Quantificação da ingestão de Macronutrientes em uma Tela Neuronal Termogenética usando Larvas de Drosophila
June 11th, 2020
Descrito aqui é um protocolo que permite a quantificação colorimétrica da quantidade de alimentos comidos dentro de um intervalo definido de tempo por larvas de melanogaster Drosophila expostas a dietas de diferentes qualidades macronutrientes. Esses ensaios são conduzidos no contexto de uma tela termogenética neuronal.
Nosso protocolo permite a identificação de populações neuronais larvais que codificam escolhas nutricionais relacionadas ao controle dos níveis de ingestão de dois macronutrientes principais, proteínas e carboidratos. A simplicidade e o rendimento relativamente alto do nosso método permitem a quantificação da ingestão alimentar para vários genótipos expostos a diferentes condições nutricionais. Para cruzar geneticamente as linhas parentais, monte gaiolas de coleta de embriões de 60 milímetros com pratos de dieta de criação L3 suplementados com alguma pasta de fermento ativa.
Transfira as fêmeas virgens adultas TripA1 e os machos Janelia GAL4 com idade entre cinco e oito dias para as gaiolas de coleta de embriões e permita que o acasalamento ocorra por 24 a 48 horas a 25 graus Celsius com 60% de umidade e um ciclo escuro claro de 12, 12. Após o período de acasalamento, transfira as moscas adultas acasaladas para pratos de dieta de criação L3 frescos e deixe a postura dos ovos ocorrer por três a quatro horas a 25 graus Celsius. Certifique-se de que todas as placas estejam rotuladas com o genótipo e a data da postura dos ovos.
Quando o período de postura terminar, remova as placas das gaiolas e estime o número de ovos por placa contando o número de embriões em um quarto da placa. Mantenha a densidade larval em um máximo de 200 embriões por placa e cubra as placas com tampas de plástico. Incube as placas de criação L3 a 18 graus Celsius, 60% de umidade e um ciclo de 12, 12 claros e escuros por nove dias.
Após a incubação, coletar três grupos de 10 L3 de cada um dos genótipos a serem testados, bem como um grupo de 10 L3 para o controle do alimento com corante zero. Use a pinça número cinco ou pluma realizando a coleta de larvas da forma mais suave possível. Transfira as larvas coletadas para barcos de plástico contendo um mililitro de água.
Configure uma incubadora de 30 graus Celsius e mantenha os níveis de umidade altos adicionando uma bandeja cheia de água para evitar a desidratação larval durante o ensaio. Equilibre a temperatura das placas de ensaio aquecendo-as a 30 graus Celsius antes de começar. Certifique-se de que todas as placas estejam rotuladas com o genótipo e a proporção de proteína para carboidrato da dieta.
Choque térmico das larvas experimentais por dois minutos, transferindo diretamente os barcos de plástico contendo os animais para um banho-maria a 37 graus Celsius. Defina o número necessário de temporizadores para uma hora, drene cuidadosamente a água dos barcos de plástico e transfira os grupos L3 dos barcos para o centro das placas de ativos. Cubra as placas e inicie o cronômetro.
Deixe as larvas se alimentarem por uma hora a 30 graus Celsius no escuro. Pare o ensaio de alimentação transferindo as placas para um banho de gelo. Prepare dois microtubos de mililitros para cada grupo L3 testado, contendo esferas de vidro de 0,5 milímetro suficientes para preencher a parte inferior do microtubo e 300 microlitros de metanol gelado.
Use um refrigerador de bancada para manter os microtubos frios. Recupere cuidadosamente os grupos L3 das placas de ensaio de alimentação e transfira-os para as tampas das placas com um pouco de água. Enxágue as larvas para remover restos de comida de seus corpos, tomando cuidado para evitar ferimentos.
Transfira as larvas para os microtubos preparados e lise-as com um lisador de tecido para extrair o corante alimentar das entranhas. Transfira os extratos para microtubos limpos de 1,5 mililitro, invertendo diretamente os microtubos de dois mililitros nos novos tubos. Faça isso com cuidado para que a maioria das contas de vidro fique no fundo do tubo de dois mililitros.
Limpe os detritos celulares centrifugando os extratos a uma velocidade máxima e quatro graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, transfira os sobrenadantes para tubos limpos de 1,5 mililitro. Para realizar a quantificação calorimétrica do consumo de alimentos, prepare soluções padrão de corante azul diluindo-as serialmente de um a dois em metanol. Transfira 100 microlitros das amostras experimentais, padrões e branco para os poços de uma microplaca de 96 poços e meça a absorbância em 600 nanômetros.
Este protocolo foi utilizado para quantificar as quantidades relativas de macronutrientes consumidos pelos animais sob ativação termogenética de populações neuronais específicas no sistema nervoso larval. A ativação de populações distintas de neurônios afetou significativamente o equilíbrio de macronutrientes em larvas de terceiro ínstar. O padrão alimentar observado para a linhagem controle, aqui indicado na cor cinza, mostra uma diminuição esperada do consumo alimentar em dietas com maior proporção de proteína para carboidrato, demonstrando a eficácia do método.
As cinco classes fenotípicas que foram estabelecidas para os animais experimentais foram comer muito e compensar a diluição de proteínas comendo demais, comer muito, mas não compensar, comer pouco, mas compensar, comer pouco e não compensar, e comer de forma aberrante. Para cada uma dessas classes fenotípicas e genótipos, os padrões de GFP no sistema nervoso central de larvas de terceiro ínstar são mostrados. Ao tentar este protocolo, é importante gerar larvas de terceiro ínstar iniciais sincronizadas com o desenvolvimento, a fim de minimizar a variação associada ao comportamento animal.
Seguindo esse protocolo, a radiorotulagem dos alimentos permitiria a confirmação e posterior dissecação dos acertos encontrados por esse método.
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Visão Geral
Este estudo descreve um protocolo para quantificação colorimétrica da ingestão de alimentos em larvas de Drosophila melanogaster expostas a várias dietas macronutricionais. A pesquisa concentra-se em identificar populações neuronais larvais envolvidas na escolha nutricional e controle da ingestão de alimentos em meio a diferentes proporções de proteína e carboidrato.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Comportamental
- Genética
Fundo
- As larvas de Drosophila melanogaster servem como um modelo para o estudo de comportamentos nutricionais.
- O impacto da qualidade dos macronutrientes dietéticos nos padrões de alimentação é crucial para entender as escolhas metabólicas.
- O protocolo permite a triagem de alta produtividade da ingestão de alimentos entre genótipos.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um método para quantificar a ingestão de alimentos em estágios larvais de Drosophila.
- Entender os mecanismos neuronais subjacentes à tomada de decisão nutricional.
- Examinar os efeitos de diferentes proporções de proteína e carboidrato no comportamento alimentar.
Métodos Utilizados
- O protocolo utiliza ensaios comportamentais para quantificar a atividade alimentar em larvas de terceiro estágio.
- As larvas de Drosophila são expostas a diferentes dietas enquanto as populações neuronais são ativadas termogeneticamente.
- A avaliação envolve o choque térmico das larvas, seguido de medição colorimétrica do corante alimentar absorvido de sua dieta.
- A sincronização cuidadosa do desenvolvimento das larvas é crucial para resultados comportamentais consistentes.
- Curvas padrão para quantificação são estabelecidas usando soluções de corante diluídas em série.
Principais Resultados
- Ativações neuronais distintas influenciam significativamente o equilíbrio de macronutrientes nos padrões de alimentação.
- Cinco classes fenotípicas de comportamento alimentar foram identificadas com base nas respostas de ingestão às mudanças dietéticas.
- O método mostrou quantificação eficaz da relação entre a composição da dieta e a ingestão de alimentos.
Conclusões
- Este protocolo permite aos pesquisadores investigar o papel de populações neuronais específicas nas escolhas dietéticas das larvas.
- A medição clara da ingestão de alimentos e fenótipos comportamentais melhora a compreensão da tomada de decisões metabólicas.
- Os resultados contribuem para o conhecimento da fisiologia nutricional e suas bases neuronais.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput quantification of macronutrient intake in a genetically tractable model, supporting target validation in metabolic and feeding behavior research. By linking specific neuronal populations to dietary choice phenotypes, it provides mechanistic de-risking for early discovery programs focused on obesity, diabetes, and nutrient-sensing pathways. The quantitative, dye-based readout offers predictive confidence in screening workflows where nutritional homeostasis is a key biomarker.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by identifying larval neuronal populations that regulate protein and carbohydrate intake under controlled dietary conditions.
- Operational Value: Enables functional target validation through thermogenetic activation screens that link genotype to feeding behavior phenotypes.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by classifying genotypes into phenotypic classes based on macronutrient compensation patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing food intake quantification across genotypes and diet conditions.
- Operational Value: Delivers reproducible, quantitative outputs via colorimetric measurement of dye uptake, enabling reliable compound or genetic perturbation evaluation.
- Scalability: Supports platform reuse through simple larval collection, feeding, and extraction steps compatible with 96-well plate formats.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase neuronal hits to preclinical validation by establishing disease-relevant feeding phenotypes in a conserved model system.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development through quantifiable macronutrient intake metrics that reflect nutritional homeostasis.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on whether genetic perturbations normalize or exacerbate feeding imbalances across protein-to-carbohydrate ratios.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in neuronal mechanism elucidation before progressing to lead identification and preclinical validation in metabolic disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating the effect of specific neuronal activations on macronutrient balancing in larval feeding behavior.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized larval synchronization, diet exposure, and dye-based quantification that yields comparable data across conditions.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (food intake via absorbance at 600 nm) that allow comparison of conditions and statistical evaluation of genotype effects.
- Translational Research: Advances preclinical continuity by identifying neuronal regulators of dietary choice that may inform target selection in mammalian models of metabolic disorder.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable screening capability for metabolic and behavioral phenotypes due to its simplicity, low cost, and compatibility with genetic libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in nutrient-sensing pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through controlled larval staging, diet composition, and timed feeding assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early evidence of on-target metabolic effects, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their ability to restore balanced macronutrient intake in perturbed feeding phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, larval staging, and thermogenetic techniques.
- Dependent on incubation equipment, water baths for heat shock, and microplate readers for absorbance measurement.
- Necessitates cross-team standardization of larval density, diet labeling, and assay timing to minimize variability.
- Adaptation to other model systems would require modification of diet composition, dye compatibility, and larval recovery methods.
- Practical limitations include the need for dexterous larval handling and the assumption that dye uptake linearly correlates with food intake.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:32
Preparation of Third-instar Larvae (L3)
2:24
Thermogenetic Activation and No-choice Feeding Assay
3:35
Food Dye Extraction and Colorimetric Quantification of Food Consumption
5:37
Results: Amount of Food Eaten per Larva under Neuronal Thermogenetic-activation Conditions in Three Macronutrient Balancing Diets
6:49
Conclusion
