Name: Fabricação de uma Nano-Matriz Biomimética com Nanotubos base janus e fibronectina para adesão de células-tronco (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Aprenda a fabricar uma nano-matriz biomimética com nanotubos base janus e fibronectina para adesão de células-tronco mesenquimais humanas. Este método promove bioatividade e reparo ósseo.

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Este trabalho é apoiado financeiramente pelo NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) e Universidade de Connecticut.

1. Síntese de JBNTs
NOTA: O monômero JBNT foi preparado conforme publicado anteriormente11.
<ol><li>Síntese do composto A1<ol>
<li>Prepare uma solução contendo 8,50 g de ácido 2-cianoacético e 9,80 g de etilcarbama em 25 mL de tolueno e 2,5 mL de N, N-dimetilformamida. Adicione 4,90 mL de cloreto de fósforo dropwise. Em seguida, aqueça a mistura a 70 °C e continue mexendo por 1,5 h.</li>
		<li>Esfrie a mistura de reação à temperatura ambiente e despeje 100 g de água gelada. Extrair a camada aquosa com acetato etílico (3 x 250 mL) e lavar com 100 mL de salmoura. Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtrar e evaporar voláteis sob vácuo para obter um sólido amarelo-pálido.</li>
		<li>Sujeito o sólido amarelo à cromatografia da coluna flash de sílica (3% de metanol/diclorometano) para produzir 15,61 g de composto A1 como pó branco.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese do composto A2<ol>
<li>Misture 3,12 g de composto A1 e 2,75 g de carbonato de potássio em 50 mL de N, N-dimetilformamida. Mexa em temperatura ambiente por 2h.</li>
		<li>Adicione 2,6 mL de dissulfeto de carbono à suspensão de reação. Continue mexendo por 4h.</li>
		<li>Adicione etanol absoluto à mistura de reação a 0 °C. Filtre o amarelo precipitado e lave com éter dietil. Seque sob vácuo durante a noite para produzir 6,18 g de composto A2 como sólido amarelo-pálido.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese do composto A3<ol>
<li>Adicione 2,7 mL de iodeto de metila em 15 mL de acetonitrilo. Além disso, prepare separadamente uma solução de composto A2 adicionando 6,18 g de A2 a 80 mL de água/acetonitrilo (proporção 7:3). Misture as soluções e mexa à temperatura ambiente por 30 minutos.</li>
		<li>Aqueça a mistura de reação a 95 °C e continue mexendo por 3h.</li>
		<li>Esfrie a mistura de reação à temperatura ambiente e, em seguida, evaporar os voláteis sob vácuo.</li>
		<li>Extrair o resíduo 3x com 100 mL de acetato de etila e lavar com salmoura. Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtre e evapore os voláteis sob vácuo para obter um sólido amarelo.</li>
		<li>Sujeito o sólido amarelo à cromatografia da coluna flash de gel de sílica (30% de acetato/hexanos etílicos) para produzir 4,52 g do composto A3 como um sólido amarelo-claro.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese do composto A4<ol>
<li>Prepare a solução de alilamina adicionando 925 μL de alilamina em 20 mL de etanol. Adicione esta solução dropwise à solução do composto A3, preparado adicionando 3,14 g de A3 em 75 mL de etanol absoluto, mais de 30 min. Em seguida, aqueça a mistura de reação ao refluxo por 16 h.</li>
		<li>Esfrie a mistura de reação à temperatura ambiente e evapore os voláteis para dar um sólido amarelo.</li>
		<li>Sujeito o sólido amarelo à cromatografia da coluna flash de sílica (50% de acetato/hexanos etílico a 2% de metanol/diclorometano) para produzir 1,80 g de composto A4 como cristal branco.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese do composto A5<ol>
<li>Adicione 2,05 g de cloridrato de guanidinium e 7,8 mL de etoóxido de sódio (21 wt% no etanol) em 14 mL de etanol absoluto. Aqueça a mistura a 45 °C por 15 min.</li>
		<li>Filtre o material insolúvel e adicione o filtrado diretamente na solução do composto A4, preparado adicionando 2,70 g de A4 em 40 mL de etanol absoluto. Aqueça a mistura de reação ao refluxo por 16 h.</li>
		<li>Filtre o precipitado para obter 2,65 g de composto A5 como um sólido off-white.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese do composto A6<ol>
<li>Adicione 24,9 mL de trietilamina lentamente à mistura de chorume obtida adicionando 2,11 g de composto A5 e 1,10 g de 4-Dimethylaminopyridina em 120 mL de tetrahidrofurano acima de 1 min. Mexa em temperatura ambiente por 2 minutos.</li>
		<li>Adicione 20,7 mL de di-tert-butyl dicarbonato dropwise à mistura de reação e continue mexendo à temperatura ambiente por 40 h.</li>
		<li>Adicione 20 mL de água para saciar a reação. Evaporar os voláteis sob vácuo.</li>
		<li>Extrair o resíduo viscoso vermelho com 500 mL de acetato de etila. Em seguida, lave-o com 250 mL de água, 75 mL de ácido cítrico 10%, 2x com 200 mL de água, 200 mL de bicarbonato de sódio saturado e 200 mL de salmoura. Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtre e evapore os voláteis sob vácuo para dar um sólido vermelho/laranja.</li>
		<li>Sujeito o sólido à cromatografia da coluna flash de gel de sílica (0-20% acetato/hexanos) para produzir 3,87 g de composto A6 como espuma branca.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese do composto A7<ol>
<li>Adicione N-metilmorpholine N-óxido (50 wt.% em água, 1,64 mL) dropwise à solução do composto A6 (2,93 g) em acetona/água (8:1, 58,5 mL) e mexa à temperatura ambiente por 5 minutos.</li>
		<li>Adicione tetraóxido de ósmio (solução aquosa de 4%) à mistura durante um período de 3 minutos e continue mexendo à temperatura ambiente por 24h.</li>
		<li>Sacia a reação com sulfito de sódio aquoso de 1,0 M até que a solução fique incolor. Remova os voláteis sob vácuo para resultar em um chorume branco na água. Extrair o resíduo com 350 mL de diclorometano e depois lavar com 150 mL de água seguido de uma lavagem com 150 mL de salmoura.</li>
		<li>Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtre e evapore os voláteis sob vácuo para produzir 2,45 g de composto A7 como um sólido branco.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese do composto A8<ol>
<li>Adicione 760 g de periodide de sódio à mistura de 1,36 g de composto A7 em 35 mL de diclorometano/água (6:1, 35 mL) e mexa à temperatura ambiente por 42 h.</li>
		<li>Filtre o material insolúvel e concentre o filtrado sob vácuo. Extrair o resíduo resultante com 250 mL de diclorometano e, em seguida, lavar com 100 mL de água e 100 mL de salmoura. Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtre e evapore os voláteis sob vácuo para dar o produto bruto.</li>
		<li>Sujeito o produto bruto à cromatografia da coluna flash de sílica (5-40% acetato/hexanos etílicos, depois 5% metanol/diclorometano) para produzir 1,08 g de composto A8.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese do composto A9<ol>
<li>Prepare uma solução de 830 mg de composto A8 em 15 mL de 1,2-dicloroetano. Adicione a solução de dropwise à mistura de 6-benzyloxycarbonylamino-2-L-amino-hexanoico ácido trimetilsilyl etil ester (649,5 mgs) e N, N-diisopropiltilamina (591 μL) em 24 mL de 1,2-dicloroetano ao longo de 3 min e mexa em temperatura ambiente por 15 minutos.</li>
		<li>Adicione 360,3 mg de triacetoxyboroidride de sódio à solução e continue mexendo à temperatura ambiente por 24 h.</li>
		<li>Sacie a mistura de reação com 6 mL de água. Extrair a mistura de reação 3x com 200 mL de diclorometano e lavar com 200 mL de ácido cítrico de 10% em água, 2x com 200 mL de água, 200 mL de bicarbonato de sódio saturado e 200 mL de salmoura nessa ordem. Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtre e evapore os voláteis sob vácuo para obter o produto bruto.</li>
		<li>Sujeito o produto bruto à cromatografia da coluna flash de gel de sílica (5-30% acetato/hexanos) para produzir 885 mg composto A9.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese do monômero JBNT<ol>
<li>Dissolva 0,54 g de composto A9 (0,54 g) em 10 mL de solução de ácido/tioanisola trifluoroacética de 94% e mexa à temperatura ambiente por 72 h.</li>
		<li>Adicione éter dietil (80 mL) à mistura de reação e centrífugue o precipitado para baixo. Despeje o ácido trifluoroacético claro contendo supernanato e lave o precipitado branco com éter dietilo e metanol para produzir 168,6 mg de monômero JBNT bruto(Arquivo Suplementar 1).</li>
		<li>Purifique o monômero JBNT bruto por uma cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) com uma coluna de fase inversa. O programa de isolamento está listado abaixo: Solvente A: 100% água; solvente B: 100% acetonitrilo; solvente C: pH=1 Solução hcl de água; fluxo: 3 mL/min (ver Tabela 1).</li>
		<li>Colete o maior pico em cerca de 7,2 min.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fabricação para JBNT/FN
<ol><li>Adicione 80 μL de solução aquosa JBNT de 1 mg/mL a 40 μL de solução aquosa de 1 mg/mL FN e pipeta várias vezes.</li>
	<li>Verifique a presença de suspensão branca sólida após a pipetação por cerca de 10 s. NOTA: Um vídeo foi filmado para capturar o processo de automontagem do NM (Arquivo Suplementar 2).</li>
</ol>3. Observação de espécimes liofilizados
NOTA: Esta etapa é realizada para mostrar a estrutura do andaime de NM feita de JBNTs e FN.
<ol><li>Prepare soluções FN, JBNT e FN/JBNT NM para observação de materiais liofilizados. Diluir 10 μL de 100 μg/mL de FN com 40 μL de água destilada para fazer uma solução de 20 μg/mL de FN.</li>
	<li>Prepare a solução de 100 mg/mL de JBNTs diluindo 5 μL de 1 mg/mL JBNTs em 45 μL de água DI.</li>
	<li>Misture 10 μL de 100 μg/mL FN e 5 μL de 1 mg/mL de JBNTs em 35 μL de água DI para formar a solução NM.</li>
	<li>Cubra três poços de microplacas de fundo redondos de 96 bem claras com a solução FN, JBNT e solução NM, respectivamente. Cada poço recebe 50 μL da solução.</li>
	<li>Realizar a liofilização, como descrito abaixo, para visualizar a estrutura do andaime do NM.<ol>
<li>Congele a placa a -80 °C durante a noite.</li>
		<li>Ligue o instrumento liofilizado e a bomba de vácuo.</li>
		<li>Pressione o botão de desligar para reduzir a temperatura do sistema para -50 °C.</li>
		<li>Coloque a placa congelada no instrumento liofilizado e feche todas as aberturas dos instrumentos.</li>
		<li>Clique no botão iniciar para reduzir a pressão do sistema para 0,9 mbar.</li>
		<li>Depois de 4h, pressione o botão de aerado e abra a válvula para aumentar a pressão do sistema à pressão atmosférica.</li>
		<li>Tire a placa do instrumento liofilizado.</li>
		<li>Use um microscópio para observar o FN, JBNTs e o NM auto-montado resultante. Tire várias fotos com uma câmera para os materiais.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Medição de espectro de absorção
NOTA: Use a alteração de espectro para FN e JBNTs para apresentar o auto-montado JBNT/FN NM12.
<ol><li>Misture 30 μL de 100 μg/mL FN com 15 μL de água destilada e 5 μL de 1 mg/mL JBNTs para preparar a solução JBNT/FN NM. A suspensão sólida branca pode ser vista depois de pipetting a solução várias vezes. NOTA: As concentrações finais de JBNTs e FN na solução são de 100 μg/mL e 60 μg/mL, respectivamente. JBNTs e soluções FN na mesma concentração à utilizada na solução NM também foram preparadas como soluções de controle.</li>
	<li>Diluir 5 μL de 1 mg/mL de JBNTs com 45 μL de água destilada para preparar a solução de controle JBNT.</li>
	<li>Diluir 30 μL de 100 μg/mL FN com 20 μL de água destilada para preparar a solução de controle FN.</li>
	<li>Meça o espectro de absorção UV-vis das soluções FN, JBNT e JBNT/FN NM com o espectotômetro (ver Tabela de Materiais) para caracterizar a montagem de NM.<ol>
<li>Clique no botão UV-Vis. Limpe a superfície de teste do espectrofotômetro e solte 2 μL de água destilada sobre ele. Meça-o como em branco de 190-850 nm.</li>
		<li>Limpe a superfície de teste do espectrofotômetro e solte 2 μL de solução FN sobre ele. Meça o espectro de absorção UV-Vis da solução FN de 190 nm a 850 nm.</li>
		<li>Limpe a superfície de teste do espectrofotômetro e solte 2 μL de solução JBNT sobre ele. Meça o espectro de absorção da solução JBNT de 190 nm a 850 nm.</li>
		<li>Limpe a superfície de teste do espectrofotômetro e solte 2 μL da solução JBNT/FN NM sobre ele. Meça os espectros de absorção da solução JBNT/FN NM de 190 nm a 850 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Preparação do JBNT/FN NM para microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
<ol><li>Limpe várias grades antes da coloração negativa com um limpador de plasma básico (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Realize a coloração negativa para os espécimes seguindo dois processos diferentes.<ol>
<li>Solte 3 μL de 1 mg/mL de solução aquosa JBNTs e 3 μL de solução JBNT/FN NM em grades separadas e deixe-a por 2 minutos. Em seguida, enxágüe cada grade com 100 μL de solução de acetato de urânl (UA) de 0,5%. Escorra a solução em excesso com papel filtro e o ar seque as grades.</li>
		<li>Misture 9 μL de solução JBNT/FN NM com 3 μL de solução UA de 2,0% e pipeta várias vezes. Pipeta a solução mista nas grades e mantenha-a nas grades por 2 minutos. Use um papel filtro para remover a solução mista das grades e secar as grades à temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Por fim, caracterize a amostra para JBNTs, JBNT/FN NM manchada com a etapa 5.2.1, e JBNT/FN NM manchada com a etapa 5.2.2 com o TEM.</li>
</ol>6. Ensaio de função biológica in vitro
<ol><li>Adicione 200 μL de controles negativos (NC, PBS), JBNTs, FN e as soluções JBNT/FN NM em um poço de um slide de câmara de 8 poços, respectivamente.</li>
	<li>Congele a tampa de 8 poços com o instrumento liofilizado para revestir materiais na parte inferior dos poços. O protocolo de secagem congelante é o mesmo do passo 3.5.</li>
	<li>Em seguida, adicione 10.000 células/poços hMSCs (Passagem 3) nos poços e incuba-os por 24h a 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Após a incubação, pipeta o meio de cultura celular dos poços e enxágue a cultura com solução 1x PBS.</li>
	<li>Adicione 100 μL da solução fixativa a cada poço com células e deixe por 5 minutos. Enxágüe as células suavemente com 1x PBS duas vezes.</li>
	<li>Diluir 1% Triton-X 100 a 0,1%. Adicione 100 μL de 0,1% Triton-X 100 a cada poço com células e deixe por 10 minutos. Enxágüe as células suavemente com 1x PBS duas vezes.</li>
	<li>Diluir a falooidina de Rhodamina para 1,65 μM. Adicione 100 μL de Rhodamine Phalloidin a cada poço com células e incubar o vidro de cobertura de câmara mantendo-se da luz à temperatura ambiente por 30 minutos. Enxágüe as células suavemente com 1x PBS duas vezes.</li>
	<li>Capture as imagens celulares com um microscópio fluorescente.</li>
	<li>Conte os números de células em imagens fluorescentes para cada grupo. Calcule a densidade de adesão celular por uma média de três áreas aleatórias em cada poço.</li>
	<li>Apresentar todos os dados como desvio padrão ± médio (SD). Realizar análises estatísticas utilizando-se um teste t-cauda-de-cauda, seguido da análise de variância (ANOVA) com p<0,05, que é considerado estatisticamente significante.</li>
</ol>

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<li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structurally+and+functionally+optimized+silk-fibroin-gelatin+scaffold+using+3D+printing+to+repair+cartilage+injury+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Material%22%5BJournal%5D)">Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo.</a> Advanced Material. 29, 1701089(2017).</li>
<li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+inflammatory+activation+by+self-assembling+Rosette+nanotubes+in+human+Calu-3+pulmonary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells.</a> Small. 4 (6), 817-823 (2008).</li>
<li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosette+nanotubes+show+low+acute+pulmonary+toxicity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).</li>
</ol>

Dr. Yupeng Chen é um co-fundador da NanoDe Therapeutics, Inc.

Neste estudo, desenvolvemos um NM biomimético auto-montado, que foi formado com JBNTs inspirados em DNA e FN. Ao preparar a solução JBNT, o pó liofilizado JBNT deve ser dissolvido na água em vez de PBS, pois a PBS causará aglomeração de JBNTs, o que inibe sua montagem. Além disso, o NM também deve ser montado em água se quisermos observar as estruturas nanofibrilas do NM, pois o sal em PBS vai empacotar com fibras NM, o que pode reduzir muito a resolução das imagens.
O NM tem mostrado grande p...

As células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) têm mostrado o potencial de auto-renovação e auto-diferenciação ao longo de diferentes linhagens mesenquimais, o que ajuda na regeneração e manutenção dos tecidos1. Com base no potencial de diferenciação, os HMSCs são considerados candidatos a lesões de tecido mesenquimal e terapia de transtorno hematopoiético2. hMSCs têm mostrado a capacidade de promover a cicatrização de feridas aumentando a reparação de tecidos, angiogênese e reduzindo a inflamação3. No entanto, sem assistência bioquímica ou biomaterial, a eficiência para que os hMSCs atinjam um tecido alvo e funcionem no local desejado é baixa4. Embora vários andaimes projetados tenham sido utilizados para atrair hMSCs para aderir às lesões, alguns locais como a fratura da placa de crescimento, no meio de um osso longo, não são facilmente acessíveis pelos andaimes convencionais pré-fabricados, que podem não se encaixar perfeitamente em um local lesionado de forma irregular.
Aqui, desenvolvemos um nanomaterial biomimético que pode se auto-montar in situ e ser injetado em uma área alvo de difícil acesso. O bioescato injetável NM é composto por nanotubos base janus (JBNTs) e fibronectina (FN). Os JBNTs, também conhecidos como Nanotubos Rosette (RNTs), são derivados de pares de bases de DNA, especificamente timina e adenina, aqui5,6,7. Como visto na Figura 1,os nanotubos são formados quando seis moléculas da base de DNA derivada se auto-montam através de ligações de hidrogênio para formar um plano6. Seis moléculas são então empilhadas uma sobre a outra em um plano através de uma forte interação pi-empilhamento7, que pode ser de até 200-300 μm de comprimento. Os JBNTs são projetados para imitar morfologicamente fibras de colágeno para que a FN reaja com elas.
FN é uma glicoproteína adesiva de alto peso molecular, que pode ser encontrada na matriz extracelular (ECM)9. Estes podem mediar a fixação de células-tronco a outros componentes do ECM, particularmente o colágeno10. Projetamos JBNTs para imitar morfologicamente fibras de colágeno para que a FN possa reagir com eles para formar NM em poucos segundos através de ligação não covalente. Portanto, nm é um promissor bioescato a ser injetado em um local de fratura óssea que não poderia ser acessível pelos andaimes convencionalmente fabricados. Aqui, o NM injetável apresenta uma excelente capacidade de melhorar a ancoragem hMSC in vitro, exibindo seu potencial para servir como um andaime para regeneração tecidual.

<table><tbody><tr><td>1,2-dicloroetano</td><td>Alfa Aesar</td><td>39121</td><td></td></tr><tr><td>ácido 2-cianoacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C88505</td><td></td></tr><tr><td>4-Dimetilaminopiridina</td><td>TCI America</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>8 poços Tampa de lamínula com câmara</td><td>Thermo Fisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 poços</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td> <td>absolutoThermo Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>alilamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>145831</td><td></td></tr><tr><td>Basic Plasma Cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC32G</td><td></td></tr><tr><td>ácido cítrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>concentrado ácido clorídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Água deionizada</td><td>Thermo Fisher</td><td>15230147</td><td></td></tr><tr><td>diclorometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>éter</td> dietílico 270997 <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich 296082</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dicarbonato de di-terc-butila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>361941</td><td></td></tr><tr><td>acetato de etila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319902</td><td></td></tr><tr><td>etilcarbamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Thermo Fisher</td><td>Solução Fixadora PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>(4% de formaldeído preparado em PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37814</td><td></td></tr><tr><td>cloridrato de guanidínio</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13543</td><td></td></tr><tr><td>hexanos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227064</td><td></td></tr><tr><td>Humano células-tronco mesenquimais</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>iodeto de metila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropiletilamina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17114</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>N-metilmorfolina N-óxido Alfa</td><td>Aesar</td><td>A19802</td><td></td></tr><tr><td>Tetraóxido de ósmio</td><td>Alfa Aesar</td><td>45385</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão fosfato</td><td>Thermo Fisher</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de fosforil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201170</td><td></td></tr><tr><td>carbonato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>347825</td><td></td></tr><tr><td>coluna de fase reversa</td><td>Thermo Fisher</td><td>25305-154630</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina Faloidina</td><td>Thermo Fisher</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>gel de sílica</td><td>TCI America</td><td>S0821</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>etóxido de sódio</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13083</td><td></td></tr><tr><td>periodeto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>sulfito de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0505</td><td></td></tr><tr><td>triacetoxiborohidreto de sódio</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22060</td><td></td></tr><tr><td>espectrofotômetro(NanoDrop One/Onec UV-Vis)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Células-Tronco BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>tetrahidrofurano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>tioanisol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T28002</td><td></td></tr><tr><td>tolueno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>trietilamina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12646</td><td></td></tr><tr><td>ácido trifluoroacético</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>Solução de tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação de uma nano-matriz biomimética com nanotubos base janus e fibronectina para adesão de células-tronco

Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

Um NM biomimético foi desenvolvido para servir como um andaime biológico de engenharia tecidual, que pode melhorar a ancoragem de células-tronco. O NM biomimético é formado a partir de JBNTs e FN através de auto-montagem em uma solução aquosa. Os JBNTs medem 200-300 μm de comprimento com canais ocos hidrofóbicos internos e superfícies hidrofílicas externas. Os JBNTs são carregados positivamente e as FNs são cobradas negativamente. Portanto, quando injetados em uma solução aquosa neutra, eles são unidos através de laços não covalentes para formar os feixes NM. O processo de automontagem é concluído dentro de alguns segundos sem qualquer iniciador químico, fonte de calor ou luz UV. Quando o pH da solução NM for inferior ao ponto isoelétrico das FNs (pI 5.5-6.0), os feixes de NM serão auto-liberados devido à presença de FN carregado positivamente.
NM é conhecido por imitar a matriz extracelular (ECM) morfologicamente e, portanto, pode ser usado como um andaime injetável, que fornece uma excelente plataforma para melhorar a adesão do HMSC. A análise da densidade celular e os experimentos de imagem de fluorescência indicaram que os NMs aumentaram significativamente a ancoragem de hMSCs em comparação com o controle negativo.

Nossos estudos descobriram que a formação do NM de JBNTs e FN é rápida, o que aconteceu em 10 segundos. Como mostrado na Figura 2,o flocule branco foi obtido quando a solução JBNT foi misturada com a solução FN e pipetada várias vezes. O processo de formação de NM é completamente biomimético. Não são necessários estímulos externos. O processo de fabricação é muito mais fácil do que o de alguns biomateriais emergentes, que são baseados em luz ultravioleta ou iniciador químico para crosslinkin...

O objetivo deste protocolo é mostrar a montagem de uma nanomatrix biomimética (NM) com nanotubos base janus (JBNTs) e fibronectina (FN). Quando co-cultivados com células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs), os NMs apresentam excelente bioatividade no incentivo à adesão dos HMSCs.

Fabricação de uma Nano-Matriz Biomimética com Nanotubos base janus e fibronectina para adesão de células-tronco

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

Desenvolvemos uma nanomatriz biomimética com grande promessa de servir como um andaime de engenharia de tecidos. Este protocolo demonstra como montar a nanomatriz a partir de nanotubos de base Janus sintetizados em meu laboratório, bem como a proteína fibronectina. Esta nanomatriz pode se auto-montar em poucos segundos sem usar qualquer assistência adicional.Quando co-cultivada com células-tronco mesenquimais humanas, a nanomatriz exibiu excelente bioatividade em estimular a adesão celular. A nanomatriz imita morfologicamente a matriz extracelular. Portanto, tem o potencial de servir como um andaime injetável para reparar fraturas ósseas, promovendo a adesão e a função celular no local alvo.Comece fabricando a nanomatriz. Adicione 80 microlitros de nanotubos de base Janus de um miligrama por mililitro a 40 microlitros de fibronectina de um miligrama por mililitro e pipete a mistura suave e lentamente várias vezes. Após 10 segundos, inspecione visualmente o tubo quanto à presença de uma suspensão sólida branca.Em seguida, prepare soluções de fibronectina, JBNT e nanomatriz de fibronectina / JBNT para observação de materiais liofilizados de acordo com as instruções do manuscrito. Cubra três poços de uma microplaca de fundo redondo transparente de 96 poços com soluções, adicionando 50 microlitros a cada poço. Congele o prato a 80 graus Celsius negativos durante a noite.No dia seguinte, ligue o instrumento liofilizado e a bomba de vácuo e pressione o botão de resfriamento para reduzir a temperatura do sistema para menos 50 graus Celsius. Coloque a placa congelada no instrumento e feche todas as aberturas. Clique no botão Iniciar para reduzir a pressão do sistema para 0,9 milibar.Após quatro horas, pressione o botão de aeração e abra a válvula para aumentar a pressão do sistema para a pressão atmosférica. Em seguida, retire a placa do instrumento liofilizado. Prepare a solução de nanomatriz JBNT/fibronectina conforme descrito no manuscrito do texto e dilua as soluções JBNT e fibronectina com água destilada para fazer soluções de controle.Meça os espectros de absorção das soluções com o espectrofotômetro para caracterizar a montagem de nanomatrizes. Clique no botão UV-vis. Em seguida, limpe a superfície de teste do espectrofotômetro e coloque dois microlitros de água destilada sobre ela.Meça a água em branco de 190 a 850 nanômetros. Para cada amostra, limpe a superfície de teste e coloque dois microlitros da solução sobre ela. Em seguida, meça os espectros de absorção UV-vis de 190 a 850 nanômetros.Adicione 200 microlitros de controles negativos, JBNTs, fibronectina e as soluções de nanomatriz nos poços de uma lâmina com câmara de oito poços. Liofilize a lamínula com câmara de oito poços com o instrumento liofilizado para revestir os materiais no fundo dos poços. Em seguida, adicione 10.000 células-tronco mesenquimais humanas a cada poço da lamínula e incube-o por 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Após a incubação, remova o meio de cultura de células dos poços e lave-os com PBS. Adicione 100 microlitros da solução fixadora a cada poço e deixe por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, enxágue suavemente as células com PBS duas vezes e adicione 100 microlitros de 0,1% Triton X-100 a cada poço.Após 10 minutos, repita os enxágues com PBS. Adicione 100 microlitros de faloidina de rodamina a cada poço e incube a lamínula por 30 minutos, protegendo-a da luz. Enxágue as células duas vezes com PBS e visualize-as com um microscópio fluorescente.A formação de nano-matrizes é rápida e completamente biomimética. O flóculo branco era visível 10 segundos após a solução de JBNT ter sido misturada com a solução de fibronectina. Imagens de câmera de fibronectina, JBNTs e nanomatriz foram capturadas e analisadas.Não foram observadas fibras longas no grupo fibronectina, indicando que a estrutura do andaime não pode se formar sem JBNTs. Os JBNTs aparecem como fibras longas e finas. Quando reticulada com fibronectina, a fibra da nanomatriz pode crescer até vários centímetros de comprimento.A montagem da nanomatriz também foi confirmada pela obtenção de espectros UV-vis. Os dois picos de absorção de JBNTs sozinhos diminuem após a formação da nanomatriz. A microscopia eletrônica de transmissão foi utilizada para caracterizar a morfologia dos JBNTs e nanomatrizes.Os JBNTs são tubos delgados com diâmetros uniformes. Quando misturados com fibronectina, eles formam uma longa nanomatriz de miomas por meio de interações de carga. Quando o pH é inferior ao ponto isoelétrico da fibronectina, a nanomatriz se autolibera devido à fibronectina carregada positivamente.O efeito da nanomatriz JBNT/fibronectina na adesão celular também foi explorado. Como as nanomatrizes são projetadas para imitar morfologicamente a matriz extracelular, elas fornecem um andaime e aumentam a adesão celular. A microscopia de fluorescência confirmou que a incubação com as nanomatrizes aumentou a adesão celular.No procedimento a seguir, a migração celular, a diferenciação e a função de longo prazo podem ser mostradas para explorar ainda mais o efeito da nanomatriz no crescimento e nas funções das células-tronco mesenquimais humanas.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste protocolo, demonstramos a fabricação de substratos biomiméticos de cultura de células cardíacas feitos de dois materiais poliméricos distintos usando litografia de força capilar.  Os métodos descritos fornecem uma técnica escalável e econômica para projetar a estrutura e a função dos tecidos cardíacos macroscópicos para aplicações in vitro e in vivo.

Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco

Um método para obtenção de nanofibras e nanoestruturas de complexos de proteínas de matriz extracelular simples ou múltiplos é descrito. Este método utiliza as interações proteína de superfície para criar materiais à base de proteínas free-standing com composição sintonizável e arquitetura para o uso em uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos e biotecnologia.

Nanofibras ECM proteínas e Nanoestruturas Engineered Usando Assembléia iniciou-Surface

Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar andaimes electrospun nanofibras com organização gradated de fibras e explorar suas aplicações na regulação da morfologia celular / orientação. Gradientes no que diz respeito às propriedades físicas e químicas dos scaffolds nanofibras oferecer uma ampla variedade de aplicações na área biomédica.

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Um método para obter a nanopatterns baseada em dendrímeros irregulares que permitem o controle de escala nanométrica de local arginina-glicina-aspártico ácido (RGD) densidade de superfície é descrito e aplicado para o estudo da diferenciação celular de adesão e chondrogenic.

Baseado em dendrímeros Nanopatterns desigual de adesividade de superfície de controle localmente: um método para direcionar Chondrogenic diferenciação

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Fabricação de poços de Agarose personalizado para a propagação de células e tecido anel Self-assembly usando moldes 3D-impresso

Este artigo descreve a metodologia detalhada para preparar uma matriz multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulação de alta produtividade de física e química sugestões imitando na vivo o microambiente celular e para Identifica o ambiente celular ideal para as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) com perfis de célula única.

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Aqui, apresentamos um protocolo para a fabricação de placas de gradiente nanopattern através de nanoimprinting térmica e o método de triagem respostas de células progenitoras endoteliais humanas para as nanoestruturas. Usando a tecnologia descrita, é possível produzir um andaime que pode manipular o comportamento de célula por estímulos físicos.

Fabricação de gradiente Nanopattern pela técnica de Nanoimprinting térmica e rastreio da resposta das células formadoras endoteliais humanas

Este protocolo descreve a montagem de um andaime de nanomatriz de base Janus (JBNm) camada por camada, adicionando nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 e Fator de Crescimento Transformador Beta-1 (TGF-β1) sequencialmente. O JBNm foi fabricado e caracterizado; além disso, apresentou excelente bioatividade, estimulando funções celulares como adesão, proliferação e diferenciação.

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As inserções de cultura de tecidos com membranas plásticas são o padrão ouro em laboratórios de cultura de células como suportes permeáveis para estabelecer camadas celulares e modelos de tecidos de barreira. Aqui, apresentamos um método simples para substituir a membrana plástica por uma membrana mais biologicamente relevante feita de uma proteína de seda de aranha funcionalizada recombinante.

Mímica de membrana basal nanofibrilar feita de seda de aranha funcionalizada recombinante em inserções de cultura de tecidos feitas sob medida

O protocolo a seguir apresenta um método de extrusão baseado em cisalhamento para a fabricação de hidrogéis de colágeno com fibrilas padronizadas em nanoescala, que pode ser aplicado a uma ampla gama de aplicações de engenharia de tecidos.

Produção de colágeno estampado nanofibrilar para engenharia de tecidos

Aprenda a fabricar uma nano-matriz biomimética com nanotubos base janus e fibronectina para adesão de células-tronco mesenquimais humanas. Este método promove bioatividade e reparo ósseo.

Fabricação de uma Nano-Matriz Biomimética com Nanotubos base janus e fibronectina para adesão de células-tronco

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