Caracterização de Células Imunes e Mediadores Proinflamatórios no Ambiente Pulmonar

Esse protocolo pode ser usado para investigar alterações no ambiente pulmonar após acidente vascular cerebral isquêmico. Este método permite a identificação de 13 tipos de células imunes pulmonares e 13 citocinas e quimiocinas diferentes no mesmo camundongo por meio de análise por citometria de fluxo. Este método tem sido utilizado para avaliar alterações no ambiente pulmonar após acidente vascular cerebral isquêmico.

No entanto, também pode servir para investigar alterações durante a resposta alérgica ou infecção. Para realizar a perfusão transcárdica de corpo inteiro, confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal em um camundongo anestesiado e prenda o mouse a uma plataforma cirúrgica. Molhe o pelo com etanol a 70% para reduzir a distribuição do pelo na cavidade corporal e faça uma incisão vertical na linha média da pele para expor o peritônio intacto, interrompendo a incisão assim que a cavidade torácica for atingida.

Use uma tesoura de dissecção fina para fazer uma incisão na linha média do peritônio parando na cavidade torácica antes e use uma pinça para agarrar a extremidade distal do esterno. Use a tesoura para cortar o diafragma sem danificar o coração, os pulmões ou a vasculatura. Quando os tecidos subjacentes estiverem visíveis, faça uma incisão na caixa torácica e prenda as laterais das costelas para que o coração e os pulmões fiquem totalmente expostos.

Faça cuidadosamente uma pequena incisão no átrio direito perto do arco aórtico para servir como fluxo de saída para a perfusão e insira rápida mas suavemente uma agulha de calibre 25 na superfície superior distal do ventrículo esquerdo. Assim que a agulha estiver no lugar, lave suavemente 10 mililitros de PBS frio no coração. O tecido deve começar a limpar o sangue.

Quando todo o volume tiver sido entregue, perfunda uma segunda alíquota de 10 mililitros de PBS frio até que o fígado exiba uma aparência marrom clara e os pulmões tenham passado de um rosa avermelhado para uma cor predominantemente branca. Usando uma pinça e uma tesoura de dissecção fina, remova cuidadosamente todos os tecidos circundantes antes de separar os lobos pulmonares e colocá-los em uma placa de Petri contendo um a dois mililitros de células pulmonares frias, médias em gelo. Para preparar o tecido pulmonar para matrizes de esferas multiplex, adicione 200 microlitros de tampão de homogeneização a frio a um tubo de dois mililitros contendo três esferas estéreis de zircônia / sílica de 2,3 mililitros e pese o lóbulo pulmonar de interesse.

Transfira 50 a 100 miligramas de tecido pulmonar para o tubo pré-resfriado de grânulos e tampão de homogeneização e homogeneize o lóbulo usando um homogeneizador à base de grânulos a 4.000 rotações por minuto por pelo menos dois minutos. Quando o tecido estiver completamente homogeneizado, centrifugue o tubo para sedimentar o tecido e transfira o sobrenadante para um microtubo pré-resfriado de 1,5 mililitro no gelo. Para dissociação do tecido pulmonar, decantar cuidadosamente o meio das células pulmonares do lobo pulmonar restante e inserir uma agulha de calibre 25 no tecido.

Injete volumes de 200 a 250 microlitros de tampão de dissociação em cada lobo pulmonar para inflar os pulmões até que cada um dos lobos tenha sido injetado duas a três vezes. Após uma incubação de dois minutos à temperatura ambiente, use uma tesoura de dissecção fina para picar os pulmões em pedaços pequenos e transfira a solução de tecido para um tubo de 15 mililitros. Adicione seis mililitros de tampão de dissociação adicional à amostra e vortex vigorosamente por um minuto.

Em seguida, incube os pedaços de tecido por 45 minutos a 37 graus Celsius, um vórtice a cada sete a oito minutos. No final da incubação, vortex a amostra vigorosamente por um minuto e passe a amostra por um filtro de células de 100 mícrons para remover qualquer tecido conjuntivo e intersticial indesejado residual. Colete o tecido por centrifugação e ressuspenda ao pellet com cinco mililitros de meio pulmonar frio.

Centrifugue novamente a amostra e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio de pulmão frio com vórtice suave. Em seguida, filtre as células através de um filtro de 100 mícrons antes de contar. Para avaliar as populações de células imunes dentro do tecido pulmonar isolado, semeie de uma a duas vezes 10 elevado ao sexto anticorpo de células de potência colocado no número apropriado de poços com uma placa inferior redonda de 96 poços e descarte as células no fundo da placa por centrifugação.

Adicione 25 microlitros do coquetel de anticorpos apropriado em tampão FACS frio a cada poço e misture com carícias suaves de tubos. Após 20 minutos, ressuspenda as células em 100 microlitros de tampão FACS frio por poço e transfira as amostras para tubos individuais de fundo redondo de poliestireno de cinco mililitros contendo 150 microlitros de tampão FACS adicional por tubo. Em seguida, analise imediatamente as amostras em um citômetro de fluxo de acordo com os protocolos padrão de análise de citometria de fluxo.

Nesta análise representativa, 13 populações diferentes de células imunes foram identificadas nos pulmões usando três conjuntos de cinco a sete combinações de anticorpos. As células mortas foram excluídas usando uma coloração de mortos-vivos e os diferentes tipos de células imunes foram distinguidos usando os anticorpos e marcadores listados na tabela. Macrófagos alveolares e intersticiais, células dendríticas CD103 positivas e CD11B positivas e eosinófilos foram identificados no primeiro conjunto.

Monócitos e neutrófilos pró-inflamatórios foram identificados no conjunto dois e células T CD4 positivas e CD8 positivas, células B, células dendríticas plasmocitoides, células NK e células NKT foram identificadas no conjunto três. O número total de células viáveis, a porcentagem de células CD45 positivas e o número total de células CD45 positivas obtidas foram semelhantes entre as populações de células que foram isoladas conforme demonstrado e as populações de células que foram isoladas usando um dissociador de tecido disponível comercialmente. Além disso, a porcentagem de morte celular entre as células CD45 positivas foi inferior a 10% para ambos os protocolos, sugerindo que o protocolo demonstrado facilita uma recuperação de alto rendimento e alta qualidade celular sem o auxílio de um dissociador tecidual automatizado.

Além disso, o uso de um ensaio multiplex disponível comercialmente, juntamente com a análise de citometria de fluxo, permite que a concentração de quimiocina em cada amostra por miligrama de tecido seja determinada. A concentração de colagenase D, o tempo de incubação e a temperatura usados durante o isolamento de célula única afetam criticamente a recuperação da célula imune.