Abertura da Barreira Hematoencefálica Induzida por Ultrassom Focalizado para Atingir Estruturas Cerebrais e Avaliar a Neuromodulação Quimiogenética

Este protocolo delineia as etapas necessárias para a entrega gênica através da abertura da barreira hematoencefálica (BHE) por ultrassom focado, avaliação da expressão gênica resultante e mensuração da atividade neuromoduladora de receptores quimiogenéticos por meio de testes histológicos.

Nosso protocolo permite o direcionamento de precisão submilimétrica do ultrassom focalizado em camundongos. Ele nos permite direcionar o ultrassom usando peças impressas em 3D baratas sem a necessidade de usar cirurgia ou equipamento de ultrassom compatível com ressonância magnética. A abertura da barreira hematoencefálica por ultrassom focalizado pode ser bastante complicada no início.

É fundamental que o transdutor seja devidamente acoplado ao animal usando gel desgaseificado ou água e que as microbolhas não sejam colapsadas durante a injeção. Demonstrando o procedimento estará Richard Li, um estudante de pós-graduação da Caltech. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo pedal em um camundongo anestesiado, use 10 unidades por mililitro de solução salina heparinizada para lavar um cateter limpo de calibre 25 a 35 e use uma almofada de etanol para desinfetar a cauda do animal.

Insira o cateter em uma veia da cauda lateral e use cola de tecido para prender o cateter no lugar. Se a agulha tiver sido colocada corretamente, um refluxo de sangue será observado no cateter. Quando a cola secar, remova os pelos da cabeça do animal com creme depilador e coloque o mouse em um carro de ressonância magnética impresso em 3D, montando os dentes da frente em uma barra de mordida com a cabeça dentro de um cone nasal.

Prenda as barras embotadas ao crânio com uma quantidade segura de pressão e observe a respiração por 30 segundos para confirmar que o animal está respirando livremente a uma taxa de uma respiração por segundo. Conecte o guia de mira às barras auriculares e verifique a respiração novamente. Coloque o carro de ressonância magnética em um suporte de ressonância magnética e coloque o suporte dentro do orifício de um ímã.

Em seguida, adquira uma sequência de ressonância magnética para localizar o mouse no scanner, usando a sequência de fotos rápidas de baixo ângulo 3D para obter imagens de todo o cérebro. Para realizar um direcionamento guiado por ressonância magnética, coloque o carro dentro de um instrumento estereotáxico e use um bloco de metal com fita dupla-face para prender o bloco no lugar contra dois postes de suporte do instrumento estereotáxico. Transfira as imagens de ressonância magnética para um computador com um programa de software de orientação por ultrassom focalizado em execução e abra as imagens.

Quando todas as imagens tiverem sido carregadas, clique com o botão direito do mouse e clique em reformatar para reformatar a imagem em três eixos. Clique com o botão direito do mouse para localizar o transdutor no guia de direcionamento circular. Na visão sagital, ajuste a posição vertical do transdutor virtual para levar em conta a espessura do banho-maria e do invólucro do transdutor.

Indique as áreas a serem visadas no planejador de trajetória e anote as coordenadas em uma planilha. Disque a profundidade desejada do direcionamento e anote as coordenadas conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, clique em enviar trajetória e execute para atingir cada um dos pontos.

Para correlacionar as coordenadas de uma ressonância magnética com a estrutura estereotáxica, coloque o transdutor montado personalizado sobre uma guia de mira e translade até que cada um dos três parafusos de mira possa passar pelo suporte do transdutor e pela guia de mira. Confirme se os parafusos não estão sob tensão ou inclinação e translade o transdutor 10,56 milímetros para frente na direção ântero-posterior até que o transdutor esteja localizado no ponto em que o centro de uma guia de direcionamento aparece na ressonância magnética. Em seguida, determine a distância do centro do transdutor virtual até a região de destino e use o quadro para mover o transdutor para essas coordenadas.

Para preparar a solução injetável, carregue 800 microlitros de solução salina e 100 microlitros de agente de contraste de ressonância magnética em um tubo de 1,5 mililitro com mistura. Em seguida, leve uma solução de microbolhas não ativada à temperatura ambiente, antes de ativar as microbolhas por 45 segundos em um dispositivo de ativação de microbolhas. Após a ativação, carregue lentamente 100 microlitros de microbolhas do meio da solução em uma seringa de tuberculina de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 21 e adicione 80 microlitros das microbolhas na solução do agente de contraste.

Misture a solução preparada invertendo suavemente o tubo de 1,5 mililitro por 15 segundos para evitar a flutuação. No final da mistura, coloque 200 microlitros da solução de microbolhas em uma seringa sem agulha e inverta a seringa. Pressione e retraia o êmbolo para misturar e colocar uma agulha de calibre 30 na seringa enquanto ela ainda está invertida.

Em seguida, empurre lentamente a solução de microbolhas até que as gotículas apareçam no final da agulha. Assim que as microbolhas estiverem prontas, defina a duração do pulso para a insonação para 10 milissegundos, com 120 repetições a cada segundo, com 0,3 a 0,45 mega pascals de pressão no crânio. Remova a guia de direcionamento e aplique gel de ultrassom desgaseificado na cabeça do mouse, tomando cuidado para evitar bolhas.

Abaixe o transdutor até que ele seja colocado diretamente na parte plana do suporte da barra auricular e disque as coordenadas nos instrumentos estereotáxicos. Dilua o vírus adeno-associado de interesse para uma concentração de 0,5 a 2 vezes 10 elevado a 10 partículas virais por grama de peso corporal e carregue as partículas do vírus em uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 30. Injete a solução no cateter da veia da cauda e injete 80 microlitros da solução de microbolhas no camundongo.

Para avaliar a abertura da barreira hematoencefálica por ressonância magnética, registre uma sequência rápida de disparos de baixo ângulo, conforme demonstrado. Para estimulação DREADD, dissolva o N-óxido de clozapina em solução salina estéril na concentração de um miligrama por mililitro e injete-o por via intraperitoneal. 15 a 45 minutos após o parto, comece a registrar a atividade comportamental do animal.

Para análise de ativação neuronal, use tecido cerebral. Seguindo o protocolo demonstrado, um aumento do sinal T1 pode ser alcançado na região do hipocampo e em outras partes do cérebro. Conforme observado, a imunocoloração contra mCherry leva a uma detecção mais confiável da expressão de DREADD Neste procedimento, lembre-se de manusear as microbolhas com cuidado e garantir que o animal esteja estável durante a ressonância magnética e a insonação.