguida, injete a célula por via subcutânea em uma região da pele desinfetada que não será afetada pelo movimento das omoplatas. Use um paquímetro para monitorar o tamanho do tumor subcutâneo que recobre o tórax dorsal ou abdômen e meça o peso corporal do animal semanalmente para garantir que o tumor não ulcere ou que o camundongo não atenda aos critérios de remoção precoce, conforme estabelecido pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.

Quando o tumor atingir 15 milímetros em qualquer dimensão, use etanol 70% para esterilizar a pele e use um bisturi 15 para incisar a pele que cobre o tumor. Use uma tesoura cirúrgica estéril para dissecar o tumor dos tecidos moles adjacentes e coloque o tumor em um poço de uma placa de seis poços contendo meio de crescimento completo. Use o bisturi para picar o tumor em fragmentos de tamanho apropriado e coloque os fragmentos em um novo recipiente de meio de crescimento completo estéril em temperatura ambiente.

Para criopreservação, agrupe vários fragmentos em um único criovial em meio de crescimento completo suplementado com 20% de soro bovino fetal e 10% de dimetilsulfóxido e use um sistema de criopreservação comercial a menos 80 graus Celsius para congelar gradualmente o tecido antes do armazenamento a longo prazo em nitrogênio líquido. Para preservar os fragmentos tumorais para análise subsequente, mas não para implantação futura, congele as amostras por imersão em nitrogênio líquido e armazene os fragmentos tumorais congelados a longo prazo a 80 graus Celsius negativos. Para implantação de fragmentos tumorais subcutâneos, primeiro leve a suspensão dos fragmentos tumorais à temperatura ambiente.

Em seguida, confirme a falta de resposta ao reflexo pedal em um camundongo receptor anestesiado e administre analgesia por via subcutânea. Para minimizar o trauma potencial na pele, use creme depilante para remover os pelos na articulação do joelho direito e na tíbia proximal do membro posterior conectado. Esfregue a pele exposta com etanol a 70%, seguido de clorexidina e esfoliantes salinos.

Ao flexionar e estender a articulação, visualize a tíbia proximal como a região distal à articulação do joelho e use uma lâmina de bisturi de 15 para criar uma incisão de três a quatro milímetros no nível da tíbia proximal no aspecto medial do membro através da pele e tecido subcutâneo para expor o córtex medial da tíbia proximal. Para criar um pequeno orifício no córtex medial da tíbia proximal, use a ponta de uma agulha de calibre 25 para aplicar uma leve pressão enquanto gira a ponta aproximadamente dois milímetros distal à articulação do joelho e equidistante entre os córtex tibial cranial e caudal. Quando o orifício for criado, use uma pinça estéril ou uma agulha de calibre 27 a 30 para inserir um mínimo de fragmentos tumorais de 0,5 milímetro cúbico na cavidade medular da tíbia proximal e use uma agulha de calibre 27 a 30 para manipular os fragmentos tumorais no canal medular.

Após a colocação de todos os fragmentos, opor-se as bordas da pele com o material apropriado e retornar o animal à sua gaiola com monitorização até a deambulação. Em seguida, avalie o crescimento do tumor tibial de forma não invasiva por radiografia digital semanal, bioluminescência ou imagem de fluorescência e use paquímetros para medir o membro no local do implante. O enxerto bem-sucedido pode ser documentado com imagens avançadas.

Nesta análise representativa, o defeito cortical criado para o implante do enxerto tumoral foi visível na tíbia proximal uma semana após o implante. Na segunda semana, osteólise visível e remodelação óssea adjacente ao defeito cortical puderam ser observadas. Da segunda à quinta semana, ocorreu destruição óssea progressiva adicional e a formação de novo osso associada ao enxerto e crescimento do tumor.

Deve-se ter cuidado ao criar um pequeno orifício na tíbia proximal. Confie em girar a ponta com pressão suave a mínima, permitindo que a ponta da agulha faça o trabalho. Após este procedimento, a colocação de enxerto tumoral em outros locais ósseos, a colocação de organoides ou células tumorais na matriz extracelular no defeito ósseo ou análise molecular e histológica, além da imagem, podem ser realizadas.