Biofuncionalização de Nanomateriais Magnéticos
16 de julho de 2020
Neste trabalho, fornecemos um protocolo para biofuncionalizar nanomateriais magnéticos com anticorpos para direcionamento celular específico. Como exemplos, utilizamos nanofios de ferro para atingir células cancerígenas.
A principal característica deste protocolo, ele pode ser aplicado em uma ampla gama de nanomateriais de óxido de ferro-ferro. Além disso, pode ser aplicado em nanomateriais multi-segmentados, como nanofios de ferro-ouro. Este protocolo pode ser realizado com segurança em qualquer laboratório biológico padrão.
As principais vantagens desta técnica de biofuncionalização é a capacidade de produzir um nanomaterial especificamente direcionado com base em uma forte ligação covalente entre o nanofio e os anticorpos. Comece cortando os discos de alumínio em pedaços pequenos com uma lâmina de borda única e um pequeno martelo. Coloque as peças cortadas em um tubo de dois mililitros e encha-o com um mililitro de hidróxido de sódio de um molar, certificando-se de que todas as peças de alumínio estejam cobertas.
Deixar o tubo à temperatura ambiente numa hotte química durante 30 minutos. Após a incubação, remova as peças de alumínio com uma pinça e mantenha os nanofios liberados em hidróxido de sódio por mais 30 minutos. Coloque o tubo em uma cremalheira seca magnética, aguarde dois minutos e substitua a solução por hidróxido de sódio fresco.
Sonicar o tubo de dois mililitros com os nanofios por 30 segundos e deixá-lo por uma hora dentro de uma capela química. Repita esta etapa pelo menos quatro vezes. Quando terminar, coloque o tubo de dois mililitros no rack magnético, descarte o hidróxido de sódio e substitua-o por um mililitro de etanol absoluto.
Sonicar os nanofios por 30 segundos, colocar o tubo no rack magnético e substituir o etanol. Repita a lavagem com etanol pelo menos quatro vezes. Depois de lavar os nanofios, transfira-os para um tubo de vidro de cinco mililitros com uma pipeta de um mililitro.
Adicione 100 microlitros de APTES à solução de nanofios e vórtice o tubo de vidro por 20 segundos. Coloque o tubo em um banho ultrassônico e sonice-o por uma hora. Em seguida, retire o tubo do banho e adicione 400 microlitros de água deionizada e 20 microlitros de hidróxido de sódio monomolar.
Repita a sonicação de uma hora. Depois de retirar o tubo de vidro do banho ultrassônico, coloque-o ao lado de um ímã para coletar os nanofios. Substituir o sobrenadante por um mililitro de etanol absoluto fresco e sonicar o tubo durante 10 segundos.
Repita a lavagem com etanol e a sonicação duas vezes. Dissolva 0,4 miligramas de EDC e 1,1 miligramas de Sulfo-NHS e um mililitro de MES em um tubo de dois mililitros. Em outro tubo de dois mililitros, adicione 960 microlitros de PBS 0,1 molar e adicione 30 microlitros de anticorpo anti-CD44.
Em seguida, adicione 10 microlitros da mistura EDC/Sulfo-NHS previamente preparada a este tubo. Coloque o tubo de anticorpos em um agitador e agite-o a 10 vezes G por 15 minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, coloque um ímã próximo ao tubo com os nanofios revestidos com APTES por dois minutos, descarte o etanol e substitua-o por PBS.
Sonicar os nanofios por 10 segundos. Após a última lavagem com PBS, colete os nanofios e transfira a solução de anticorpos ativados para o tubo dos nanofios. Em seguida, sonice por 10 segundos.
Substitua o tubo no rotador durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, colete os nanofios com o ímã e descarte o sobrenadante. Adicione um mililitro de 2% BSA e incube o tubo por uma hora a quatro graus Celsius para bloquear a reação.
A espectroscopia de perda de energia de elétrons ou mapas EELS podem ser usados para visualizar os átomos de silício na superfície do nanofio e confirmar a presença do revestimento APTES. Nos nanofios não revestidos, os átomos de ferro aparecem em azul escuro e os átomos mistos de ferro e oxigênio são em azul claro. O mapeamento EELS correspondente de nanofios não revestidos mostra uma intensidade mais alta de ferro versus oxigênio no centro do que na superfície, indicando uma estrutura de óxido de ferro-ferro.
O mapeamento demonstrou que a camada de óxido de ferro consiste em mais óxido de ferro (II, III) do que óxido de ferro (III). A antigenicidade dos anticorpos anexados foi confirmada usando os ensaios de imunoprecipitação e western blot. O ensaio BCA foi utilizado para quantificar o número de anticorpos nos nanofios.
A medição do potencial zeta foi usada para elucidar a funcionalização da superfície. O grupo amina terminal no APTES reduziu a carga negativa em comparação com nanofios não revestidos. A funcionalização do anticorpo reduziu ainda mais a carga.
O direcionamento celular específico dos nanofios funcionalizados por anticorpos foi confirmado usando microscopia confocal. As Figuras A e B representam as imagens de microscopia de campo claro dos espécimes C e D, respectivamente. A cor vermelha corresponde à representação da membrana celular, o azul representa o núcleo e os aglomerados verdes representam a presença de nanofios CD44 direcionados e anexados.
Além disso, o ensaio de viabilidade celular foi usado para verificar se os nanofios não revestidos, revestidos com APTES e revestidos com anticorpos eram biocompatíveis. No revestimento do processo APTES, é muito importante adicionar a água deionizada antes da solução de hidróxido de sódio para melhorar a ligação entre a molécula APTES e os nanofios. Além disso, durante o processo de biofuncionalização, é necessário lavar o nanofio com tampão PBS algumas vezes para aumentar a ligação covalente entre o anticorpo e os nanofios.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para biofuncionalizar nanomateriais magnéticos com anticorpos, visando obter direcionamento celular específico, particularmente utilizando nanofios de ferro para direcionar células cancerígenas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Nanotecnologia
- Biomateriais
- Biologia Celular
Contexto
- Os nanomateriais magnéticos possuem aplicações potenciais na liberação direcionada de fármacos.
- A biofuncionalização aumenta a especificidade dos nanomateriais para tipos celulares específicos.
- Os nanofios de ferro podem ser modificados para melhorar suas capacidades de direcionamento.
- Compreender a interação entre nanomateriais e sistemas biológicos é crucial para sua aplicação.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo confiável para a biofuncionalização de nanofios de ferro.
- Demonstrar a eficácia de nanofios funcionalizados com anticorpos no direcionamento de células cancerígenas.
- Avaliar a biocompatibilidade dos nanofios modificados.
Métodos Utilizados
- Preparação de nanofios de ferro por meio de processos químicos.
- Revestimento de nanofios com APTES para facilitar a ligação de anticorpos.
- Uso de EDC/Sulfo-NHS para ativar anticorpos.
- Caracterização de nanofios utilizando espectroscopia de perda de energia de elétrons e medidas de potencial zeta.
Resultados Principais
- O protocolo produziu com sucesso nanofios de ferro funcionalizados com anticorpos.
- A microscopia confocal confirmou o direcionamento específico das células cancerígenas pelos nanofios modificados.
- Ensaios de biocompatibilidade indicaram que os nanofios eram seguros para aplicações celulares.
- A funcionalização da superfície foi validada por meio de diversas técnicas de caracterização.
Conclusões
- Essa técnica de biofuncionalização permite a entrega direcionada de agentes terapêuticos.
- O protocolo pode ser adaptado para diversos tipos de nanomateriais.
- Aplicações futuras podem incluir terapias direcionadas contra o câncer utilizando esses nanofios.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a produção de nanomateriais magnéticos especificamente direcionados por meio da ligação covalente de anticorpos, apoiando o desenvolvimento de terapêuticas e diagnósticos de precisão. Ao aumentar a especificidade do alvo e permitir o controle magnético remoto, o método contribui para a redução de riscos mecanicistas em programas oncológicos de fase inicial. A abordagem melhora a confiança preditiva em intervenções baseadas em nanomateriais ao validar tanto a eficiência de direcionamento quanto a biocompatibilidade.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmácia
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio do direcionamento a marcadores específicos da superfície celular, como a superexpressão de CD44 em células cancerosas.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos ao confirmar a antigenicidade de anticorpos ligados por meio de imunoprecipitação e western blot.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao demonstrar direcionamento específico e biocompatibilidade em modelos celulares relevantes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz sistemas biológicos validados, prontos para fluxos de trabalho subsequentes, com funcionalização da superfície confirmada por medidas de EELS e potencial zeta.
- Valor Operacional: Permite a padronização e reprodutibilidade de ensaios por meio de etapas controladas de ligação covalente e bloqueio usando BSA.
- Valor de Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em nanomateriais de ferro-óxido de ferro e segmentados múltiplos, incluindo nanofios de ferro-ouro.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Demonstra a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica por meio do rastreamento por microscopia confocal e ensaios de viabilidade celular.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões de prosseguir ou não ao verificar a biocompatibilidade de nanomateriais não revestidos, revestidos com APTES e revestidos com anticorpos.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Reduz a ambiguidade nos mecanismos de direcionamento ao associar a fixação do anticorpo à ligação específica em células observada nas imagens.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes, permitindo a avaliação confiável de compostos por meio de nanomateriais quantificáveis e magneticamente responsivos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir a entrega específica em células cancerígenas positivas para CD44.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios e resultados quantitativos por meio de alterações no potencial zeta e modificação superficial confirmada por EELS.
- Análises: Fornece leituras mensuráveis, como a quantidade de anticorpos por ensaio BCA e a captação celular por microscopia confocal.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio da biocompatibilidade demonstrada e do direcionamento específico em modelos celulares.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável para gerar nanomateriais direcionados em diversos projetos e formatos de nanomateriais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista nas interações entre nanomateriais e células.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade da biofuncionalização em diferentes ambientes laboratoriais.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre prosseguimento ou interrupção de projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados do desenvolvimento de nanoterapêuticos.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, com base em perfis validados de direcionamento e segurança.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manuseio de nanomateriais, conjugação de anticorpos e técnicas de caracterização de superfície.
- Depende do acesso a banhos ultrassônicos, suportes magnéticos e instrumentação para EELS, potencial zeta e análise de western blot.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de lavagem, bloqueio e incubação para garantir consistência entre lotes.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes formas, composições ou químicas de superfície de nanomateriais.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de sequenciamento cuidadoso dos reagentes (por exemplo, água desionizada antes do hidróxido de sódio) para melhorar a ligação de APTES.
