Name: Visualização da Degeneração Sináptica em Drosophila Adulta em Associação com Neurodegeneração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprenda a dissecar o músculo dorsal longitudinal em Drosophila melanogaster para avaliar a integridade das junções neuromusculares. Este método permite estudar doenças neurodegenerativas como ALS, Parkinson e Alzheimer.

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Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01 NS110727) para d.T.B.

1. Geração de moscas transgênicas
<ol><li>Para gerar moscas transgênicas para este experimento, colete ok371-Gal425 moscas fêmeas virgens e machos de UAS-TDP-43M337V 26 (Figura 1A) por moscas anestesiadas com CO2 em uma almofada para classificar.</li>
	<li>Classificar moscas anestesiadas em frascos com mídia padrão Drosophila para a cruz. Coloque frascos rotulados a 25 °C para a próxima geração emergir. NOTA: Limpe os adultos dos frascos antes que a prole surja para garantir o genótipo adequado.</li>
	<li>Uma vez que a prole emerge, colete as moscas transgênicas em frascos e classifique por sexo para começar o envelhecimento para condições experimentais.</li>
	<li>Uma vez que as moscas são coletadas, transfira moscas para alimentos frescos a cada 2 dias até que as moscas têm 21 dias de idade.</li>
</ol>2. Preparação para dissecação
<ol><li>Para se preparar para dissecções, obtenha soro fisiológico tampão de fosfato de temperatura ambiente (1x PBS), um prato de dissecção de 10 cm revestido com um elastômero de silicone, tesoura de dissecação de borda reta, um conjunto de fórceps de dissecção contundente, uma pipeta P200 e pontas de pipeta, tubos de microcentrifuge de 2,0 mL, tesoura de escritório padrão, 70% etanol, uma placa de Petri de 6 cm, e 32% de formaldeído diluído a 4% com 1x PBS.</li>
	<li>Rotule os tubos para cada genótipo ou condição e adicione 900 μL de 1x PBS (temperatura da sala) e 150 μL de 32% de formaldeído a cada tubo. Use luvas e óculos de segurança ao preparar o fixador de 4% de formaldeído.</li>
	<li>Anesthetize 6\u201210 voa por grupo diretamente do frasco com CO2 e submersa voa em uma placa de Petri de 6 cm com 70% de etanol. A prensa voa para baixo no etanol usando uma escova de tinta para garantir que os espécimes estejam totalmente submersos. Isso removerá a camada de óleo na cutícula externa.</li>
</ol>3. Isolamento e fixação do tórax
<ol><li>Antes de dissecar cada amostra, adicione aproximadamente 7\u201210 mL de 1x PBS ao prato de dissecção revestido com elastômero de silicone. Este volume deve garantir que as amostras de tecido estejam completamente submersas.</li>
	<li>Transfira uma mosca para o prato de dissecção a partir do etanol de 70% usando fórceps sem cortes e segurando as asas ou as pernas.</li>
	<li>Concentre a amostra no prato de dissecção sob um microscópio dissecando. Em seguida, submergir a amostra em 1x PBS, e remover cuidadosamente as asas usando dumont #5 fórceps finos.</li>
	<li>Usando a tesoura de dissecção da mola de borda reta Vannas, remova as pernas criando uma pequena incisão no lado ventral da cutícula. Na etapa 3.8, esta incisão permitirá que o formaldeído penetre no tecido.</li>
	<li>Pegue a tesoura em uma mão e segure os fórceps na outra para posicionar o lado ventral da mosca para cima. Enquanto segura o espécime no lugar com os fórceps contundentes, remova a cabeça e o abdômen com a tesoura de dissecção.</li>
	<li>Transfira o tórax isolado utilizando a ponta de pipeta modificada para o tubo rotulado, a partir da etapa 3.2. NOTA: Coloque a pipeta em 40 μL para evitar adicionar 1x pbs extra ao fixador.</li>
	<li>Repetir as etapas 3.2\u20123.6 acima para cada amostra.</li>
	<li>Conserte amostras por 30 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova a correção usando uma pipeta Pasteur e descarte-a no recipiente de resíduos adequado sob o capô da fumaça. Enxágüe amostras três vezes com 1,5 mL de 1x PBS cada um usando uma pipeta Pasteur. Complete uma quarta lavagem usando apenas 750 μL e deixe os tecidos em 1x PBS. NOTA: Neste ponto, as amostras de tecido podem permanecer a 4 °C por até 3 dias antes de prosseguir para os próximos passos.</li>
</ol>4. Congelamento de flash e biseção de tórax
<ol><li>Antes de começar as biseções, encha um frasco de Dewar com nitrogênio líquido usando luvas crioprotetores adequadas e óculos de segurança. Obtenha um disjuntor de lâminas, lâminas de penas, um par de fórceps finos, gelo, 1x PBS gelado e pinças criogênicas.</li>
	<li>Prepare um balde de gelo para manter 1x PBS gelado.</li>
	<li>Use o disjuntor da lâmina para pegar a lâmina de penas em um ângulo, e dobre a lâmina para quebrar uma pequena peça. O disjuntor da lâmina pode então travar a lâmina em posição para uso como um bisturi pequeno. NOTA: Uma lâmina deve durar para todos os grupos. Troque se a lâmina quebrar ou ficar maçante.</li>
	<li>Adicione uma ponta de pipeta limpa ao P200th e remova 1/5 da ponta para transportar amostras.</li>
	<li>Prepare um novo tubo de microcentrifuuagem para cada grupo e adicione 200 μL de 1x PBS a cada tubo. Este segundo tubo será usado para coletar os preparadores finais do DLM.</li>
	<li>Remova todos os 1x PBS dos tubos usando uma pipeta Pasteur.</li>
	<li>Usando equipamento de proteção adequado, submergir o tubo no frasco de nitrogênio líquido por 10 s com a pinça criogênica. NOTA: Os tubos devem ser fechados firmemente para evitar que o tubo exploda.</li>
	<li>Remova o tubo do nitrogênio líquido e adicione aproximadamente 300 μL de PBS 1x de gelo às amostras com uma pipeta Pasteur. Mantenha as amostras no gelo.</li>
	<li>Adicione o PBS 1x gelado ao prato de dissecção de 10 cm revestido com elastômero de silicone e dispense o primeiro tórax com a pipeta modificada de 200 μL.</li>
	<li>Coloque o lado ventral do tórax para cima. Em uma mão use um par maçante de fórceps para posicionar o tórax e na outra use um belo par de fórceps para remover parte do gânglio torácico para expor a linha média do tórax.</li>
	<li>Use a linha média do tórax como guia para fazer um corte raso através de 1/3do tórax com a lâmina.</li>
	<li>Retire a lâmina do tórax e posicione o tórax em um ângulo de 45° com os fórceps contundentes. Reinsera a lâmina e corte direto pela linha média do tórax. Isso resultará em dois hemithoraces.</li>
	<li>Tome um hemitórax de cada vez e remova o excesso de tecido sob a fibra muscular DLM F(Figura 1B),a fibra mais ventral. Use a lâmina para fazer cuidadosamente um ou dois cortes para remover o excesso de tecido sem danificar os DLMs.</li>
	<li>Uma vez isolado, transfira o hemitórax para o tubo correto com 1x PBS.</li>
	<li>Repetimos as etapas 4.6\u20124.14 até 10 hemithoraces dissecados por grupo são feitos.</li>
</ol>5. Mancha estrutural
<ol><li>Após a bissecção das amostras do tórax, coloque o tecido no tampão de bloqueio (1x PBS com soro de cabra normal de 0,1% e 0,2% Tritão X-100 no pH 7.4) para permeabiliizar o tecido e evitar manchas não específicas. Use uma pipeta Pasteur para remover o excesso de 1x PBS e adicione 1,5 mL de tampão de bloqueio a cada tubo. Bloqueie os tecidos por pelo menos 1h a 4 °C.</li>
	<li>Prepare as amostras para coloração estrutural usando um anticorpo fluorescente conjugado, peroxidase de rabanete 488 (anti-HRP-488) a uma diluição de 1:200 e Phalloidin-647 em uma diluição de 1:1000 em tampão de bloqueio para manchar neurônios motores e tecido muscular, respectivamente. Faça mancha suficiente para ter 150 μL por tubo. Armazene a mancha a 4 °C coberta de papel alumínio ou em uma caixa escura até estar pronta para coloração.</li>
	<li>Após o bloqueio, remova o tampão de bloqueio excessivo com uma pipeta Pasteur de vidro.</li>
	<li>Antes de dispensar a mancha estrutural, vórtice da mancha. Adicione 150 μL da mancha a cada tubo. Coloque as amostras em uma caixa escura no rotador à temperatura ambiente por 2 h.</li>
	<li>Remova a mancha e lave os tecidos quatro vezes em 1,5 mL de temperatura ambiente 1x PBS com 0,3% Triton X-100 por 5 min no rotador em uma caixa escura. As amostras estão prontas para montar em um slide.</li>
</ol>6. Tecido de montagem
<ol><li>Depois de lavar amostras em PBST, prepare uma lâmina de microscópio para montar tecido para coloração. Prepare suprimentos adicionais, incluindo deslizamentos de tampa de vidro, uma pipeta P200, pontas de pipeta de 200 μL, tesouras, reforços claros, fórceps de borda reta, mídia de montagem fluorescente anti-fade, esmalte e uma caixa escura para cobrir os slides.</li>
	<li>Rotule o slide para identificar as amostras e limpe o slide com kimwipes para garantir que não haja manchas.</li>
	<li>Para garantir que as amostras de hemitórax não sejam danificadas pelo deslizamento da tampa, construa uma "ponte" usando etiquetas de reforço. Pegue uma etiqueta de reforço, corte-a ao meio e coloque cada metade com aproximadamente 15 mm de distância. Esta distância deve ser menor do que a largura do deslizamento da tampa. Repita esta etapa quatro vezes para completar uma "ponte" que tem 5 rótulos de altura.</li>
	<li>Pegue a pipeta P200 e modifique uma pontath cortando 1/5 da ponta para transferir as amostras para o slide. As amostras devem ser transferidas para o escorregador no centro da ponte.</li>
	<li>Pegue a borda de uma limpeza de laboratório e remova qualquer excesso de PBST. Usando fórceps, organize os DLMs de tal forma que todas as amostras estejam voltadas para o lado muscular para cima e para baixo.</li>
	<li>Usando uma ponta padrão de pipeta P200, aplique 70 μL de mídia de montagem no slide, evitando bolhas de ar. Distribua a mídia em um padrão circular dentro dos reforços que partem do lado de fora para o centro.</li>
	<li>Coloque um deslizamento de cobertura sobre os reforços.</li>
	<li>Use esmalte para revestir as bordas externas ao redor do perímetro da mancha de cobertura. Aplique generosamente para formar uma vedação completa do tecido.</li>
	<li>Coloque o slide sobre uma superfície plana no escuro, permitindo pelo menos 10 minutos para secar e evitar o branqueamento fotográfico ou perda de fluorescência. Slides agora podem ser usados para imagens imediatamente ou de outra forma armazenados em uma pasta de slides a -20 °C para visualização posterior.</li>
</ol>7. Alternativa: Mancha com anticorpos primários
NOTA: Esta seção é opcional e deve ser usada diretamente entre as seções 4 e 5, se desejar.
<ol><li>Para manchar o tecido com anticorpos primários, submergir tecido no tampão de bloqueio por pelo menos 1h.</li>
	<li>Prepare o anticorpo primário com diluição adequada no tampão de bloqueio. No mínimo, prepare mistura de anticorpos suficientes para ter 150 μL por grupo. Note que as amostras estão paradas. Armazene a 4 °C até ficar pronto para uso.</li>
	<li>Remova o excesso de bloqueio do buffer com uma pipeta Pasteur. Brevemente vórtice do anticorpo primário e adicione 150 μL de mistura de anticorpos a cada grupo e coloque amostras a 4 °C durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, remova o anticorpo primário e lave o tecido 4 vezes com PBST por 5 minutos cada em um rotador.</li>
	<li>Prepare a mancha secundária no tampão de bloqueio. Adicione a mancha secundária à amostra e, em seguida, mantenha-a uma temperatura ambiente por 2 h em uma caixa escura no rotador. NOTA: A coloração secundária também pode incluir HRP e faloidina.</li>
	<li>Após a incubação de 2h, para remover o tecido secundário de lavagem de manchas 4 vezes por 5 min com PBST e proceder à montagem.</li>
</ol>

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<li>Marrus, S. B., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+localization+of+glutamate+receptors+opposite+sites+of+high+presynaptic+release%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Preferential localization of glutamate receptors opposite sites of high presynaptic release.</a> Current Biology. 14, 924-931 (2004).</li>
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<li>Maccioni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+phytotherapic+extracts+rescue+anomalous+locomotion+and+electrophysiological+responses+of+TDP-43+Drosophila+melanogaster+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Standardized phytotherapic extracts rescue anomalous locomotion and electrophysiological responses of TDP-43 Drosophila melanogaster model of ALS.</a> Scientific Reports. 8, 16002(2018).</li>
<li>Siddiqi, O., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurophysiological+defects+in+temperature-sensitive+paralytic+mutants+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurophysiological defects in temperature-sensitive paralytic mutants of Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73, 3253-3257 (1976).</li>
<li>Wang, Z. H., Clark, C., Geisbrecht, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+clueless+is+involved+in+Parkin-dependent+mitophagy+by+promoting+VCP-mediated+Marf+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila clueless is involved in Parkin-dependent mitophagy by promoting VCP-mediated Marf degradation.</a> Human Molecular Genetics. 25, 1946-1964 (2016).</li>
<li>O'Sullivan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+Wing+Motor+Control+of+Song+and+Flight%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Multifunctional Wing Motor Control of Song and Flight.</a> Current Biology. 28, 2705-2717 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Utilizando os métodos descritos neste protocolo, fornecemos uma abordagem direta para dissecção do tecido DLM e demonstramos como isso pode ser aplicado para avaliar a integridade sináptica através de coloração estrutural e marcadores sinápticos em Drosophila adulto. Um passo crítico no protocolo que torna o tecido DLM mais fácil de dissecar é o congelamento de flash com nitrogênio líquido. Sem essa etapa, o tecido é menos firme e mais difícil de cortar precisamente como observado na Figura 3. Este protocolo baseia-se em métodos de dissecção anteriores para permitir a preservação tanto dos neurônios motores quanto do tecido muscular18,19,20,21,,22,23. Uma limitação deste protocolo é que ao fazer o corte da linha média para a biseção, pode ser difícil obter duas preparações limpas por tórax. Uma maneira de garantir pelo menos um hemitórx por mosca, você pode cortar propositalmente para um lado do tórax para obter uma preparação limpa. Com esta modificação, também é necessário remover o excesso adicional de tecido do corte para limpar a amostra com o disjuntor da lâmina. Para aqueles novos nesta técnica, com prática contínua, a precisão da biseção aumentará.
O método descrito aqui permite que os pesquisadores avaliem facilmente a integridade estrutural dos NMJs DLM adultos a qualquer momento ao longo de sua vida útil. Uma grande vantagem deste protocolo é a capacidade de acessar a integridade sináptica em modelos de doenças neurodegenerativas usando marcadores sinápticos. Demonstramos que essa aplicação pode ajudar a visualizar mudanças na morfologia bruta com coloração estrutural (Figura 1C\u2012H). Além disso, a integridade sináptica pode ser avaliada com a coloração de marcadores pré-sinápticos, incluindo, mas não se limitando à Sinápsia28 (Figura 2A\u2012F),Sintaxin29 (Figura 2G\u2012L) e BRP30 ( Figura2M\u2012R). O tecido muscular postsinápico também pode ser avaliado usando o anticorpo subunidade do Receptor de Glutamato III31 (Figura 2S\u2012X), demonstrando a utilidade deste protocolo.
Os pesquisadores também podem utilizar esse método de dissecção para complementar dados funcionais para examinar de forma abrangente a integridade estrutural das sinapses associadas a uma grande variedade de doenças. Essas sinapses também permitem a análise funcional através de gravações eletrofisiológicas32,,33,,34 e o ensaio de voo10. Este protocolo também pode proporcionar facilidade de acesso ao tecido para muitas aplicações e ensaios. Estudos futuros, por exemplo, poderiam usar este protocolo para quantificar mudanças sinápticas através da quantificação da densidade e número de sinapses15,16. Embora o protocolo descrito aqui examine especificamente a integridade sináptica dos neurônios motores, protocolos complementares para avaliação da perda de células musculares também podem ser realizados com esta dissecção usando a coloração TUNEL35. Para examinar a perda neuronal, a dissecção do gânglio torácico36 também poderia ser usada com coloração TUNEL. Esperamos que a dissecção descrita aqui tenha mais aplicações para estudos futuros que avaliam patologias relacionadas à idade, bem como doenças neurodegenerativas.

A disfunção sináptica está entre as primeiras marcas conhecidas das principais doenças neurodegenerativas1,,2,,3,4,5,6. No entanto, muito pouco se sabe sobre como esses prejuízos estruturais e funcionais se relacionam com estágios posteriores da progressão da doença. A drosophila provou ser um sistema modelo útil para a compreensão do crescimento e desenvolvimento da sinapse utilizando NMJslarval 7,,8,,9. No entanto, o terceiro estágio de instar larval dura apenas alguns dias, limitando sua utilidade no estudo da neurodegeneração progressiva e dependente da idade. Uma alternativa para avaliar os NMJs larvais é examinar estruturas sinápticas em Drosophilaadulta, como as sinapses formadas nos Músculos Longitudinais Dormentes (DLMs) que são necessárias para o voo10,,11,,12,,13,14,,15,16. Essas sinapses tripartites são estruturalmente organizadas de forma semelhante às sinapses de mamíferos17,proporcionando uma vantagem única para avaliar modelos de doenças neurodegenerativas.
Aqui descrevemos um método simples para analisar a integridade estrutural de NMJs adultos em um modelo Drosophila de neurodegeneração. Métodos e estudos anteriores de dissecção de DLM enfatizaram a importância da preservação do tecido muscular para uma variedade de aplicações18,,19,,20,,21,,22,,23. Nosso protocolo fornece um método abrangente para preservar o tecido neuronal e muscular para investigar doenças neurodegenerativas. Outro componente importante do estudo dessas doenças é a capacidade de entender a perda neuronal de forma dependente da idade. Trabalhos anteriores fornecem uma compreensão crítica e aprofundada de como os NMJs DLM são formados durante a metamorfose no início da vida adulta11,,12,14,,15,,16,,24. Nosso protocolo estabelece um método para construir este trabalho para investigar NMJs DLM de forma dependente da idade em doenças neurodegenerativas e de envelhecimento.

<table><tbody><tr><td>32% Ciências de</td><td>Microscopia Eletrônica</td> de Formaldeído <td>15714</td><td>Preservação de tecidos</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 cabra anti camundongo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11031</td><td>Rotula anticorpos primários. Usado na concentração de 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 cabra anti coelho</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11036</td><td>Rotula anticorpos primários. Usado na concentração de 1:200.</td></tr><tr><td>anticorpo anti-Bruchpilot (BRP)</td><td>Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma</td><td>NC82</td><td>Cora as zonas ativas em neurônios pré-sinápticos. Usado na concentração de 1:25.</td></tr><tr><td>anticorpo anti-GluRIII</td><td>Presente de Aaron DiAntonio</td><td>N/A</td><td>Rotula subunidades receptoras de glutamato. Usado na concentração de 1:1000.</td></tr><tr><td>anticorpo anti-sinapsina</td><td>Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma</td><td>3C11</td><td>Rotula a proteína sináptica sinapsina. Usado na concentração de 1:50.</td></tr><tr><td>anticorpo anti-sintaxe</td><td>Estudos de desenvolvimento O banco de hibridoma</td><td>8C3</td><td>rotula a sintaxina da proteína sináptica. Usado na concentração de 1:10.</td></tr><tr><td>BenchRocker</td><td>Genesee Scientific</td><td>31-302</td><td>Amostras rotativas durante a coloração</td></tr><tr><td>Quebra-lâmina</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>10053-09</td><td>Usado para segurar</td></tr><tr><td>lamínulas de cobertura de</td> lâminas de penas <td>Fisher Scientific</td><td>12548A</td><td>Para montar</td></tr><tr><td>luvas criogênicas</td> de tecido <td>VWR</td><td>97008-198</td><td>protegem as mãos de pinças</td></tr><tr><td>criogênicas</td> de nitrogênio líquido <td>VWR</td><td>82027-432</td><td>Segure o tubo de 2,0 mL no frasco de dewar de nitrogênio</td></tr><tr><td>líquido-1900 mL</td><td>Thomas Scientific</td><td>5028M54</td><td>Segure as lâminas de penas de nitrogênio líquido</td></tr><tr><td></td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>72002-01</td><td>Lâminas de bisturi</td></tr><tr><td>Fine Forecps x 2</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>11252-20</td><td>Um par fino para limpar a linha média do tórax. O outro par pode ser embotado com uma pedra de amolar.</td></tr><tr><td>Anti HRP conjugado com FITC</td><td>Jackson Laboratories</td><td>123-545-021</td><td>Colore neurônios motores. Usado na caixa de congelamento de concentração 1:100</td></tr><tr><td>(Preto)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14100F</td><td>Protege amostras de</td></tr><tr><td>pipetas pasteur de vidro</td> leve <td>VWR</td><td>14637-010</td><td>Usado para transferir</td></tr><tr><td>amostras lâminas de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550143</td><td>Para montagem</td></tr><tr><td>de mídia de montagem de tecido (vectashield) anti-fade</td><td>VWR</td><td>101098-042</td><td>A mídia de montagem retém esmalte de unhas de sinalização fluorescente</td></tr><tr><td></td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td>Sela lâminas de microscópio</td></tr><tr><td>soro de cabra normal</td><td>Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td>Previne a ligação não específica de anticorpos</td></tr><tr><td>pincel</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-204 Transferência de</td><td></td></tr><tr><td>moscas PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-010-023</td><td>Solução salina para dissecação e coloração</td></tr><tr><td>Faloidina 647</td><td>Abcam</td><td>AB176759</td><td>Cora F-Actina no tecido muscular. Utilizado na concentração de 1:1000</td></tr><tr><td>placa de Petri de plástico (100 mm)</td><td>VWR</td><td>25373-100</td> Etiquetas de reforço de <td>placa de dissecação</td></tr><tr><td></td><td>W.B. Mason</td><td>AVE05722</td><td>Fornece suporte para lamínula de vidro sobre o</td></tr><tr><td>bloco de afiação de</td> tecidos montado <td>Grainger</td><td>1RDF5</td><td>Manter as pinças finas afiadas e também embotar a</td></tr><tr><td>pasta de lâminas</td> de par separado <td>VWR</td><td>10126-326</td><td>Amostra tesoura de escritório padrão de armazenamento</td></tr><tr><td></td><td>W.B. Mason</td><td>ACM40618</td><td>Etiquetas de reforço de corte</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>24236-10</td><td>Revestimento para prato de dissecação</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22140</td><td>Ajuda a permeabilizar o tecido</td></tr><tr><td>Vannas Disssection Sissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>1500-00</td><td>Ued para remover as pernas da mosca e fazer uma incisão no tórax</td></tr></tbody></table>

visualização da degeneração sináptica em drosophila adulta em associação com neurodegeneração

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

A drosophila serve como modelo útil para avaliar a estrutura sináptica e a função associada a doenças neurodegenerativas. Embora muito trabalho tenha se concentrado em junções neuromusculares (NMJs) em larvas de Drosophila, avaliar a integridade sináptica em Drosophila adulto tem recebido muito menos atenção. Aqui fornecemos um método simples para dissecção dos músculos longitudinais dorsais (DLMs), que são necessários para a capacidade de voo. Além do voo como leitura comportamental, essa dissecção permite que as sinapses DLM e tecido muscular sejam favoráveis à análise estrutural usando anticorpos fluorescentes rotulados para marcadores sinápticos ou proteínas de interesse. Este protocolo permite avaliar a integridade estrutural das sinapses em Drosophila adulta durante o envelhecimento para modelar a natureza progressiva e dependente da idade da maioria das doenças neurodegenerativas.

A geração de moscas transgênicas expressando proteína humana de ligação de piche de 43 kDa mutante (TDP-43M337V)é representada pelo esquema (Figura 1A). Isso demonstra a aplicação do sistema binário Gal4/UAS em Drosophila27. A ilustração retrata um hemitórx com seis fibras musculares, A\u2012F indo da fibra mais dorsal A para a mais ventral F (Figura 1B)11,,12. Para avaliar a integridade sináptica, os NMJs foram manchados com HRP e Phalloidin (Figura 1C\u2012E). Os neurônios motores em mutantes TDP-43M337V (Figura 1F) têm pouca ou nenhuma coloração hrp até o dia 21, enquanto wt (Oregon-R) permanece intacto(Figura 1C). Não há diferenças visíveis na coloração muscular(Figura 1D,G). As mudanças na morfologia bruta observadas nos mutantes TDP-43M337V demonstram como a integridade sináptica pode ser implicada em um modelo de doença neurodegenerativa de esclerose lateral amiotrófica (ELA) utilizando o modelo de DLM adulto. Além da coloração estrutural, a coloração dos NMJs DLM também pode fornecer uma avaliação da integridade sináptica com marcadores pressinápticos(Figura 2A\u2012R) e pós-sinápticos(Figura 2S\u2012X). Juntos, esses resultados ilustram como esse protocolo de dissecção poderia ser aplicado ao estudo do tecido DLM em doenças neurodegenerativas.
Um aspecto fundamental desta dissecção é a aplicação de nitrogênio líquido para congelar o tecido para facilitar a biseção. A utilidade do nitrogênio líquido é demonstrada em moscas de TG com nitrogênio líquido onde o tecido muscular não tem danos ou fibras cortadas(Figura 3A\u2012C). Sem nitrogênio líquido, o tecido pode ser mais difícil de dissecar. Por exemplo, seguir este protocolo e pular a etapa de congelamento do flash de nitrogênio líquido permite que o tecido seja mais suscetível a danos das ferramentas de dissecção, como neurônios danificados(Figura 3D) ou fibras musculares danificadas(Figura 3E). A aplicação de nitrogênio líquido ajuda a prevenir danos teciduais que poderiam ocorrer ao trabalhar com tecido DLM, independentemente do genótipo da amostra(Figura 3C e 3F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig1.jpg"> Figura 1: Denervação progressiva das sinapses DLM em um modelo de Drosophila de ELA. (A) A geração de moscas transgênicas de ALS expressando uma forma mutante humana de Proteína De Ligação de Piche de 43 kDa (TDP-43) são mostradas no esquema. (B) A ilustração retrata a forma e a orientação de um hemitórax em um Drosophilaadulto . Utilizando o protocolo, podemos observar a perda progressiva da integridade sináptica das sinapses DLM NMJ através da coloração estrutural de neurônios motores com HRP (verde) e tecido muscular com Phalloidin (magenta). Nosso modelo retrata a perda de integridade sináptica em um modelo adulto de ELA através da geração de moscas adultas expressando um mutante de TDP-43M337V humano em neurônios motores(Figura 1F\u2012H) em comparação com WT (Figura 1C\u2012E) voa em fibra muscular C. Setas destacam exemplos de uma sinapse WT(Figura 1C) e um exemplo de perda de integridade sináptica. Barra de escala =20 μm a 63x de ampliação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig2.jpg"> Figura 2: Avaliação da integridade sináptica usando marcadores pré-sinápticos em NMJs adultos. A integridade sináptica também pode ser avaliada usando marcadores pré-sinápticos e postsinápticos em moscas WT que têm 14 dias de idade na fibra muscular C. Os marcadores pré-sinápticos Synapsin (B),Sintaxin(H)e Bruchpilot (BRP)(N)são co-manchados com HRP (A, G, M). A coloração retrata a localização desses marcadores nos terminais pré-sinápticos(C, I, O). Na ampliação mais elevada, as imagens ilustram a localização de Synapsin(E),Sintaxin (K)e BRP(Q)com HRP(D, Je P)em mais detalhes(Figura F, Le R). Também mostramos um marcador postsinástico Glutamato Receptor III (GluRIII)(T) co-manchado com HRP(S). A co-coloração demonstra a utilidade desses marcadores(U). Na ampliação mais elevada, as imagens representativas exemplificam a localização (X) de GluRIII (W) e HRP (V) ao tecido muscular post-sináptico e aos terminais pré-sinápticos, respectivamente. Barra de escala para painéis A\u2012C, G-I, M\u2012O, S\u2012U representam 20 μm a 63x de ampliação. Barra de escala para painéis D\u2012F, 2J-2L, 2P-2R e 2V-2X representam 10 μm a 63x de ampliação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig3.jpg"> Figura 3: Utilidade do nitrogênio líquido para dissecções DLM. Para demonstrar a utilidade do nitrogênio líquido para as dissecções DLM, mostramos uma comparação do dia 21 WT voa com e sem nitrogênio líquido da fibra muscular C. Com nitrogênio líquido, a faloidina(B)permanece intacta e não compromete a coloração do HRP(A, C). Sem nitrogênio líquido, o tecido muscular torna-se elgas e difícil de bissecção(E) e a coloração hrp(D, F) fica comprometida devido a erro técnico. As setas brancas mostram uma área sem danos musculares com nitrogênio líquido(B)e tecido muscular danificado(E). Barra de escala = 20 μm em 63x de ampliação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O objetivo deste procedimento é dissecar o tecido do músculo longitudinal dorsal (DLM) para avaliar a integridade estrutural das junções neuromusculares DLM (NMJs) em modelos de doenças neurodegenerativas utilizando Drosophila melanogaster.

Visualização da Degeneração Sináptica em Drosophila Adulta em Associação com Neurodegeneração

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

Um protocolo fornece um modelo simples para avaliar a integridade sináptica de forma dependente da idade. Assim, podemos estudar doenças neurodegenerativas em tecidos que são favoráveis tanto à análise estrutural quanto funcional. Esta técnica facilita a preservação do tecido neuronal e muscular das junções neuromusculares musculares longitudinais dorsais.Investigar de forma abrangente a função sináptica ao longo do tempo e tecidos difíceis de trabalhar. Este método pode ser aplicado ao estudo de doenças neurodegenerativas, incluindo ELA, Parkinson, Huntington e Doença de Alzheimer. Antes de iniciar a dissecção corte aproximadamente 10 milímetros da ponta de uma pipeta de 200 microliter.Depois de administrar a anestesia, jogue de seis a 10 moscas em uma placa de Petri de seis centímetros contendo 70% de etanol e use um pincel para beber suavemente cada mosca. Após um a dois minutos, use fórceps para transferir uma mosca pelas pernas ou asas para um prato de dissecção revestido de desintoxicação de silicone contendo sete a dez mililitros de PBS sob um microscópio dissecando. Com a mosca submersa na PBS, use o número cinco do Dumont sem cortes para remover cuidadosamente as asas e usar uma tesoura de dissecção de mola de borda reta para fazer uma pequena incisão no lado ventral da cutícula para remover as pernas.Segurando a tesoura de dissecção em uma mão e fórceps contundentes na outra, posicione o lado ventral da mosca para cima e segurando o espécime no lugar com os fórceps, remova a cabeça e o abdômen com a tesoura. Use uma pipeta de 200 microlitrais definida para 40 microliters e a ponta de pipeta modificada para coletar as lentes e colocar as amostras de tecido isolada em um tubo devidamente rotulado contendo 900 microliters de PBS e 150 microliters de 32% de formaldeído. Após 30 minutos em temperatura ambiente, use uma pipeta Pasteur para remover o fixador e enxaguar os plies três vezes com 1,5 mililitros de PBS por lavagem.Antes de começar as biseções Don luvas de proteção cryo e óculos de segurança e encher um frasco de passeio com nitrogênio líquido. Use um disjuntor de lâmina para pegar uma lâmina de penas em um ângulo e dobre a lâmina para quebrar um pequeno pedaço. Use o disjuntor da lâmina para travar a lâmina na posição e use uma pipeta pasteur de vidro para remover todos os PBS dos tubos de amostra.Use pinças criogênicas para submergir os tubos no frasco de nitrogênio líquido. Após 10 segundos, use uma pipeta Pasteur para adicionar aproximadamente 300 microliters de PBS gelado a cada tubo no gelo, e coloque um lado ventral de machado pobre para cima em um prato de dissecção revestido de silicone de 10 centímetros contendo PBS gelado. Use um par maçante de fórceps para posicionar o tórax e encontrar pares de fórceps, para remover alguns dos gânglios torácicos para expor a linha média do tórax.Usando a linha média do tórax como guia, use a peça para fazer um corte raso através de um terço do tórax e use os fórceps contundentes para posicionar o tórax em um ângulo de 45 graus. Use a lâmina para cortar em linha reta pela linha média do tórax para obter dois hemithoraces e fazer cuidadosamente um ou dois cortes para remover o excesso de tecido sem danificar os músculos longitudinais dorsais. Em seguida, coloque as amostras de tecido muscular em um tubo apropriadamente rotulado de PBS.Quando todas as amostras de tórax tiverem sido bisseccionadas permeabilizem os tecidos no tampão de bloqueio por pelo menos uma hora a quatro graus Celsius. Ao final da incubação, o vórtice preparou uma solução de manchas estruturais recém-preparada e adiciona 150 microliters da mancha a cada amostra para uma incubação de duas horas em um rotador à temperatura ambiente no escuro. Após a coloração lave as amostras em PBST, e coloque cinco etiquetas de reforço empilhadas e cortadas ao meio 15 milímetros em um slide de microscópio de vidro.Use uma dica de micro pipeta modificada para transferir os Thoraces para cada slide e use uma limpeza de laboratório para remover qualquer excesso de PBST. Use fórceps para organizar as amostras de tal forma que os Thoraces estão enfrentando o lado muscular para cima. Quando as amostras estiverem corretamente orientadas, use uma ponta de pipeta de 200 microliteres para aplicar 70 microliters de meio de montagem em cada slide e cobrir cada slide com um deslizamento de cobertura.Em seguida, use esmalte para revestir generosamente as bordas externas dos deslizamentos de cobertura para obter uma vedação completa em torno de cada tecido. Para avaliar a integridade sináptica. Junções neuromusculares podem ser manchadas com peroxidase de rabanete e floe tin Neurônios motores em proteína de ligação de piche de 43 mutans Kilodalton têm pouca ou nenhuma coloração de peroxidase de rabanete até o dia 21, enquanto a proteína do tipo selvagem permanece intacta.Não são observadas diferenças visíveis na coloração muscular. Além da coloração estrutural, a rotulagem de junção neuromuscular muscular dorsal dorsal também pode fornecer uma avaliação da integridade sináptica com marcadores pré-sinápticos e pós-sinápticos. Note que o congelamento do flash de nitrogênio líquido facilita uma biseção bem sucedida, pois o tecido congelado não flash é mais suscetível a danos durante a dissecção.Após este procedimento, as amostras de preservação podem ser analisadas por microscopia confocal para medir aspectos específicos da estrutura sináptica.

visualizing-synaptic-degeneration-adult-drosophila-association-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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