Investigando a Motilidade Impulsionada por Flagella em Escherichia coli aplicando três técnicas estabelecidas em uma série
10 de maio de 2020
Muitas bactérias usam motilidade impulsionada por flagela para navegar em seu ambiente e colonizar ambientes favoráveis tanto individualmente quanto como coletivos. Demonstrado aqui é o uso de três métodos estabelecidos que exploram a motilidade como ferramenta de seleção para identificar componentes/caminhos que contribuem para a natação e a motilidade.
Os protocolos demonstrados neste vídeo podem ser reproduzidos em qualquer laboratório do mundo. Em combinação, eles representam uma abordagem sistemática e poderosa para caracterizar a motilidade do flagelo bacteriano. A motilidade é um aspecto crucial da disseminação e sobrevivência bacteriana, e esses três métodos são ferramentas úteis e poderosas para a análise da motilidade individual e coletiva.
As técnicas descritas aqui podem ser prontamente aplicadas para estudar uma série de bactérias, incluindo aquelas classificadas como patogênicas por natureza. Ao tentar este procedimento pela primeira vez, lembre-se de que, se as placas de enxame forem preparadas incorretamente, podem ser observados comportamentos ou padrões inconsistentes que imitam, mas não refletem verdadeiramente o movimento coletivo. Cultive culturas noturnas da cepa deficiente de motilidade desejada em cinco mililitros de caldo Lennox a 30 graus Celsius com agitação horizontal e, em seguida, subcultive em LB fresco sob as mesmas condições para a fase exponencial.
Inocule seis microlitros da cultura no centro de uma placa de ágar macio, empurrando a ponta da pipeta carregada para dentro do ágar para expelir suavemente o conteúdo. Incubar a placa a 30 graus Celsius até que as chamas de motilidade sejam evidentes, emanando do ponto de inoculação ou da periferia dos anéis de motilidade. Use um laço de arame estéril para levantar as células da região do flare e coloque-as em uma placa de ágar duro LB para purificar colônias individuais.
Para confirmar que os mutantes supressores isolados restauraram a motilidade, cultive-os em placas de ágar macio para cepas de interesse. Inclua o tipo selvagem e a cepa deficiente de motilidade inicial para comparação. Depois de incubar as placas de cultura a 30 graus Celsius por oito a 10 horas, registre o diâmetro do anel mais externo para estabelecer quais dos isolados restauraram substancialmente a motilidade.
Preparar uma cultura de fase exponencial da estirpe de interesse. Em seguida, coloque 10 mililitros de células por centrifugação a 2000 vezes G por três minutos e ressuspenda-as em 10 mililitros de tampão de motilidade esterilizado por filtro, ou MB. Lave as células mais duas vezes em MB e ressuspenda-as em um mililitro de MB após a centrifugação final. Transfira a suspensão celular para uma seringa de um mililitro e coloque uma agulha de calibre 23 na extremidade.
Monte uma seringa e um aparelho de agulha idênticos e prenda os dois juntos por meio de um tubo de polietileno de seis polegadas, firmemente embainhado sobre cada ponta da agulha. Cisalhe os flagelos passando suavemente a suspensão celular para frente e para trás de uma seringa para a outra 50 vezes com pausas de um minuto entre cada 10 passagens. Em seguida, centrifugue as células cortadas a 2000 vezes G por três minutos e ressuspenda-as em 500 microlitros de MB.To prepare uma câmara de fixação celular, empilhe uma lamínula de 18 por 18 milímetros sobre uma lâmina de microscópio de vidro separada por fita dupla-face.
Adicione solução de polilisina a 0,01% no topo da câmara para lavá-la. Incline a borda inferior em um lenço de tarefas para puxar a solução pela câmara e deixe-a em temperatura ambiente por 10 minutos. Lave a câmara três vezes com 40 microlitros de MB e adicione 40 microlitros de suspensão de célula cisalhada no topo da câmara.
Deixe as células se prenderem à lamínula por 10 minutos e, em seguida, lave suavemente a câmara com 40 microlitros de MB para remover as células soltas. Transfira a lâmina para a platina do microscópio e use microscopia de contraste de fase e uma objetiva de 100X para escanear a população em busca de células fixadas no lugar e girando em um único eixo. Abra o software do microscópio, certifique-se de que as células estejam em foco e inicie a aquisição de vídeo para registrar a rotação da célula por um minuto.
A partir da reprodução de vídeo, quantifique o número de rotações completas por minuto e o número de vezes que a célula muda de direção. Inocule seis microlitros de uma cultura exponencial média, localizando-a em cima do ágar. Deixe a tampa aberta por cinco a 10 minutos e substitua-a quando o inóculo secar na superfície do ágar.
Em seguida, incube a placa a 30 graus Celsius por oito horas. Despeje aproximadamente 30 mililitros de ágar enxame na câmara direita de uma placa de Petri de compartimento duplo, certificando-se de que esteja nivelada com a divisória de plástico entre as câmaras, mas não transbordando para a esquerda. Depois que o ágar-ágar estiver endurecido, encha a câmara esquerda com aproximadamente 30 mililitros de ágar natação ou enxame.
Antes de endurecer, use uma ponta de pipeta estéril para conduzir suavemente o ágar sobre a borda e conectar os dois lados com uma ponte de ágar de um milímetro de altura que se estende por todo o comprimento da divisão. Deixe o prato secar à temperatura ambiente. Ao derramar o ágar, preste atenção à sua profundidade.
Se for muito alto, transbordará. Se for muito baixo, você não poderá fazer a ponte entre as duas câmaras. Este protocolo foi usado para isolar surtos pseudo-reversíveis em uma cepa de E.coli dupla mutante com motilidade prejudicada.
Um desses revertidos exibiu motilidade próxima ao tipo selvagem. O genitor duplo mutante e a cepa isogênica do tipo selvagem foram usados como controles. As capturas de vídeo foram analisadas para calcular as rotações por minuto e a fração de tempo que os motores giram no sentido horário, ou viés de queda.
O mutante yhjH mostrou algumas rotações por minuto e um viés de queda menor em comparação com E.coli do tipo selvagem, como esperado. Tanto o mutante duplo quanto seu supressor mostraram comportamento motor semelhante ao selvagem. O ensaio de travessia de fronteira foi usado para comparar as habilidades do tipo selvagem e do isolado supressor de enxamear e, em seguida, atravessar a fronteira e enxamear em ágar suplementado com canamicina.
Ambas as cepas mostraram taxas semelhantes de enxameação de um ponto de inoculação idêntico, mas o cruzamento do enxame para a câmara antibiótica foi consistentemente maior para o tipo selvagem do que para o supressor. A diferença entre as duas cepas foi mais pronunciada em concentrações mais altas de canamicina. Os ensaios de enxame podem ser difíceis de configurar.
Pode ser necessário gastar algum tempo otimizando as condições de desenho para se adequar às bactérias de interesse, bem como às condições do laboratório durante a preparação do meio. As técnicas deste protocolo foram aplicadas a uma série de bactérias flageladas e provavelmente podem ser aplicadas a uma infinidade de espécies não testadas.
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Visão Geral
Este estudo investiga a motilidade bacteriana, focando no movimento impulsionado por flagelos como meio de navegação ambiental e colonização. Utilizando metodologias estabelecidas, a pesquisa identifica componentes-chave e vias envolvidas em comportamentos de motilidade individuais e coletivos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Motilidade bacteriana
- Mecânica dos flagelos
- Comportamento coletivo em bactérias
Fundamentos
- A motilidade é vital para a sobrevivência e disseminação bacteriana.
- O estudo inclui análise de motilidade individual e coletiva.
- Os protocolos podem ser aplicados a várias bactérias, incluindo patógenos.
Métodos Utilizados
- Explorando a motilidade como ferramenta de seleção
- Uso de placas de ágar macio e ensaios de enxame
- Microscopia de contraste de fase para observação celular
Principais Resultados
- Mutantes supressores isolados mostraram motilidade restaurada.
- Comparação das capacidades de enxame entre tipo selvagem e mutantes indicou diferenças significativas na resposta a antibióticos.
- Rotações motoras quantificadas forneceram insights sobre padrões de motilidade.
Conclusões
- O estudo demonstra a eficácia de protocolos de múltiplas etapas para caracterizar a motilidade bacteriana.
- Os resultados contribuem para a compreensão do comportamento patogênico e da mecânica de motilidade.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Understanding bacterial motility mechanisms provides critical insights into pathogen virulence and host colonization strategies, informing target validation for anti-infective development. The combined application of motility assays enables systematic de-risking of therapeutic hypotheses by linking genetic perturbations to functional phenotypes in both individual and collective movement. This approach supports early discovery workflows by generating quantitative, reproducible data that enhance predictive confidence in target prioritization and mechanistic follow-up.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking motility restoration to suppressor mutations, clarifying gene function in flagellar assembly and signaling.
- Operational Value: Provides a strong selection system for isolating gain-of-function mutants, streamlining the identification of compensatory pathways in motility-impaired strains.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening by quantifying motility recovery, aiding in the assessment of genetic modifiers and pathway interactions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: The cell-tethering technique allows precise measurement of motor speed and directional switching, enabling mechanistic de-risking of targets involved in ion flux or signaling modulation.
- Operational Value: Standardized preparation of sheared cells and fixation chambers ensures reproducible attachment and visualization under phase contrast microscopy.
- Assay Readiness: Generates quantifiable outputs such as rotations per minute and tumble bias, facilitating comparison across strains and conditions for screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: The border-crossing assay links individual motility to collective swarming behavior, modeling how pathogens transition from dissemination to surface colonization under stress.
- Operational Value: Enables evaluation of environmental adaptation, such as antibiotic resistance impact on swarm migration, informing translational biomarker relevance.
- Predictive Confidence: Demonstrates how suppressor mutations alter swarm-antibiotic crossover, providing a model for studying adaptive resistance mechanisms in preclinical settings.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery by connecting genetic screening to functional motility phenotypes, supporting progression from target hit validation to mechanistic de-risking before lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how genetic alterations affect flagellar motor function and swarm competence, reducing ambiguity in target validation.
- Screening: Delivers standardized, quantitative readouts (rotation rates, directional bias, swarm diameter) that enable reliable comparison across mutant libraries or chemical perturbations.
- Analytics: Generates measurable outputs such as tumble bias and swarm expansion rates, which help teams correlate genotype with phenotypic risk in pathogenic models.
- Translational Research: Connects individual motor behavior to collective movement under selective pressure, modeling phenotypic adaptation relevant to infection dynamics.
- Enterprise Reuse: The three techniques form a modular, adaptable platform applicable across flagellated pathogens, promoting cross-project standardization and reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by dissecting motility into motor function, directional switching, and collective behavior components.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized protocols for soft agar inoculation, cell shearing, and chamber preparation, minimizing inter-lab variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target modulation to measurable changes in virulence-associated motility traits.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their role in motility-driven dissemination and host persistence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culture techniques, microscopy, and aseptic handling to ensure consistent motility assays.
- Depends on access to phase contrast microscopy, micromanipulation tools, and controlled incubation environments for swarm and soft agar assays.
- Necessitates standardization of agar concentration, plate drying times, and inoculation volumes to avoid artifacts in swarm border-crossing assays.
- Requires adaptation of buffer composition and shear parameters when applying the cell-tethering method to different bacterial species or mutant backgrounds.
- Practical limitations include sensitivity to swarm agar depth and bridging technique, which must be optimized to avoid false-negative or misleading collective motion readouts.
