Um Modelo de Epipetogênese em Culturas de Fatia Organotipica Do Cortex-Hipocampo Rhinal

Epilepsia é uma doença neurológica prevalente. As fatias organotípicas do córtex rhinal retratam eventos epilépticos em evolução que se assemelham à epilepsia in vivo e, portanto, podem ser usados como um modelo ex vivo de episetogênese. Este sistema é, de fato, uma excelente ferramenta para monitorar a dinâmica e progressão da epipetogênese, bem como para a triagem de potenciais alvos terapêuticos para esta patologia cerebral.

Demonstrando os procedimentos comigo estarão meus alunos Francisco Meda e Mafalda Carvalho. Para colher o cérebro de um dia pós-natal seis a sete filhotes de Sprague-Dawley, primeiro lave a cabeça três vezes em cinco mililitros de GBSS. Trabalhando em um armário de biossegurança, insira firmemente fórceps afiados nas órbitas oculares para manter a cabeça no lugar e use uma tesoura de ponta fina para cortar o couro cabeludo ao longo da linha média do forame vertebral aos lóbulos frontais.

Corte o crânio da mesma maneira e ao longo da fissura transversal cerebral e use fórceps longos curvados para separar os pedaços do crânio. Use uma espátula para descartar as lâmpadas olfativas e transferir o lado dorsal do cérebro para uma placa de 60 milímetros contendo cinco mililitros de GBSS frios. Insira fórceps finos no cerebelo e insira a espátula ao longo da linha média para abrir cuidadosamente o hemisfério.

Use fórceps curvas curtas para remover cuidadosamente o excesso de tecido que cobre o hipocampo sem tocar na estrutura hipocampal, depois corte abaixo de cada hipocampo. Transfira um hemisfério de cada vez para cima e paralelo um ao outro em um pedaço de papel filtro. Coloque o papel filtro sobre um helicóptero de tecido com os hemisférios perpendiculares à lâmina e corte os hemisférios em fatias de 350 mícrons.

Transfira o tecido fatiado em uma nova placa de Petri contendo cinco mililitros de GBSS frios e use eletrodos de ponta redonda para separar cuidadosamente as fatias mantendo apenas as amostras com um córtex rhinal estruturalmente intacto e hipocampo. As áreas de DG e CA devem ser perfeitamente definidas, bem como as regiões do córtex entorhinal e perirhinal. Use uma espátula e um eletrodo de ponta redonda para colocar até quatro fatias intactas em pastilhas individuais no número apropriado de poços de uma placa de seis poços contendo 1,1 mililitros de cultura média por poço.

Use uma pipeta P20 para remover qualquer meio de dissecção em excesso de cada fatia. Coloque a placa na incubadora de cultura celular. Troque o meio a cada dois ou três dias.

Use fórceps para levantar a pastilha. Aspire o meio do poço correspondente e coloque a inserção de volta no lugar. Use uma pipeta P1000 para adicionar um mililitro de meio Celsius fresco de 37 graus para cada poço.

Prepare a configuração de eletrofisiologia em um circuito fechado. Verifique se a taxa de fluxo da câmara do tipo de interface está definida para dois mililitros por minuto e abra a válvula carb-ox. Verifique o nível de água no sistema e coloque um pedaço de papel filtro na câmara de gravação da interface para drenar qualquer meio de excesso.

Coloque um pedaço de papel de limpeza da lente sob a estrutura para fornecer meio à fatia e ligue o controlador de temperatura, amplificadores e micro manipuladores. Use uma seringa para carregar um eletrodo de vidro com fluido cerebrospinal artificial recém-preparado. Coloque o eletrodo de vidro no eletrodo receptor e espere que a temperatura na câmara de interface estabilize a 37 graus Celsius.

Trabalhando em um armário de biossegurança, coloque a pastilha em uma placa de 60 milímetros com uma gota de meio. Use uma lâmina afiada para cortar uma fatia da inserção e coloque a fatia na câmara de interface com o hipocampo para a parte inferior direita, em seguida, coloque o eletrodo receptor na camada de célula piramimpcional CA3, inicie o protocolo de aquisição contínua e registe a fatia por 30 minutos. Para realizar o ensaio de absorção de iodeto propidium, trabalhe em um armário de biossegurança.

Retire a pastilha do poço e adicione iodeto de propidium em média até uma concentração final de dois micromolar por poço. Agitar lentamente a placa antes de colocar a inserção de volta no poço, tomando cuidado para que não haja bolhas sob as fatias. Quando todas as fatias tiverem sido tratadas, devolva a placa à incubadora de cultura celular.

Para a imunossuagem das fatias, no final da incubação de iodeto propidium, aspire o meio a partir da parte inferior de cada poço e adicione um mililitro de 4% de paraformaldeído ao topo e inferior de cada inserção. Após uma hora em temperatura ambiente, lave as fatias duas vezes por 10 minutos e um mililitro de PBS por lavagem e use uma caneta hidrofóbica para desenhar dois retângulos em slides de microscópio. Use uma lâmina afiada para cortar as fatias das pastilhas e coloque uma fatia em cada retângulo.

Adicione a solução de bloqueio de permeabilização em cada fatia para uma incubação de três horas à temperatura ambiente. No final da incubação, adicione os anticorpos primários de interesse a cada fatia para uma incubação de quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, lave as fatias com PBS-Tween três vezes por 10 minutos por lavagem e incuba as fatias com os anticorpos secundários apropriados por quatro horas em temperatura ambiente.

Depois, lave as fatias como demonstrado e adicione 50 microliters de solução Hoechst a cada fatia para uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação de Hoechst, lave as fatias novamente e adicione 50 microliters de meio de montagem para cada um, em seguida, coloque uma mancha sobre as fatias e lacre com esmalte. Depois de permitir que os slides sequem por 24 horas em temperatura ambiente, visualize a absorção de iodeto imunostaining e propidium por microscopia confocal.

As fatias organotípicas do córtex rhinal retratam atividade interictal e ictal mista em sete dias in vitro. Aos 14 dias in vitro, a atividade espontânea é caracterizada por descargas ictal, que evoluem para uma atividade ictal avassaladora aos 21 dias in vitro com eventos ictal que duram mais de um minuto. A absorção de iodetodida de propidium e a imunohistoquímica contra o marcador neuronal NeuN revelaram alguma morte neuronal em sete dias em fatias in vitro que é consideravelmente aumentada em 14 dias in vitro em todas as áreas do hipocampo.

Aos sete dias in vitro, microglia ramificada com baixa expressão CD68 são mais abundantes que Iba1 positivo CD68 microglia reativa positiva. Considerando que aos 14 dias in vitro, em todas as áreas do hipocampo, a ameglia positiva CD68 Iba1 positiva M1 ameebóide excede microglia com baixa expressão CD68. Aos 14 dias in vitro, algumas células positivas de CD68 iba1 com aparência de hiper ramificação podem ser identificadas, sugerindo a possibilidade de um fenótipo de microglia anti-inflamatória M2.

Aos sete dias in vitro, a expressão de CD3 é pouco detectável, enquanto em 14 dias em fatias in vitro, a proteína fibrilar ácida ácida hipertrófica gliais positiva CD3 pode ser observada, sugerindo uma ativação progressiva dos astrócitos A1. Prepare fatias de córtex-hipocampo rhinal com extremo cuidado. Certifique-se de remover o excesso de tecido acima do hipocampo, pois pode comprometer a integridade da fatia durante o corte.

O déficit estrutural impactará negativamente na viabilidade da fatia. Além das abordagens demonstradas, uma infinidade de ensaios como análise de manchas ocidentais, PCR em tempo real e ELISA podem ser aplicados a este sistema para abordar questões específicas sobre epipetogênese.