Um pipeline usando eletroporação bilateral no útero para interrogar influências genéticas no comportamento dos roedores
21 de maio de 2020
O papel dos genes recentemente descobertos associados à doença na patogênese das doenças neuropsiquiátricas permanece obscuro. Um bilateral modificado na técnica de eletroporação uterómis permite a transferência genética em grandes populações de neurônios e o exame dos efeitos causadores das mudanças na expressão genética no comportamento social.
O uso desse método pode permitir a descoberta de como certas alterações na expressão gênica podem ser atribuídas a patologias associadas a doenças neurológicas. A vantagem dessa técnica é que ela ignora a necessidade de criar ou comprar linhagens genéticas de animais que podem levar anos para serem criadas e validadas. Essa técnica permite o estudo de genes implicados em distúrbios neurológicos.
Determinar como genes específicos contribuem para a patologia é um passo importante no desenvolvimento de novas terapias. A vantagem deste protocolo é aprender a manipular os embriões para que o experimentador realize a etapa de transferência de genes sem diminuir as taxas de sobrevivência. A demonstração visual deste método é importante porque os embriões são muito frágeis, por isso é útil observar como um experimentador experiente os manipula durante o procedimento.
Traga mães grávidas para a área de cirurgia pelo menos 30 minutos antes da cirurgia. Esterilize todo o local da cirurgia usando lenços germicidas esterilizados e, em seguida, etanol a 70%. Em seguida, esterilize as ferramentas de autoclave em um esterilizador de esferas de vidro.
Transfira PBS estéril para tubos cônicos de 50 mililitros e coloque os tubos em banho-maria aquecido a 38 a 40 graus Celsius. Verifique a temperatura da solução salina estéril com um termômetro. Ligue a bomba de circulação de aquecimento de água para que seja aquecida a 37 graus Celsius.
Em seguida, ligue o injetor de pressão e o eletroporador e garanta o funcionamento adequado. Gire brevemente a solução de DNA de plasma em uma centrífuga de mesa e coloque-a no gelo. Puxe as pipetas de vidro em um extrator de pipetas de modo que a ponta da pipeta de vidro puxada tenha cerca de 50 micrômetros de diâmetro.
Em seguida, encha a pipeta com 20 a 40 microlitros de solução de DNA. Configure todos os itens necessários para a cirurgia, incluindo loção depilatória, iodo, etanol 70%, cotonetes, colírios, suturas e gaze. Prepare uma ficha cirúrgica e preencha as informações necessárias.
Pese o mouse antes da cirurgia e registre o peso. Depois de anestesiar o camundongo, administre analgésicos pré-operatórios e remova o pelo do abdômen usando creme depilatório ou navalha. Esterilize o abdômen esfregando-o com iodopovidona e etanol 70% três vezes.
Crie um campo estéril ao redor do abdômen com gaze e drapeados estéreis. Faça uma incisão na linha média na pele abdominal enquanto levanta a pele com uma pinça para evitar cortar o músculo. Em seguida, levante o músculo e corte-o, tomando cuidado para evitar cortar órgãos vitais.
Puxe cuidadosamente os chifres uterinos para fora da barragem usando uma pinça com anéis e coloque-os suavemente no campo estéril, certificando-se de que estejam apoiados com acolchoamento e não puxando muito longe da barragem. Mantenha o corno uterino umedecido durante o resto da cirurgia com o PBS estéril pré-aquecido. Posicione um embrião com uma pinça ou dedos, insira cuidadosamente a pipeta de vidro puxada na vertical lateral e injete dois a três microlitros em cada ventrículo, inserindo a pipeta em um e depois no outro ventrículo.
O ventrículo foi direcionado com sucesso se uma forma crescente estiver presente após a injeção. Para transfectar as células bilateralmente no córtex frontal, posicione os dois eletrodos negativos nas laterais da cabeça do embrião logo lateral e ligeiramente caudal aos ventrículos laterais e posicione o eletrodo positivo entre os olhos logo na frente do focinho em desenvolvimento. Certifique-se de que o embrião esteja generosamente umedecido e aplique quatro pulsos quadrados.
Injete e eletropore todos os embriões, indo um a um para que cada embrião seja eletroporado imediatamente após a injeção da solução de DNA. Depois que todos os embriões forem eletroporados, insira cuidadosamente os cornos uterinos de volta na cavidade abdominal. Cubra a cavidade abdominal com PBS estéril para ajudar na colocação do chifre uterino.
Encha a cavidade abdominal com PBS estéril para que não permaneçam bolsas de ar após a conclusão da sutura. Suturar o músculo com suturas absorvíveis e a pele com suturas de seda não absorvíveis. Deixe a barragem se recuperar totalmente em uma câmara aquecida por pelo menos uma hora.
Verifique as barragens regularmente nas próximas 48 horas. À medida que a barragem se recupera da anestesia e recupera a consciência, ela começa a se mover e mexer. Este método foi usado para transfectar aproximadamente 5.000 neurônios piramidais da camada 2/3 com o plasmídeo pCAG-GFP.
A maioria dessas células estava localizada nas regiões corticais frontais. Um exemplo representativo mostra a distribuição caudal rostral de neurônios transfectados em um camundongo controle adulto, confirmando a capacidade dos IUEs bilaterais de direcionar e rotular geneticamente grandes populações de neurônios piramidais no córtex frontal. A primeira parte da tarefa de interação materna testa a capacidade de camundongos transfectados P18 de controle de encontrar a cama do ninho.
Os camundongos de controle passaram mais tempo explorando a cama do ninho do que explorando a cama fresca, sugerindo que eles têm habilidades sensório-motoras intactas e comportamento exploratório. A segunda parte da tarefa aproveita a tendência dos ratos de serem motivados a interagir com a mãe. Nessa tarefa, os filhotes passavam a maior parte do tempo perto da mãe, enquanto passavam significativamente menos tempo explorando o copo vazio ou a cama do ninho.
Camundongos de controle adultos passaram aproximadamente 35% do tempo explorando um novo objeto. Quando apresentados a um novo e a um objeto familiar, os ratos adultos passaram mais tempo explorando o novo objeto. Na tarefa de sociabilidade, os camundongos adultos de controle passaram tempo semelhante explorando um novo rato e um copo vazio.
Esse comportamento foi rastreado automaticamente com o software DeepLabCut, rotulando vários pontos em um mouse, incluindo membros, centróide, cabeça e orelhas. O software também foi usado para determinar quando os camundongos estavam empinando, examinando o comprimento do corpo do camundongo, uma vez que essa distância se torna menor quando o camundongo se levanta. Após este procedimento, muitas questões moleculares celulares podem ser respondidas examinando o tecido e testando diferentes medidas, como densidade da coluna vertebral ou níveis de expressão de várias proteínas.
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Visão Geral
Este estudo investiga o papel de genes associados a doenças na patogênese de transtornos neuropsiquiátricos por meio de uma técnica modificada de eletroporação intraútero bilateral. Esta técnica facilita a transferência gênica em grandes populações neuronais, permitindo a análise de alterações na expressão gênica e seus efeitos sobre o comportamento social.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Transtornos neuropsiquiátricos
- Expressão gênica e patologia
- Avaliação do comportamento social
Antecedentes
- Compreender os papéis dos genes em doenças neurológicas é fundamental para o desenvolvimento de terapias.
- Os métodos convencionais para criar linhagens animais genéticas são demorados e exigem muitos recursos.
- A técnica modificada de eletroporação aumenta as taxas de sobrevivência de embriões durante os experimentos.
Métodos Utilizados
- Eletroporação bilateral in utero para transferência gênica
- Embriões de camundongo
- Procedimentos envolvendo injeção de DNA e eletroporação
Resultados Principais
- Transfecção bem-sucedida de neurônios piramidais da camada 2/3 com um plasmídeo GFP no córtex frontal.
- Os camundongos controle exibiram comportamento exploratório normal e interações sociais, indicando habilidades sensoriomotoras preservadas.
- A metodologia permite investigações celulares e moleculares subsequentes.
Conclusões
- O estudo demonstra um método confiável para alterar a expressão gênica em embriões de camundongo, auxiliando na compreensão de transtornos neuropsiquiátricos.
- Essa técnica é relevante para pesquisas futuras em genética e biologia do desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A eletroporação bilateral in utero permite manipulação genética rápida e específica por tipo celular em modelos de roedores, evitando o desenvolvimento demorado de linhagens transgênicas. Esta abordagem acelera a investigação da função gênica no neurodesenvolvimento e no comportamento, apoiando a validação precoce de alvos para portfólios de doenças neurológicas. O método aumenta a confiança preditiva na associação de perturbações genéticas a fenótipos funcionais, orientando decisões de avanço ajustadas ao risco.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite o teste direto da função de genes associados a doenças in vivo sem a criação de linhagens transgênicas.
- Auxilia na redução de riscos mecanicistas ao esclarecer as contribuições dos genes para o desenvolvimento de circuitos neurais e comportamento.
- Facilita a verificação rápida de hipóteses para novos alvos genéticos identificados em estudos de associação.
- Aprimora a confiança preditiva na seleção de alvos para indicações neuropsiquiátricas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara modelos validados de roedores para ensaios comportamentais e moleculares subsequentes.
- Padroniza a entrega de genes a grandes populações neuronais, favorecendo a reprodutibilidade.
- Permite leituras comportamentais quantitativas utilizando software automatizado de rastreamento.
- Permite a avaliação escalonável de múltiplos construtos genéticos em paralelo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a manipulação genética aos circuitos neurais e desfechos comportamentais relevantes para a doença.
- Proporciona continuidade da descoberta genética à validação funcional em modelos pré-clínicos.
- Permite a avaliação de biomarcadores translacionais, como expressão proteica e densidade de espinhos dendríticos.
- Reduz os riscos na progressão de alvos genéticos ao vincular alterações moleculares a fenótipos observáveis.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta, desde a verificação inicial de hipóteses genéticas até a validação comportamental pré-clínica, apoiando a identificação de compostos ativos e a redução de riscos mecanicistas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a investigação baseada em hipóteses da função gênica no desenvolvimento neural e no comportamento.
- Triagem: Fornece saídas comportamentais e moleculares reprodutíveis e quantitativas para análise comparativa.
- Análises: Permite a medição automatizada de desfechos comportamentais e marcadores moleculares.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas de associação genética a desfechos funcionais em sistemas relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável para avaliação rápida de diversos alvos genéticos em indicações neurológicas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Otimiza fluxos de trabalho de manipulação genética e melhora a reprodutibilidade.
- Valor Estratégico: Acelera decisões de prosseguimento ou interrupção e melhora a eficiência do capital na fase inicial de descoberta.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos genéticos em programas para doenças neurológicas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em manipulação embrionária e técnica cirúrgica.
- Exige acesso a equipamentos de eletroporação, instrumentos cirúrgicos estéreis e software de rastreamento comportamental.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para reprodutibilidade e comparabilidade dos dados.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes linhagens de roedores ou estágios de desenvolvimento.
- A fragilidade dos embriões e as taxas de sobrevivência são limitações práticas que exigem manipulação qualificada.
