Eletroencefalograma de vídeo contínuo durante hipoxia-isquemia em camundongos neonatais
11 de junho de 2020
Este manuscrito descreve um método para gravações contínuas de EEG de vídeo usando eletrodos de profundidade múltiplos em camundongos neonatais submetidos à hipoxia-isquemia.
A encefalopatia hipóxico-isquêmica é a causa mais comum de convulsões neonatais. Este modelo de camundongo de convulsões hipóxico-isquêmicas e videoeletroencefalografia contínua ou EEG pode ajudar a aprofundar nossa compreensão e caracterização das convulsões neonatais. Essa técnica facilita a aquisição de gravações de eletroencefalografia em vídeo de alta qualidade em um modelo de lesão neonatal e pode auxiliar em estudos futuros dos mecanismos de convulsões neonatais, resultados e testes terapêuticos.
Demonstrando o procedimento estará Pravin Wagley. Um especialista de laboratório do meu laboratório. Para cirurgia de implantação de eletrodo.
Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo da dor em um camundongo pós-parto anestesiado, coloque o camundongo em um estágio estereotáxico com um cone de nariz e use o verso da barra auricular para manter a cabeça firme. Esterilize a área da incisão no crânio com três esfoliantes alternados de betaína e etanol a 70% e use uma cortina fenestrada para cobrir o mouse, mantendo a região da incisão visível. Abra o couro cabeludo ântero-posterior ligeiramente acima dos olhos e retraia aproximadamente meio centímetro de pele.
Reposicione a cabeça no estágio estereotáxico para que a pele se puxe para fora para expor o crânio e use um cotonete para aplicar peróxido de hidrogênio. Use uma lâmina de bisturi para raspar cuidadosamente o crânio. E aplique uma gota de adesivo de aproximadamente 50 microlitros no osso.
Use o aplicador para espalhar o adesivo sobre o crânio e coloque o adesivo sob luz ultravioleta por 40 segundos. Quando o adesivo estiver endurecido, meça as coordenadas usando o bregma exposto como referência. E use uma agulha de calibre 32 para criar orifícios de eletrodo bilateralmente na região CA1 do hipocampo, bilateralmente no córtex parietal e no cerebelo.
Limpe o sangue da superfície do crânio e use o braço estereotáxico para abaixar os eletrodos presos ao conector do soquete fêmea no cérebro. Implante cada eletrodo no cérebro e fixe os eletrodos no lugar com acrílico dental. Cole o fone de ouvido no crânio com acrílico dental adicional.
Injete subcutaneamente cinco miligramas por quilograma de cetoprofeno em cada filhote. Quando todos os eletrodos estiverem presos em pelo menos metade da ninhada, devolva os filhotes à mãe. 24 horas após a implantação do eletrodo, coloque cada animal em uma câmara de acrílico personalizada de 37 graus Celsius para a gravação do EEG e use um cabo amplificador operacional flexível feito sob medida para conectar os filhotes a um sistema de monitoramento de vídeo EEG.
Use um amplificador diferencial multicanal para digitalizar os dados de EEG a 1000 Hertz com um ganho de um quilo e revise o sinal de EEG no software de análise apropriado. Em seguida, registre um EEG basal pré-lesão por 30 minutos, antes de desconectar os animais para o procedimento de litígio da artéria carótida. Após registrar os dados basais do EEG, esterilize a pele entre a mandíbula e a clavícula no lado esquerdo do pescoço com betaína e etanol, conforme demonstrado.
E faça uma incisão de aproximadamente um centímetro no lado esquerdo do pescoço. Coloque o filhote sob um microscópio de dissecação e retraia cuidadosamente o tecido subcutâneo e a pele para expor a artéria carótida. Coloque um pedaço de cinco centímetros de sutura de seda estéril sob a artéria.
Identifique o nervo vago e delicadamente separe e retraia o nervo da artéria. Manobre a sutura para que fique apenas sob a artéria. Depois de identificar o nervo vago, separe e retraia delicadamente o nervo da artéria e use uma micropinça para enfiar um pedaço de cinco centímetros de sutura de seda estéril sob a artéria.
Amarre uma sutura com nó duplo ao redor da artéria para ocluir o fluxo e cortar o excesso de sutura. Substitua o tecido subcutâneo e a pele sobre a artéria exposta e use Vetbond para selar a incisão. Em seguida, coloque o animal de volta no monitoramento contínuo de EEG em uma câmara à temperatura ambiente, colocada em um colchão de aquecimento e faça verificações pontuais de temperatura infravermelha da temperatura central do filhote para evitar abrir a câmara.
Depois de permitir que os filhotes se recuperem por uma hora com monitoramento contínuo de fração inspirada de oxigênio, lave a câmara com 60 litros por minuto de nitrogênio a 100% e 0,415 litros por minuto de oxigênio a 100%. Quando a saturação de oxigênio na câmara atingir 12%, diminua o fluxo de nitrogênio para 10 litros por minuto, mantendo o fluxo de oxigênio inalterado. Fazendo pequenos ajustes conforme necessário, mantenha a fração inspirada de oxigênio em 8% por 45 minutos.
Após 45 minutos de exposição à hipóxia, retorne a fração inspirada de oxigênio a 21% e permita que os filhotes se recuperem na câmara com monitoramento de EEG por duas horas. No final do período de gravação, desconecte os camundongos do sistema de EEG e devolva os filhotes à mãe. As gravações de EEG em vídeo permitem que os achados eletrográficos sejam correlacionados ao comportamento em vídeo.
A maioria dos eventos observados neste modelo envolve comportamentos focais unilaterais ou mistos. Durante o período hipóxico, um subconjunto de camundongos normalmente exibe atividade convulsiva não compulsiva, durante a qual os filhotes ficam imóveis com atividade convulsiva sustentada no EEG. Nesta análise, a atividade basal foi semelhante ao fundo descrito anteriormente em filhotes de camundongos P 10.
Após o litígio e antes do início da hipóxia, um subconjunto de camundongos exibiu convulsões convulsivas. Após a indução da hipóxia, a amplitude de fundo no EEG foi reduzida. E explosões intermitentes de descargas de ondas de pico foram exibidas, seguidas de supressão.
Os camundongos exibiram convulsões eletrográficas que emergem de um fundo suprimido como descargas rítmicas de ondas de pico que progrediram para se tornarem mais complexas e frequentes com ondas de pico polis. Durante a hipóxia, a análise do espectrograma de potência é notável por assimetrias entre os hemisférios isquêmico e contralateral. O hemisfério isquêmico exibe um padrão de supressão de explosão e o hemisfério contralateral exibe um fundo suprimido.
Durante a reoxigenação e recuperação, um subconjunto de camundongos continua a ter convulsões durante o restante do período de gravação. O fundo do EEG é suprimido em comparação com a linha de base após a hipóxia, com uma recuperação gradual observada durante o período de registro pós-hipóxia. Ao trabalhar com filhotes neonatais, a precisão é fundamental.
Além disso, atenção especial deve ser dada para colocar os filhotes de volta com a mãe em grupos após os procedimentos cirúrgicos. A eletroencefalografia por vídeo pode ser usada em filhotes neonatais em conjunto com histopatologia, imagem e comportamento para examinar o impacto das convulsões neonatais na cirurgia de lesão e nos resultados comportamentais.
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Visão Geral
Este manuscrito descreve um método para gravações contínuas de EEG em vídeo utilizando múltiplos eletrodos de profundidade em camundongos neonatos submetidos à hipóxia-isquemia. Esta técnica auxilia na compreensão das crises neonatais ao permitir a correlação entre achados eletrográficos e eventos comportamentais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia neonatal
- Eletrfisiologia
Antecedentes
- A encefalopatia hipóxico-isquêmica é uma causa importante de convulsões neonatais.
- Compreender os mecanismos das convulsões neonatais é crucial para o desenvolvimento de terapias.
- Um modelo murino pode fornecer informações sobre as características das convulsões.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver uma técnica de EEG em vídeo para observar crises em camundongos neonatos.
- Caracterizar as manifestações eletrográficas e comportamentais durante hipóxia-isquemia.
- Aprimorar estudos futuros que investiguem os mecanismos de convulsão neonatal.
Métodos Utilizados
- Gravações contínuas de EEG em vídeo em um modelo de lesão em camundongos neonatos.
- Camundongos neonatos são submetidos à hipóxia-isquemia cerebral após a implantação de eletrodos.
- As linhas de base são registradas antes da indução da hipóxia, seguidas pelo monitoramento da recuperação.
- Os procedimentos envolvem a implantação cirúrgica de eletrodos e monitoramento minucioso.
Resultados Principais
- Os registros de EEG revelaram alterações eletrográficas significativas durante a hipóxia.
- As crises neonatais foram caracterizadas por comportamentos focais unilaterais e padrões distintos de EEG.
- Os hemisférios isquêmicos exibiram padrões de surto-supressão em comparação com os hemisférios contralaterais.
Conclusões
- Este estudo demonstra um método valioso para observar crises neonatais em um ambiente controlado.
- Os achados permitem uma compreensão mais profunda dos mecanismos neurodesenvolvimentais subjacentes às crises.
- A abordagem tem potencial para avançar estratégias terapêuticas nas encefalopatias neonatais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A monitorização contínua por EEG em vídeo em camundongos neonatos fornece uma plataforma translacional para reduzir riscos de hipóteses terapêuticas relacionadas a convulsões no desenvolvimento pré-clínico. Ao permitir a análise sincronizada de padrões eletrográficos e comportamentais durante hipóxia-isquemia, o método apoia a validação mecanicista de compostos anticonvulsivantes e biomarcadores. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta ao modelar a semiologia de crises neonatais humanas e a evolução do EEG em um sistema relevante para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de alvos terapêuticos por meio da correlação entre biomarcadores de EEG e comportamentos convulsivos em um modelo de lesão hipóxico-isquêmica.
- Valor Operacional: Facilita a avaliação do engajamento do alvo por meio de leituras eletrográficas em tempo real durante a exposição ao composto.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem fenotípica ao detectar crises eletrográficas e supressão de fundo como leituras funcionais da disfunção do circuito neural.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera saídas quantitativas de EEG, incluindo espectrogramas de potência, frequência de descargas de ponta-onda e assimetria inter-hemisférica, para padronização do ensaio.
- Valor Operacional: Permite o rastreamento reprodutível do EEG desde a linha de base até a lesão em ninhadas, apoiando a triagem longitudinal de compostos.
- Prontidão do Ensaio: Oferece um sistema validado de EEG em camundongos neonatos para detecção de alta fidelidade de crises epilépticas e análise de tendências de fundo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Modela a evolução de crises neonatais humanas, incluindo comportamentos focais e padrões de supressão-recuperação no EEG, para alinhamento translacional de biomarcadores.
- Valor Operacional: Apoia a continuidade pré-clínica ao capturar a linha de base pré-lesão, a dinâmica da fase de lesão e a recuperação pós-hipóxia em um único fluxo de trabalho.
- Mitigação de Riscos: Permite a redução do risco de suscetibilidade a crises por meio de fenotipagem objetiva de EEG antes de testes terapêuticos avançados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao estabelecer modelos de convulsão validados por EEG antes das fases de triagem de compostos e otimização de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre alvos neurais por meio da correlação entre EEG e comportamento durante desafio hipóxico-isquêmico.
- Triagem: Fornece métricas quantitativas e resolvidas no tempo do EEG (por exemplo, supressão em rajadas, descargas espigas-ondas) para comparação dos efeitos de compostos.
- Análises: Permite análise espectral e rastreamento de tendências do traçado de fundo do EEG como indicador farmacodinâmico da modulação de alvo.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se a biomarcadores clínicos de EEG neonatal (por exemplo, supressão em rajadas, assimetria inter-hemisférica) para validade entre espécies.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de monitoramento de EEG aplicável a modelos de convulsão, neurodegeneração e transtornos neurodesenvolvimentais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao associar fenótipos eletrográficos à semiologia comportamental das crises epilépticas.
- Valor Operacional: Padroniza a aquisição e análise de EEG entre estudos, melhorando a reprodutibilidade entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço ou interrupção de projetos ao quantificar a carga de crises e análogos da depressão cortical alastrante em modelos pré-clínicos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de terapêuticas para o SNC com base em perfis objetivos de suscetibilidade a crises.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cirurgia de roedores neonatos, implante estereotáxico de eletrodos e aquisição de sinais de EEG.
- Depende da regulação estável da temperatura, controle de oxigênio e câmaras de gravação sem cabos para monitoramento prolongado.
- Necessita de protocolos padronizados de montagem de EEG, filtragem e análise espectral para comparabilidade entre estudos.
- Limitado pela janela de monitoramento contínuo de 4 horas devido às restrições impostas pela separação materna em filhotes neonatos.
- Requer validação histológica do posicionamento dos eletrodos para garantir a precisão no direcionamento do hipocampo, córtex e cerebelo.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:48
Electrode Implantation Surgery
3:08
Baseline Electroencephalogram (EEG) Setup and Recording
3:59
Left Carotid Artery Ligation
5:37
EEG and Hypoxia
6:47
Results: Representative Continuous EEG Analysis During Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice
8:50
Conclusion
