Entrega de anticorpos no cérebro usando ultrassom de varredura focalizado

Apenas uma pequena fração dos anticorpos terapêuticos é absorvida pelo cérebro. Usando nosso método, os anticorpos são entregues no cérebro abrindo transitoriamente a barreira hematoencefálica. Essa técnica nos permite entregar anticorpos no cérebro do camundongo de maneira não invasiva.

Para realizar o controle de qualidade das microbolhas usando um contador de células, remova a solução de microbolhas do amálgama e use uma agulha de calibre 19 para perfurar o septo do frasco de solução de microbolhas. Use uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 19 para diluir 100 microlitros das microbolhas em cinco mililitros de solução de fluxo filtrado e pipetar 100 microlitros da solução diluída de microbolhas em 10 mililitros de solução de fluxo filtrado em uma cubeta. Trave a cubeta no lugar na plataforma do contador de células e certifique-se de que uma abertura de 30 mícrons seja usada para a aquisição da amostra.

No software, carregue o método operacional padrão e selecione editar método operacional padrão e concentração. Insira 5.000 vezes para a diluição e clique em aplicar e OK. Clique em editar informações para selecionar um nome de arquivo adequado. Selecione visualizar e verifique se a concentração da amostra de microbolhas é inferior a 10%Selecione iniciar e OK para iniciar a aquisição da amostra.

Após a medição, enxágue a abertura do contador de células com solução de fluxo filtrada. Sonicar a cubeta de solução diluída de microbolhas durante 30 segundos em banho-maria. Meça a solução de microbolhas sonicadas conforme demonstrado e clique em editar informações para rotular os dados como em branco.

Depois de medir o branco, subtraia a leitura final da leitura inicial para excluir quaisquer partículas que não sejam microbolhas. Para rotular as seções com anticorpo IgG fluorescente anti-camundongo, rotule um miligrama de anticorpo IgG de camundongo com Alexa Flour 647 em tampão de bicarbonato de sódio 0.1 molar de acordo com as instruções do fabricante por 15 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, carregue a solução de anticorpo marcada com fluorescência em uma coluna giratória e purifique o anticorpo por centrifugação.

Em seguida, use um espectrofotômetro para medir a concentração de proteína. Para configurar o sistema de ultrassom de varredura focalizado, adicione um espaço de cinco milímetros ao bolo de água para posicionar o foco de ultrassom nove milímetros abaixo do fundo do bolo de água. Encha o bolo de água com aproximadamente 300 mililitros de água desgaseificada deionizada e coloque a matriz anular no bolo de água cheio.

Use um espelho dental para verificar se não há bolhas de ar na superfície e inicie o software aplicativo. No menu de forma de onda, selecione definir ciclo de trabalho de forma de onda e defina a frequência de repetição de pulso para 10 Hertz, o ciclo de trabalho para 10% o foco para 80 milímetros, a frequência central para um megahertz, a amplitude para 0.65 megapascais e o índice mecânico para 0.65. Pressione set para definir a forma de onda e armazená-la na memória.

Depois de selecionar o plano de tratamento, abra a guia de varredura na janela do controlador de movimento e insira os valores de início, parada e incremento para movimento na dimensão X e os valores de início, parada e incremento para movimento na direção Y. Para definir as ações para os locais de tratamento, clique em evento e abra a janela de edição de script. Selecione uma lista de ações que serão executadas na ordem selecionada em cada local de tratamento e defina o tipo de movimento para grade raster.

Na guia de eventos, selecione adicionar ações e mova as ações ARB de acionamento de inicialização de sincronia de sincronia para o painel de script. Em seguida, clique em ação de espera e selecione um tempo de espera de 6.000 milissegundos. Para preparar um animal para a análise, depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé em um camundongo anestesiado, use um marcador permanente para rotular o centro da cabeça, cole filme plástico no fundo de um pequeno barco de pesagem com o corte inferior e encha o barco de pesagem com gel de ultrassom.

Para o tratamento de ultrassom focado, inverta o frasco de microbolhas e carregue suavemente um microlitro da solução por grama do peso corporal do camundongo em uma seringa de insulina de calibre 29. Adicione 100 microlitros de anticorpo marcado com fluorescência à seringa e inverta e role suavemente a seringa entre o polegar e o indicador para misturar o anticorpo e as microbolhas dentro da seringa. Com cuidado e lentamente, injete retroorbitalmente 150 microlitros da solução de microbolhas e anticorpos no camundongo e ajuste um cronômetro para dois minutos.

Aplique pomada oftálmica, coloque o mouse no suporte da cabeça e fixe o nariz no suporte. Coloque o pequeno barco de pesagem cheio de gel de ultrassom no topo da cabeça e abaixe o bolo de água até que ele fique em cima do gel de ultrassom dentro do barco de pesagem. Em seguida, use o joystick para alinhar visualmente o foco do transdutor no centro da cabeça.

Quando o cronômetro desligar, na guia de movimento do software, selecione redefinir origem e selecione uma varredura completa. Quando o tratamento estiver concluído, aplique pomada oftálmica nos olhos do animal e coloque o camundongo em uma câmara de recuperação aquecida. Aqui, são mostrados resultados representativos das medições do contador de cultura do tamanho e concentração que podem ser obtidos quando as microbolhas são produzidas corretamente.

A captação de anticorpos pelo cérebro pode ser facilmente visualizada em todo o cérebro ou seções de tecido usando um scanner infravermelho ou microscopia fluorescente das seções. Conforme demonstrado nessas imagens, a coloração representativa para marcadores de microglia pode ser usada para determinar se a microglia se torna mais fagocítica após a administração do anticorpo. É importante garantir o bem-estar e a segurança dos animais, especialmente ao realizar as injeções retroorbitais e aplicar o transdutor acima das cabeças dos camundongos.

Este método permite a aplicação de vários padrões de varredura para atingir diferentes regiões do cérebro, como o hipocampo, o córtex ou hemisférios cerebrais individuais. Essa técnica pode ser usada para desenvolver novas terapias e medicamentos que penetram na barreira hematoencefálica e para estudar o mecanismo de formação e abertura da barreira hematoencefálica.