Multiplexação automatizada da amostra usando rotulagem isotópica precursora combinada e marcação isobárica (cPILOT)

Nosso protocolo automatizado cPILOT torna mais fácil para os pesquisadores analisar amostras de forma de alto rendimento. Isso é significativo porque nos permite chegar a informações biológicas sobre doenças ou condições diferentes muito mais rapidamente. A principal vantagem dessa técnica é que ela ajuda a processar várias amostras em paralelo, reduzindo assim erros acionáveis ao usar amostras de alto rendimento.

Nosso laboratório está interessado em aplicações relacionadas ao envelhecimento e doença de Alzheimer. No entanto, essa técnica também pode ser usada para estudar qualquer doença ou desafio para onde há tecidos biológicos envolvidos. Comece ligando o aparelho de pressão positiva, o dispositivo de aquecimento e resfriamento e as bombas de vácuo.

Conecte todos os acessórios com o manipulador líquido, que mostrará uma luz azul uma vez que esteja conectada ao computador e pronta para operar. Aliquot 300 microliters do fígado homogeneizam-se em um tubo de 500 microliteres e colocá-lo em uma placa de poço de dois mililitros profundos. Armazene a amostra a quatro graus Celsius até o início do protocolo.

Abra o método no software e coloque as dicas e labware necessários em suas posições. Em seguida, cruze com o layout final do deck e clique em Seguir para continuar o protocolo. Carregue 230 pontas de microliter e aspire 90 microliters de oito ureia molar do reservatório.

Em seguida, dispensá-lo para remar um dos dois mililitros pretos placa de poço profundo. Descarregue as pontas do TL1 e repita esta etapa até que a ureia tenha sido adicionada a todos os poços. Depois de adicionar o tampão de desnaturação, use 90 dicas de microliter para transferir 10 microliters de fígado de rato homogeneizar para a placa do poço profundo.

Descarregue as pontas, depois carregue uma linha de 90 pontas de microliter e aspire três microliters de DTT a partir da placa de reagente um. Dispense dTT para as fileiras um e dois da placa do poço profundo. Sele a placa de amostra com papel alumínio e incuba-a a 37 graus Celsius por 600 segundos enquanto gira a 300 RPM.

Após a incubação, carregue uma linha de 90 pontas de microliter, aspire seis microliters de IAM da placa de reagente um na linha três, e dispense-o para remar uma das placas de amostra. Sele a placa de amostra e incuba-a a quatro graus Celsius por 30 minutos enquanto gira a 300 RPM no dispositivo de resfriamento. Em seguida, deslacria a placa de amostra e carregue uma linha de 90 pontas de microliter.

Aspire cinco microliters de cistina da placa de reagente um na linha dois e dispense-o para as linhas um e dois da placa de amostra. Incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação, realize um shake cronometrado de 1800 RPM por 30 minutos.

Em seguida, adicione 800 microliters de 20 mililitros tris tampão com 10 milimilas cloreto de cálcio em cada poço na placa de amostra para diluir a concentração de ureia para dois molares. Adicione 20 microliters de trippsina à primeira linha de uma placa de 96 poços e coloque a placa em um local especificado no convés. Depois de adicionar a trippsina à placa de amostra, selá-la e incuba-la por 15 horas a 37 graus Celsius e 600 RPM no dispositivo de aquecimento e resfriamento.

Pare a digestão aspirando 150 microlitadores de ácido fórmico de 5% da linha três da placa de ácido fórmico e distribuindo-a para a placa de amostra nas linhas um e dois. Vá para desaltar os peptídeos. Use 1070 dicas de microliter para aspirar 600 microliters de acetonitrila.

Em seguida, dispense-o nas linhas um e dois da extração de fase sólida, ou placa SPE, para ativar C-18. Em seguida, carregue a amostra digerida na placa SPE em duas passagens. Carregue duas linhas de pontas, aspire 534 microliters das amostras digeridas e dispense-as para as linhas um e dois da placa SPE.

Aplique pressão na placa e repita esta etapa até que todas as amostras estejam carregadas. Limpe os peptídeos lavando com água e diluindo os peptídeos com 60 a 40 acetonitrila em ácido fórmico de 0,1%. Em seguida, coloque a placa em cima de uma placa de coleta para elute os peptídeos usando o aparelho de pressão positiva.

Desenhe o fluxo e configure as dicas e labware necessários no software, cruze com o layout do deck e clique em Seguir para continuar o protocolo de dimetilação. Reconstitua os peptídeos em ácido acético de 1%. Para realizar a rotulagem de dimetilação, carregue 90 pontas de microliter e aspire 16 microliters de 60 mililitros de formaldeído leve da segunda fileira da placa de reagente dois.

Dispense-o para remar uma das placas de amostra e, em seguida, descarregue as pontas. Carregue uma linha de 90 pontas de microliter e aspire 16 microliters de 60 mililitros de formaldeído pesado da linha três da placa de reagente dois. Dispense-o remar dois da placa de amostra e descarregue as pontas.

Carregue duas linhas de 90 pontas de microliter e aspire 16 microliters de 24 mililitros de sódio cianoboroidido e 24 milimolar de cianoborodeuteride de sódio das linhas um e dois da placa de reagente três, em seguida, dispense os reagentes para linhas um e dois da placa de amostra para iniciar a reação de dimetilação. Descarregue as pontas e use o agitador orbital para realizar um shake cronometrado por 15 minutos a 1800 RPM. Em seguida, carregue duas linhas de 90 pontas de microliter e aspire 32 microliters de 1%amônia das linhas três e quatro da placa de reagente três.

Distribua-o nas linhas um e dois da placa de amostra dois para parar a reação. Combine volumes iguais de peptídeos dimetilados leves e pesados em uma nova placa de poço de dois mililitros profundos para desalar. Depois de desalar os peptídeos leves e pesados combinados, seque os peptídeos e realize a marcação isobárica.

Reconstitua os peptídeos com 100 microlitres de 100 milimônios tampão de bicarbonato de trietilmonium em um agitador orbital. Em seguida, use 90 pontas de microliter para aspirar 25 microliters dos peptídeos dimetilados combinados e dispensá-los à primeira linha da placa de processamento TMT. Carregue uma linha de 90 pontas de microliter e aspire 10 microliters de TMT.

Dispense-o na primeira linha da placa de processamento TMT, descarregue as pontas e, em seguida, realize um shake cronometrado por uma hora a 1800 RPM. Aspire oito microliters de hidroxilamina da linha dois da placa TEAB e dispense-a para remar uma das placas de processamento TMT. Depois de um shake de 15 minutos a 1800 RPM, transfira 30,5 microliters dos peptídeos rotulados TMT para um tubo de 1,5 mililitro.

Em seguida, proceda com a aquisição e análise dos dados de acordo com as instruções do manuscrito. Os dados representativos de MS de um peptídeo identificado em todos os 22 canais de íons de repórter de um 22 Plex combinados de rotulagem isotópica precursora e experimento de marcação isobárica são mostrados aqui. A sequência do peptídeo corresponde à betaine-homocisteína S-metiltransferase.

Os íons fragmentos mais intensos para os picos leves e pesados dimetilados foram ainda mais isolados para a fragmentação de MS3. As intensidades de íons repórteres são diretamente proporcionais à abundância de peptídeos na amostra. No geral, este experimento de rotulagem isotópica precursora combinada e marcação isobárica reduziu os tempos de processamento da amostra e tornou possível visualizar a expressão proteica em vários canais ou condições.

O gráfico de caixa de log 10 abundância versus intensidades totais de íons de repórter em todos os 22 canais mostra menor variabilidade entre poços ou inter-amostra. A avaliação da automação total foi feita examinando o erro na abundância de íons repórteres em cada proteína nas 22 amostras. O processamento de amostras com a plataforma robótica resultou em coeficientes muito baixos de variação.

Nos 3098 peptídeos, o coeficiente médio de variação na abundância de íons repórteres foi de 12,36 e 15,03% para peptídeos leves e pesados dimetilados, respectivamente. Ao tentar este protocolo, é importante ter em mente que os níveis isotópicos e isobáricos são usados em um único experimento. Assim, é necessário realizar um planejamento cuidadoso para designar cada amostra com as tags destinadas a serem utilizadas no experimento.

Este método pode ser facilmente integrado a outros sistemas robóticos, e pode ser aplicado a uma variedade de tecidos, como tecidos ou lisatos celulares e outros biofluidos.