Digestão de olhos inteiros de rato para análise citométrica de fluxo multi-parameter de fagocitos mononucleares

Este protocolo é projetado para digerir olhos inteiros de camundongos em uma única suspensão celular para citometria de fluxo multiparâmetro de fagócitos mononucleares que incluem macrófagos, monócitos, microglia e células dendríticas. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de usar análise quantitativa com intensidade de fluoróforo para diferenciar tipos de células intimamente relacionados usando a expressão de marcadores de superfície celular. Nosso protocolo é otimizado para a análise da heterogeneidade de macrófagos, incluindo populações residentes e infiltrantes no modelo de neovascularização coroidal induzida por laser.

No entanto, esses conceitos e técnicas podem ser igualmente aplicados a outros modelos, como retinopatia diabética, uveíte autoimune experimental, bem como manifestações de lúpus. Ao tentar este protocolo, entender a configuração do seu citômetro é um ponto de partida crítico, pois todos os citômetros não são configurados exatamente da mesma maneira. Assim, os volumes de anticorpos conjugados fluorescentemente podem precisar ser titulados e/ou os fluoróforos podem precisar ser ajustados para otimizar o protocolo com base na configuração do citômetro.

Comece preparando o tampão de digestão de acordo com as instruções do manuscrito. Usando um microscópio de dissecção e ampliação total de 10X, remova a conjuntiva e o nervo óptico restantes dos olhos. Mova os olhos limpos para um prato de dissecação seco ou um pequeno barco de pesagem e, em seguida, faça duas feridas perfurantes com um ângulo de 90 graus entre elas através do eixo visual.

Use uma seringa com uma agulha de calibre 30 para injetar 0,15 a 0,2 mililitros de tampão de digestão na cavidade vítrea de cada olho. Pique os olhos com uma tesoura de mola e uma pinça fina e, em seguida, dissocie o tecido do cristalino com uma ruptura mecânica contundente para evitar o entupimento das pontas da pipeta nas etapas subsequentes. Enxágue a pinça e a tesoura com 0,75 mililitros de tampão de digestão e substitua o prato para cada amostra.

Use uma pipeta P1000 para transferir o conteúdo do prato para um tubo de dissociação no gelo, tomando cuidado para não perder nenhum material. Lave o prato com mais 1,5 mililitros de tampão de digestão e adicione-o ao tubo de dissociação, elevando o volume total para entre 3,25 e 3,5 mililitros. Dissocie o tecido em um dissociador eletrônico conforme descrito no manuscrito do texto, certificando-se de que todo o tecido esteja no fundo do tubo de dissociação invertido e em contato com o tampão de digestão.

Em seguida, incubar o tubo de dissociação a 37 graus Celsius e 200 RPM por 30 minutos. Repita a dissociação do tecido mais duas vezes, incubando a amostra a 37 graus Celsius e 200 RPM por 30 minutos entre as dissociações. Para interromper a reação, adicione 10 mililitros de tampão de fluxo frio e coloque os tubos de amostra no gelo.

Para criar uma suspensão de célula única, coe a reação de digestão do olho interrompido através de um filtro de 40 micrômetros colocado no topo de um tubo de centrífuga cônico de 50 mililitros. Use o êmbolo de uma seringa de 2,5 mililitros para empurrar quaisquer pedaços restantes de tecido ocular não digerido através do filtro. Lave o tubo de dissociação com 10 mililitros de tampão de fluxo e enxágue o filtro.

Em seguida, use o mesmo êmbolo para passar novamente os pedaços de tecido ocular não digeridos pelo filtro. Repita este processo com cinco mililitros de buffer de fluxo. Em seguida, lave o tubo de dissociação e filtre com 10 mililitros finais de tampão de fluxo.

Centrifugar o tubo cónico a 400 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius e decantar o sobrenadante sem perturbar o sedimento da célula. Quebre o pellet sacudindo o tubo contra outro tubo. Em seguida, adicione um mililitro de solução de lise e gire o tubo em temperatura ambiente por 30 segundos para lisar os glóbulos vermelhos.

Pare a reação com 20 mililitros de tampão de fluxo e centrifugue o tubo cônico a 400 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Decantar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Passe o tubo contra outro tubo.

Em seguida, adicione cinco mililitros de HBSS frio. Repita a centrifugação e remova o sobrenadante. Adicione 0,5 mililitros de mancha de mortos-vivos a cada amostra usando uma pipeta P1000, certificando-se de dissociar completamente o pellet.

Transfira as amostras para tubos de microtitulação de 1,2 mililitro e incube-os por 15 minutos no escuro. Enquanto isso, conte uma alíquota de 10 microlitros da amostra com azul de tripano e um hemocitômetro. Após a incubação, lave cada amostra adicionando 400 microlitros de tampão de fluxo frio.

Centrifugue os tubos em um suporte de tubos de microtitulação a 400 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius e aspire o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Ressuspenda as células completamente em 500 microlitros de tampão de fluxo frio. Em seguida, repita a centrifugação e remova o sobrenadante.

Bloqueie até cinco milhões de células vivas em 50 microlitros de bloco FC. Dissocie completamente o pellet celular e incuba-o a quatro graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, adicione 50 microlitros de solução de coloração de anticorpos a cada amostra.

Misture completamente e incube por mais 30 minutos a quatro graus Celsius. As propriedades da área de dispersão direta versus a área de dispersão lateral para todos os eventos analisados a partir de dois olhos de um único mouse são mostradas aqui. As contagens de grânulos foram limpas e confirmadas plotando PE sobre APC-Cy7, criando um aglomerado apertado de eventos positivos de PE e negativos de APC-Cy7.

Em seguida, singlets em células vivas foram identificados em todos os eventos. Os singlets foram positivamente correlacionados na altura de espalhamento frontal versus a área de espalhamento frontal, enquanto as células duplas e triplas tiveram maior área de espalhamento frontal do que a altura de espalhamento frontal. As células vivas são positivas para a área de dispersão direta e os mortos-vivos são negativos.

A estratégia inicial de gating para o delineamento de fagócitos mononucleares de células singlete vivas é mostrada aqui. Singlets vivos foram visualizados usando um gráfico CD45 versus CD11b. A ausência de células CD45 positivas no FMO CD45 confirmou a seleção do portão.

Em seguida, neutrófilos, eosinófilos, células B e células K e células T foram excluídos plotando singlets vivos CD45 positivos com porta de linhagem versus CD11b. As células CD45-dim foram diferenciadas das células CD45-high. Subconjuntos de macrófagos também foram identificados.

A microglia foi delineada nas células CD45-dim com baixa coloração de MHC2 CD64 positivo. Os macrófagos MHC2 negativos foram identificados como CD64 positivos para MHC2 negativos. Os macrófagos CD11c negativos e CD11c positivos foram demonstrados como CD64 positivos, CD11c negativos.

e CD64 positivo, CD11c positivo nas células MHC2 positivas. Verificou-se que o tratamento com laser aumentou a quantidade de macrófagos MHC2 negativos, CD11c negativos e CD11c positivos. A contagem de células dendríticas também foi regulada positivamente pelo tratamento a laser, enquanto a contagem de micróglias e monócitos não foi afetada.

A perfusão sistêmica não teve efeito sobre o número de macrófagos. Seguindo este procedimento, a classificação celular ativada por florescência, em vez da análise isolada, permite a caracterização da heterogeneidade dos macrófagos e seu impacto na função por meio de estudos transcriptômicos ou proteômicos.