Name: Automação de Medições de Microscópio de Força Bio-Atômica em centenas de células de C. albicans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprenda a automatizar medições de microscopia de força atômica em centenas de células de Candida albicans usando selos de PDMS. Este método aumenta significativamente a produtividade para estudos de biomecânica microbiana.

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Queremos reconhecer o FONCYCYT da CONACYT (México), o Ministério das Relações Exteriores da França e a Université Paris 13, embora o apoio financeiro do projeto internacional colaborativo ECOS-NORD chamado Nano-palpaation for diagnosis, No. 263337 (México) e MI5P02 (França). A AMR agradece o apoio financeiro da SIP-IPN através do projeto nº 20195489. O SPC é apoiado por uma bolsa de doutorado da CONACYT (No. 288029) e da IPN através do acordo cotutelle para obter certificado de doutorado duplo (IPN-UPS). Ed e CFD são pesquisadores do Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).

1. Cultura celular microbiana
<ol><li>Reviva células de um estoque de glicerol. NOTA: Os albicanos C. são armazenados a -80 °C em estoques de glicerol, em mármores.<ol>
<li>Escolha uma bola de gude no caldo -80 °C e esfregue-o no ágar peptone dextrose (YPD) de levedura. Cresça as células por 2 dias a 30 °C, antes do cultivo líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare culturas líquidas.<ol>
<li>Encha um tubo de cultura com 5 mL de caldo YPD estéril e adicione uma única colônia de células C. albicans, cultivadas na placa de ágar YPD.</li>
		<li>Cresça a cultura em condições estáticas a 30 °C por 20 h antes de colher por centrifugação (4000 x g, 5 min). Descarte o supernatante e elimine como resíduos de risco biológico.</li>
		<li>Lave as pelotas 2x com 10 mL de tampão de acetato (acetato de sódio de 8 mM, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, pH 5.2). Centrífuga (4000 x g, 5 min) entre as lavagens.</li>
		<li>Resuspenda a pelota em 2 mL de tampão de acetato e use esta solução para imobilização celular no selo PDMS. NOTA: Esta suspensão não pode ser armazenada e deve ser preparada fresca para a seção 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação do selo PDMS
<ol><li>Preparação do molde mestre do silício<ol>
<li>Desenhe as microestruturas desejadas usando o software CAD (Computer Assisted Design, design assistido por computador). NOTA: Os poços projetados devem ter tamanho semelhante ao micróbio a prender. O design deve fornecer uma grande matriz de poços 100 x 100 na lista. É melhor fazer várias matrizes com tamanhos ligeiramente diferentes em torno do tamanho médio do micróbio.</li>
		<li>Se houver uma sala limpa, siga as etapas 2 a 12 do protocolo12publicado anteriormente . Caso contrário, o molde mestre de silício pode ser adquirido a partir de instalações comerciais de sala limpa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Moldagem de selo PDMS<ol>
<li>Prepare 55 g de solução prepolímero PDMS contendo uma mistura de 10 a 1, proporção de massa, de oligômeros PDMS e agente de cura(Tabela de Materiais).</li>
		<li>Misture e desgase esta solução sob vácuo (na faixa de 10-1-10-2 barras) até que todas as bolhas presas sejam removidas da solução PDMS (5-10 min).</li>
		<li>Despeje 20 g da solução desgaseada no molde mestre de silício e degas novamente (na faixa de 10-1-10-2 barras). NOTA: A espessura do selo deve ser em torno de 2-3 mm.</li>
		<li>Quando todas as bolhas forem removidas, reticule o PDMS a 80 °C durante 1 h.</li>
		<li>Corte o selo microestruturado PDMS com um bisturi (0,5 x 1,5 cm2) em direção paralela às matrizes de microestrutura visível.</li>
		<li>Descasque o carimbo do molde mestre de silício.</li>
		<li>Devolva o selo para exibir as microestruturas em sua parte superior e deposite-o em um escorregador de vidro. Certifique-se de ter as microestruturas voltadas para longe da lâmina de vidro. Alinhe as microestruturas que podem ser vistas no selo com a lateral do escorregador de vidro, que mais tarde servirá de referência para o procedimento de automação AFM. NOTA: Nesta fase, o selo PDMS está pronto para imobilização celular. Os selos PDMS podem ser armazenados no molde mestre de silício por vários meses. Quando todo o PDMS é removido do molde mestre, um novo selo PDMS pode ser lançado novamente no molde mestre (para manter o molde mestre seguro, é possível replicá-lo em poliuretano)14.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparação da amostra
<ol><li>Imobilização celular<ol>
<li>Centrífuga (500 x g, 5 min) 600 μL da solução celular resuspended para separar o buffer das células.</li>
		<li>Pipet 200 μL do supernaspeuta do passo 3.1.1 para o selo PDMS, e degas sob vácuo (na faixa de 10-1-10-2 barras) por cerca de 40 min. NOTA: Este passo é importante para melhorar a imobilização celular dentro dos poços. Moléculas da parede celular de levedura, presentes no supernasce, provavelmente são depositadas na superfície do PDMS durante este passo pré-molhada. Essas moléculas, provavelmente, aumentam a adesão das células e contribuem para o aumento da taxa de enchimento do selo.</li>
		<li>Após 40 min, com uma pipeta, remova o tampão da superfície do PDMS e deposite, com uma pipeta, 200 μL da solução celular da etapa 1.2.4 para 15 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Coloque as células nas microestruturas do selo por meio de montagem convectiva/capilar. Para isso, espalhe manualmente 200 μL de suspensão de células através do selo usando um slide de vidro em ambas as direções com um ângulo entre 30 e 50°. Pode ser necessário passar o slide de vidro várias vezes no selo para obter uma alta taxa de enchimento. NOTA: A descrição completa deste método está disponível13.</li>
		<li>Remova a suspensão da célula com uma pipeta. Lave o carimbo 3x com 1 mL de tampão de acetato, pH 5.2 para remover as células que não estavam presas.</li>
		<li>Seque a parte de trás do selo usando o fluxo de nitrogênio, a fim de garantir que o carimbo adere à placa de Petri seca.</li>
		<li>Por fim, deposite o selo PDMS cheio de células em uma placa de Petri(Tabela de Materiais) e preencha-o com 2 mL de tampão de acetato para manter as células em meio líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definindo o carimbo no estágio AFM<ol>
<li>Centro do palco em 0:0 quando iniciar as operações AFM.</li>
		<li>Calibrar a sensibilidade e a constante de mola do cantilever no vidro e na água, conforme descrito em Unsay et al.15
</li>
		<li>Pegue a placa de Petri com o carimbo e coloque-a no porta-pratos AFM Petri.</li>
		<li>Alinhe a borda do selo perpendicular ao eixo Y do suporte da placa de Petri. NOTA: Um ângulo de inclinação aceitável está abaixo de 5° como ilustrado na Figura 1.</li>
		<li>Coloque a cabeça AFM sobre o palco e tenha cuidado para que os motores do estepe estejam suficientemente estendidos para evitar que a ponta caia no carimbo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Executando o programa AFM
NOTA: O programa AFM é fornecido como material suplementar (AutomatipSoftware2019.pdf). Ele requer um JPK-Bruker AFM Nanowizard II ou III equipado com um estágio motorizado e software de desktop JPK versão 4.3. O programa foi desenvolvido sob Jython (versão baseada em python 2.7)
<ol><li>Aquisição de dados<ol><li>Centralizar a ponta AFM em cima do canto esquerdo dos poços de 4,5 x 4,5 μm2 (correspondente ao tamanho da célula) usando o microscópio óptico AFM. Se for necessário outro tamanho de poço, centralizará no canto superior esquerdo dos poços desejados.</li>
		<li>Realize um mapa de força de 64 x 64 (faixa Z = 4 μm, velocidade de ponta = 90 μm·s-1, força aplicada de 3 a 5 nN) sobre uma área de 100 x 100 μm². Selecione o modo de mapeamento de força na caixa de drop-down do modo de medição. No painel de mapeamento de controle de força inserindo os seguintes parâmetros: Rel. Setpoint = 3 a 5 nN; z comprimento 4 μm; Movimento Z: duração constante; tempo de extensão: 0.01s; ramal. atraso:0; Atraso do Retr: 0, Modo de atraso: Força Constante, Taxa de Amostra de 2048 Hz; Z loop fechado sem verificação; Grade: verifique imagem quadrada, Rápido 100 μm, lento: 100μm, X offset: 0 μm; Y offset: 0 μm; ângulo da grade: 0 grau; Pixels: 64x64; proporção de pixels: 1:1 NOTA: Um resultado típico é mostrado na Figura 2. Esta imagem ajudará a medir e verificar o arremesso entre dois poços.</li>
		<li>Observe as coordenadas do centro do poço superior esquerdo (W1) e do fundo esquerdo bem (referido como W2 na Figura 2). Para isso, faça uma caixa quadrada ao redor do poço. A coordenada do centro da caixa aparece no painel esquerdo do software AFM em caixas de coordenadas x,y.</li>
		<li>Para abrir o software de automação (Automatip_scan.py): no software de desktop JPK clique com antecedência no menu da barra superior e selecione abrir o script. Na janela que abre selecione o caminho para o arquivo de script fornecido em Dados Complementares (Automatip_scan.py).</li>
		<li>Implementar valores de coordenadas W1 e W2 na seção Caixa de Entradas do script Jython(Figura 3). Insira as coordenadas W1 na linha variável P1 239 do script e as coordenadas W2 na linha variável P2 241. NOTA: Os poços selecionados como coordenadas iniciais (W1 e W2) não devem estar muito próximos da borda da área de digitalização. Caso contrário, o algoritmo de centralação não seria executado corretamente porque precisa medir a altura na superfície PDMS em cada lado do poço. Por exemplo, veja a Figura 4.</li>
		<li>Atribua o valor do pitch à linha variável de tom 245 do script.</li>
		<li>Insira a dimensão do poço na linha variável Ws 248. Isso é conhecido pelo design dos padrões do poço e pode ser verificado na mesma imagem usada para verificar o tom (Figura 2).</li>
		<li>Escreva o caminho para o diretório de salvamento na linha 251 para salvar os dados no local desejado.</li>
		<li>Defina a linha variável totalArea 254 para o desejo múltiplo "n" de 100 μm (que é a área máxima de varredura do AFM usado). O número total de poços que serão sondados pode ser calculado usando este valor e o campo: área máxima de varredura/pitch*n2. NOTA: No exemplo da Figura 3,serão analisadas 9 áreas de 100 x 100 μm2.</li>
		<li>Defina a matriz de curvas de força, linha e coluna (3, 3 ou 4, 4), registrada por poço na linha variável numScans 257. NOTA: No exemplo da Figura 3,uma matriz de 3 x 3 = 9 FCs será registrada para cada poço.</li>
		<li>Executar o programa. Clique no botão Iniciar. NOTA: O programa primeiro executa automaticamente um algoritmo de centralização para determinar melhor o centro dos poços W1 e W2 (passo 1). Em seguida, adquire automaticamente a matriz Force Curves (FCs) em cada poço da primeira área de digitalização (passo 2). Quando todos os poços dessa área são sondados, o script move automaticamente a ponta AFM para o primeiro poço da próxima área de digitalização. A ponta é retraída, o estágio do microscópio se move para a próxima área, a ponta é novamente abordada no carimbo e o algoritmo de centralização é executado novamente para reincêncer automaticamente no primeiro poço (1') dessa área (passo 3). A primeira área é definida pelo usuário, a segunda, está à direita etc. até que n seja atingida. n+1 área está abaixo n, n+2 à esquerda de n+1, etc. até que 2n seja atingido. 2n+1 está abaixo de 2n, e 2n+2 está à direita em 2n, etc. Globalmente, a ponta serpentina atravessa a área total. Os passos 2 e 3 são repetidos automaticamente até que o número total "n2" das áreas de varredura tenham sido sondados. A Figura 5 apresenta o fluxograma do programa. Leva ~4h para completar o programa.</li>
	</ol></li>
	<li>análise de dados<ol>
<li>Execute o script python "Copiar arquivos"(Copy_files_L.py, fornecido em Dados Complementares) para organizar os arquivos FCs em uma pasta. Este script foi desenvolvido com Python 2.7 e o módulo SciPy. Use o software Visual Studio Code para abrir o script python. Caminho de entrada para a pasta geral (linha 67 do script fornecido em dados complementares) e onde será armazenado (linha 73).</li>
		<li>Abra o software de processamento de dados do fabricante AFM para analisar as curvas de força. No menu superior Arquivo,selecione abrir 'lote de curvas de espectroscopia.</li>
		<li>Na janela de processamento em lote, selecione o processo fornecido em Dados Suplementares (RigidezProcess.jpk-proc-force). Selecione a última etapa do processo e clique em Manter e Aplicar a Todos. Todas as curvas de força receberão o mesmo tratamento. NOTA: O processo usa a calibração dos arquivos FCs para converter as curvas de deflexão em curvas de força calibradas em Newton; um algoritmo de alisamento de dados é aplicado (média de 3 pontos consecutivos); a linha de base é traduzida para descansar no eixo zero; o ponto de contato é extrapolado e o FC é deslocado para colocar o ponto de contato na coordenada (0,0); a dobra do cantilever é subtraída para os FCs, a inclinação de retração é montada. No final do tratamento de dados, o software gera um arquivo que contém uma tabela dando para cada FCs: seu nome, Young Modulus, ponto de contato, força de adesão, encostas, etc.</li>
		<li>Repita os passos 4.2.1 a 4.2.3 para todos os experimentos. Tenha cuidado para salvar os dados em diferentes pastas (ou seja: "...\TRATADO\" e "...\NÃO TRATADO\")</li>
		<li>Use o script R fornecido em Dados Suplementares para traçar histogramas e enredos de caixa e realizar tratamentos estatísticos ANOVA.<ol>
<li>Para abrir o script R (DataAnalisys.R),use o software de estúdio R e carregue os arquivos contendo as informações extraídas com o software de processamento de dados (.tsv).</li>
			<li>Na janela do ambiente use o botão Importação Dataset, a partir da lista exibida selecionar a partir de texto (leiador) e na nova janela selecione o botão Navegador e encontre o arquivo .tsv.</li>
			<li>Uma vez que o arquivo tenha carregado, selecione as colunas (rigidez e adesão) a serem incluídas para a análise. Para executar todo o código, pressione Ctrl+Alt+R. NOTA: O script funciona com 4 conjuntos de dados, considere dois experimentos com células não tratadas e tratadas. É possível executar blocos do script e ver como as variáveis mudam de acordo com as funções executadas.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).</li>
<li>Dague, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+and+electron+microscopic-based+study+of+sarcolemmal+surface+of+living+cardiomyocytes+unveils+unexpected+mitochondrial+shift+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).</li>
<li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li>
<li>Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+to+Explore+Electroporation+Effects+on+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Electroporation%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells.</a> Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).</li>
<li>Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+recognition+force+spectroscopy+of+transmembrane+transporters+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells.</a> Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).</li>
<li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+analysis+of+the+effects+of+antibiotics+and+CX1+on+a+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug-resistant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain.</a> Scientific Reports. 2, (2012).</li>
<li>Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, É <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+and+pharmacology%3A+From+microbiology+to+cancerology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).</li>
<li>Wu, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+to+assess+cell+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods to assess cell mechanical properties.</a> Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).</li>
<li>Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+Mechanical+Mapping+of+Micropatterned+Cells+Shows+Adhesion+Geometry-Dependent+Mechanical+Response+on+Local+and+Global+Scales%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales.</a> ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).</li>
<li>Favre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+AFM+imaging+and+force+spectroscopy+using+two-dimensional+probe+arrays+for+applications+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology.</a> Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).</li>
<li>Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+multi-sample+acquisition+and+analysis+using+atomic+force+microscopy+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications.</a> PLOS ONE. 14 (3), 0213853(2019).</li>
<li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+living+cell+arrays+for+atomic+force+microscopy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies.</a> Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).</li>
<li>Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+paradigm+of+nanomechanical+measurements+on+cells+using+AFM%3A+an+automated+methodology+to+rapidly+analyse+thousands+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Horizons%22%5BJournal%5D)">Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells.</a> Nanoscale Horizons. , (2019).</li>
<li>Foncy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+polyurethane+and+epoxy+resist+master+mold+for+nanoscale+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Microelectronic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography.</a> Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).</li>
<li>Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+Imaging+and+Force+Spectroscopy+of+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52867(2015).</li>
<li>Schiavone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+chemical+and+enzymatic+method+to+determine+quantitatively+the+polysaccharide+components+in+the+cell+wall+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts.</a> FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).</li>
<li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+Effects+of+Caspofungin+against+Two+Yeast+Species%2C+Saccharomyces+cerevisiae+and+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).</li>
<li>El-Kirat-Chatel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+analysis+of+caspofungin-induced+cell+surface+remodelling+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans.</a> Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).</li>
<li>Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+bacterial+traps+for+simultaneous+fluorescence+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy.</a> Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A principal melhoria proporcionada por essa metodologia é um aumento significativo no número de células medidas em um determinado período de tempo. A contrapartida é a redução do número de pontos medidos por célula. Significa que este método não foi projetado para fornecer uma análise detalhada de uma única célula. O método só se aplica a células que podem caber nos poços do selo PDMS. O selo é bastante versátil, enquanto contém poços de 1,5 x 1,5 μm2 até 6 x 6 μm2. Ainda assim é impossível imobiliz...

Este trabalho fornece uma metodologia para realizar medições automáticas de força em centenas de células vivas usando um microscópio de força atômica (AFM). Também fornece um método para imobilizar micróbios em um selo microestruturado PDMS compatível com experimentos AFM realizados em um ambiente líquido.
Bio-AFM é uma tecnologia altamente especializada concebida para aplicações em biologia e, em seguida, usada para estudar células vivas. Requer um engenheiro treinado que possa analisar uma célula no momento. Nessas condições, o número de células diferentes que podem ser analisadas é bastante pequeno, típico de 5 a 10 células em 4-5 horas. No entanto, a quantidade de medidas de força registradas em uma única célula são geralmente muito altas e podem facilmente chegar a 1000. Assim, o paradigma atual das medições de força afm em células vivas é registrar centenas de curvas de força (FCs), mas em um número limitado de células.
Estatisticamente, essa abordagem é questionável e levanta a questão da representatividade da amostra. De fato, é difícil, por exemplo, avaliar a heterogeneidade de uma população celular medindo apenas algumas células, mesmo que centenas de medidas sejam registradas nessas poucas células. No entanto, é com base nesse paradigma que grandes avanços têm sido feitos na biofísica, microbiologia e nanomedicina1,2,3. De fato, a análise de nanômetros na escala de células únicas forneceu novas informações sobre a nanomecânica celular, sobre a organização de proteínas transmembranas, ou o mecanismo de ação de drogas antimicrobianas ou anticancerígenas4,5,6,7. Recentemente, no entanto, vários testes biomecânicos de alto rendimento realizados em células surgiram8, mostrando o interesse da comunidade científica em mudar esse paradigma e acessar a heterogeneidade da população celular. Todos esses testes dependem de sistemas microfluidos para deformar as células e medir opticamente sua deformação sob estresse para obter uma medida indireta de sua elasticidade superficial global8. No entanto, uma questão importante com esses métodos é que eles são mono-paramétricos: apenas a elasticidade celular pode ser sondada. Além disso, não permitem a medição dos parâmetros mecânicos das células aderentes, o que pode ser limitador para os estudos de células mamíferas não circulantes ou biofilmes, por exemplo.
Abordagens envolvendo AFM foram desenvolvidas pelas equipes de S. Scheuring9 e M. Favre10. Scheuring et al. células imobilizadas nos padrões de fibronectina9, forçando as células individuais a tomar a forma do padrão9. Em seguida, esta equipe mapeou as propriedades mecânicas de algumas células para definir dados médios, representativos de 14 a 18 células. O desenvolvimento realizado pela Farve et al. teve como objetivo multiplexar as medidas, paralelaizando as cantilevers AFM10. Pelo que sabemos, esse trabalho na direção multiplexa-se não levou a medições em células vivas.
Uma abordagem interessante proposta pela equipe de Dujardin apresenta um AFM automatizado capaz de identificar células e imagens na parte inferior de poços feitos sob medida. Embora este método não permita a análise de uma grande população de células, permite o teste automático de diferentes condições em cada poço11.
Nosso objetivo neste trabalho é mais ambicioso, pois queríamos medir pelo menos 1000 células para acessar não uma célula média, mas, pelo contrário, a heterogeneidade entre as células. A estratégia que desenvolvemos aqui para acessar a heterogeneidade da população celular usando a AFM baseia-se na análise de centenas de células nas quais um número limitado de curvas de força são registradas. Em comparação com a abordagem "clássica" de registrar um grande número de curvas de força em um número limitado de células, essa abordagem deve ser considerada complementar, uma vez que não fornece as mesmas informações. De fato, enquanto o método típico permite sondar a heterogeneidade da superfície celular individual, usando nossa abordagem, somos capazes de acessar toda a heterogeneidade da população celular. Para alcançar esse objetivo, combinamos um método que imobiliza diretamente micróbios (aqui a espécie de levedura Candida albicans) nos poços de um selo microestruturado PDMS12, e desenvolve um programa original para mover a ponta AFM, automaticamente, de célula para célula13 e medir as propriedades mecânicas de cada célula.

<table><tbody><tr><td>O modilhão</td><td>de Bruker AFM do AFM sondas</td><td>MLCT</td><td>Os cantilevers usados foram rotulados " C&rdquo; com freqüência ressonante de 7 a 10 quilohertz e de k: análise</td></tr><tr><td>JPK-Bruker</td><td>JPK do processamento de dados JPK-Bruker JPK do AFM de 0,01 N/m Mínimo 5,1.8 da versão do processamento de dados</td> de<td></td><td>JPK-Bruker Pode ser transferido de um acount do usuário de JPK-Bruker</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>WPI</td><td>FluoroDish FD35-100</td><td>O calefator foi usado para monitorar as mudanças de temperatura durante o microscópio</td></tr> (<tr><td>AFM)</td> <td>JPK-Bruker</td><td>Nanowizard II ou III</td> <td>da força atômica do experimentoo AFM deve ser montado em um microscópio ótico invertido com uma fase motorizada</td></tr><tr><td>Caspofungin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0425-5MG</td><td>Caspofungin foi usado com uma concentração de 4 MIC (concentração mínima do inibidor) Editor de</td></tr> <tr><td>código</td><td>Microsoft</td><td>Visual Studio Versão 1.40.1</td><td>do código https://code.visualstudio.com/</td></tr> <tr><td>Cryobeads</td><td>IFU</td><td>CB12</td><td></td></tr><tr><td>Dessecator/Degassing câmara</td><td>Fisherbrand</td><td>15594635</td><td>O equipamento é usado para desgaseificação dos selos PDMS por cerca de 50 minutos, qualquer dessecador acoplado a uma bomba de vácuo servirá.</td></tr><tr><td>Aquecedor de placa de Petri</td><td>JPK-Bruker</td><td>PetriDishHeater</td><td>Este é um complemento para o JPK/Bruker AFM. O aquecedor foi usado para monitorar as mudanças de temperatura durante o experimento</td></tr><tr><td>Tampão acetato de sódio pH 5,2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td>A solução contém 18 mM de acetato de sódio, 1 mM de CaCl2 e 1 mM de MnCl2. Ajuste o pH com ácido acético glacial. A solução pode ser conservada a 4 &graus; C por 2 meses</td></tr><tr><td>Linguagem de análise estatística</td><td>https://www.r-project.org</td><td>R versão 3.6.1</td><td>R é uma linguagem e ambiente para computação estatística e gráficos. É um projeto GNU semelhante ao software de análise estatística de linguagem e ambiente S</td></tr><tr><td></td><td>https://rstudio.com</td><td>R studio versão 1.1.463</td><td>colaboração entre a R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP e outros. RStudio e Shiny são projetos afiliados da Fundação para Estatísticas de Acesso Aberto</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761028</td><td>Polidimetilsiloxano (PDMS) e agente de cura em um conjunto</td></tr><tr><td>Levedura Peptona D Caldo</td><td>Difco</td><td>242820</td><td></td></tr><tr><td>YPD Ágar</td><td>Difco</td><td>DF0427-17-6</td><td></td></tr></tbody></table>

automação de medições de microscópio de força bio-atômica em centenas de células de c. albicans

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

O método apresentado neste artigo visa automatizar experimentos Bio-AFM e o registro de curvas de força. Usando este método, é possível registrar curvas de forças em 1000 células em 4 horas automaticamente. Para manter um tempo de análise de 4 horas, o número de curvas de força por célula é reduzido para 9 ou 16. O método combina um programa baseado em Jython e uma estratégia para a montagem de células em padrões definidos. O programa, implementado em um Bio-AFM comercial, pode centralizar a ponta na primeira célula da matriz e, em seguida, mover-se, automaticamente, de célula para célula enquanto grava curvas de força em cada célula. Utilizando essa metodologia, é possível acessar os parâmetros biofísicos das células, como sua rigidez, suas propriedades adesivas, etc. Com a automação e o grande número de células analisadas, pode-se acessar o comportamento da população celular. Este é um avanço no campo Bio-AFM onde os dados foram, até agora, registrados em apenas algumas dezenas de células.

Utilizamos o protocolo descrito para analisar o efeito da caspofungin nas propriedades biofísicas do patógeno humano oportunista C. albicans em sua forma de levedura. Caspofungin é uma última chance de molécula antifúngica usada quando outras drogas são ineficazes devido aos mecanismos de resistência que as células desenvolvem em relação aos antifúngicos. Seu mecanismo de ação baseia-se na inibição da subunidade Fks2 do complexo fks1/Fks2 responsável pela síntese ß glucan. Como os glucas são um componente import...

Este protocolo visa automatizar as medições de AFM em centenas de células microbianas. Primeiro, micróbios são imobilizados em microestruturas de selo PDMS e, em seguida, as medições de espectroscopia de força são realizadas automaticamente em centenas de células imobilizadas.

Automação de Medições de Microscópio de Força Bio-Atômica em centenas de células de C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

A automação de microscópios de força atômica é uma inovação fundamental na evolução da tecnologia para aplicações biomédicas. Também abre o acesso à investigação das propriedades biomecânicas das populações celulares. Nosso método permite gravar medições de AFM para 1.000 células em quatro horas, em comparação com os métodos usuais, que levam quatro horas para medir 10 células, este é realmente um ganho significativo de tempo.Se a automação é um pré-requisito para trazer essa tecnologia para laboratórios hospitalares, esse protocolo de prova de conceito sugere seu potencial de uso no desenvolvimento de estratégias específicas de diagnóstico médico. Este protocolo usa uma haste PDMS versátil que pode ser preenchida com vários micróbios permitindo que diferentes sistemas sejam explorados. Para preparar o selo PDMS, misture 55 gramas de solução pré-polímero PDMS a uma relação de massa de 10 para um em PDMs, oligômeros e agente de cura e degas a solução resultante sob vácuo em uma vez 10 para o negativo de uma a uma vezes 10 para as duas barras negativas por cinco a 10 minutos.Quando todas as bolhas de armadilhas tiverem sido removidas, despeje 20 gramas da solução desgaseada em um molde mestre de silício para uma espessura de dois a três milímetros e degas novamente. Quando todas as bolhas tiverem sido removidas, reticule o PDMS a 80 graus Celsius por uma hora e use um bisturi para cortar o selo micro estruturado PDMS paralelo às matrizes de microestrutura visível. Em seguida, retire o carimbo do molde mestre de silício e coloque o local da microestrutura de selo em um escorregador de vidro com as micro estruturas alinhadas com o lado do slide.Para preparar as células para o dispositivo, centrífugas 600 microliters da suspensão celular de interesse e adicionar 200 microliters do supernatante ao selo. Degas o supernatante sob vácuo por cerca de 40 minutos. Quando todas as bolhas tiverem sido removidas, substitua o supernascer da superfície PDMS por 200 microliters da solução celular resuspended para uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente.Para carregar as células nas micro estruturas do selo, use um slide de vidro mantido em um ângulo de 30 a 50 graus para espalhar as células através do selo em ambas as direções, várias vezes conforme necessário. Quando uma alta taxa de enchimento das microestruturas for alcançada, use uma pipeta para remover a suspensão celular e lave as três vezes com um mililitro de tampão de acetato por lavagem para remover quaisquer células não arrastadas. Após a última lavagem, use o fluxo de nitrogênio para secar a parte de trás da amostra e coloque o carimbo em uma placa de Petri.Em seguida, adicione dois mililitros de tampão de acetato fresco ao prato. Para microscopia de força atômica das células, coloque o prato no estágio do microscópio de força atômica e centralizar o palco de zero a zero. Quando o palco estiver centrado, mova a placa para o suporte da placa de Petri do microscópio e alinhe a borda do selo para que seja perpendicular ao eixo y do suporte da placa de Petri.Em seguida, coloque a força do microscópio atômico de cabeça para o palco, tomando cuidado para que os motores do estepe sejam suficientemente estendidos para evitar que a ponta caia sobre o selo. Para imagens, use os botões do microscópio para centralizar a ponta do microscópio de força atômica sobre o canto esquerdo dos poços de micrometro quadrado 4,5 por 4,5 e selecione o modo de mapeamento de força no software do microscópio. Para definir um mapa de força de 64 por 64 sobre uma área de 100 por 100 micrômetros, ajuste o ponto de ajuste relativo para três a cinco nano Newtons, o comprimento Z para quatro micrômetros, o movimento Z para a duração constante, o tempo de extensão para 0,01 segundos, o atraso de extensão a zero, o atraso para zero, o modo de atraso para a força constante , a taxa amostral para 2048 Hertz.Desmarque o laço fechado Z e verifique a imagem quadrada. Defina o acesso rápido a 100 micrômetros, o eixo lento para 100 micrômetros, o X deslocado para zero micrômetros, o Y deslocado para zero micrômetros, o ângulo da grade para zero graus, os pixels para 64 por 64, e a proporção de pixels para um para um. Em seguida, abra o software de automação.Na janela pop-up, selecione o caminho para o arquivo de script. Digite a coordenada W1 na linha variável P1 239 da seção caixa de entradas do script gyfon e o valor de coordenada W2 na linha variável P2 241. Atribua o valor do tom à linha variável de tom 245 do script e insira a dimensão do poço, que pode ser determinada a partir do desenho dos padrões do poço para a linha variável W-S 248.Escreva caminho para o diretório de salvamento na linha 251 para salvar os dados no local desejado e definir a linha variável de área total 254 para o desejo de várias extremidades dos 100 micrômetros. Em seguida, defina a linha de matriz das curvas de força e a coluna registradas por poço na linha variável 257 e clique em execução para iniciar o programa. Para analisar os dados, use o software de código do estúdio de vídeo para abrir o script Python e executar os arquivos de cópia do script Python para organizar os arquivos de curva de força em uma pasta.Insira o caminho para a pasta geral onde os dados serão armazenados. para analisar as curvas de força, abrir o software de processamento de dados do fabricante de microscópio de força atômica. No menu de arquivos, selecione o lote de curvas de espectroscopia.Selecione o processo de arquivo e carga e selecione o processo de rigidez. Selecione a última etapa do processo e clique em manter e aplicar a todos para que todas as curvas de força recebam o mesmo tratamento. Para abrir o script R, carregue os arquivos contendo as informações extraídas com o software de processamento de dados no software do estúdio R.Na janela do ambiente, clique em importar conjunto de dados e, do leitor de texto na janela pop-up, clique em procurar para localizar o arquivo ponto TSV. Uma vez que o arquivo tenha carregado, selecione a região de execução de código e execute tudo para executar todo o código. Aqui, histogramas típicos obtidos usando o protocolo como demonstrado são mostrados.Nesta análise, a repartição da rigidez foi registrada em 957 células nativas, enquanto nesta análise, foi medida a rigidez de 574 células tratadas caspofungin. Saiba que o uso de centenas de células permite que uma distribuição bimodal dos valores seja observada. Em amostras menores, uma única distribuição é tipicamente observada e pode resultar em falta de observação da heterogeneidade populacional.Uma comparação das duas condições destaca os efeitos do Caspofungin na redução da rigidez celular. Reveladas pela comparação ANOVA das células nativas e tratadas, as duas condições apresentam rigidezs altamente, significativamente diferentes. Esse valor foi alcançado devido ao grande número de células analisadas, proporcionando maior confiança nos resultados obtidos.Adicionar o supernante ao selo PDMS antes de jogar repetidamente as células nos poços até que o selo esteja cheio, é fundamental para o sucesso da análise. Nesta prova de conceito, foram analisadas células de candida albicans, mas o protocolo pode ser aplicado a qualquer grupo de células padrão, moléculas ou materiais.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste artigo vamos descrever como obtemos FRET traços de moléculas individuais de DNA imobilizado em uma superfície usando um microscópio de varredura confocal automatizado.

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Nós apresentamos um protocolo simples de se obter filmes de microscopia de fluorescência de crescimento de células de levedura, e um pacote de software baseado em GUI para extrair dados de séries temporais de uma única célula. A análise inclui linhagem automatizada e divisão atribuição tempo integrado com inspeção visual e curadoria manual de dados controladas.

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Descritos são protocolos para quantificar interações mecânicas entre células aderentes e substratos microestruturados. Essas interações estão intimamente ligadas a comportamentos celulares essenciais, incluindo migração, proliferação, diferenciação e apoptose. Os protocolos apresentam um software de análise de imagem de código aberto chamado MechProfiler, que permite a determinação das forças envolvidas para cada micropost.

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Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast

Esta técnica descreve um processador de imagem de lote automatizado projetado para medir raios de cápsula e corpo de polissacarídeo. Embora inicialmente projetado para medições de Cryptococcus neoformans cápsula o processador de imagem automático também pode ser aplicado a outra detecção de contraste à base de objetos circulares.

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Este protocolo visa células específicas no tecido para a imagem latente em nanoescala resolução usando um microscópio eletrônico de varredura (MEV). Um grande número de seções seriais de resina-incorporado material biológico é primeiro fotografado em um microscópio de luz para identificar o alvo e então em uma maneira hierárquica na SEM.

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Aqui, é apresentado um método para a análise da cinética de agregação de proteínas no nematode Caenorhabditis elegans. Animais de uma população sincronizada por idade são imagens em diferentes momentos, seguidos pela contagem de inclusão semiatomada no CellProfiler e adaptação a um modelo matemático em Amilafit.

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Aqui, apresentamos a aplicação da microscopia de força atômica (AFM) como um método simples e rápido para caracterização bacteriana e analisamos detalhes como o tamanho e a forma bacteriana, biofilmes de cultura bacteriana e a atividade de nanopartículas como bactericidas.

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A levedura de fissão é usada aqui como um hospedeiro heterólogo para expressar proteínas bacterianas do citoesqueleto, como FtsZ e MreB, como proteínas de fusão translacional com GFP para visualizar sua polimerização. Além disso, os compostos que afetam a polimerização são identificados por imagens usando um microscópio de fluorescência.

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Aprenda a automatizar medições de microscopia de força atômica em centenas de células de Candida albicans usando selos de PDMS. Este método aumenta significativamente a produtividade para estudos de biomecânica microbiana.

Automação de Medições de Microscópio de Força Bio-Atômica em centenas de células de C. albicans

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