Name: Um modelo de cultura celular para produzir estoques de vírus de hepatite E de alta titer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda a produzir estoques de vírus da hepatite E de alta titulação usando cultura celular de hepatoma. Este método permite obter partículas virais envelopadas e não envelopadas para estudos de infecção e desenvolvimento de vacinas.

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Somos gratos a Suzanne Emerson pelo vírus da hepatite E clone p6. O soro hiperimune de coelho específico do HEV foi gentilmente fornecido por Rainer Ulrich, Instituto Friedrich Loeffler, Alemanha. Além disso, agradecemos a todos os membros do Departamento de Virologia Molecular e Médica da Universidade ruhr Bochum pelo apoio e discussão. Foram gerados números 1-7 com BioRender.com.

Os autores não têm nada a revelar.

A partir da preparação plasmida, os rendimentos de DNA devem exceder 150 ng/μL para poder realizar uma linearização múltipla a partir do mesmo estoque plasmídeo, o que minimiza o risco de mutagênese induzida por bactérias de sequências de genomas cruciais. Além disso, é importante verificar a digestão de restrição para a linearização plasmida completa por eletroforese gel (Figura 8b). A falta de DNA plasmídeo linearizado induziria a amplificação do círculo de rolamento fazendo com que a tran...

A hepatite E é uma doença bastante subestimada com aumento da prevalência em todo o mundo. Cerca de 20 milhões de infecções resultam em mais de 70.000 mortes por ano1. O agente subjacente, o vírus da Hepatite E (HEV), foi transferido recentemente e agora é classificado dentro da família Hepeviridae, incluindo os gêneros Ortohepevirus e Piscihepevirus. HEV de várias origens são classificados dentro da espécie Orthohepevirus A-D, incluindo isolados de humanos, suínos, coelhos, ratos, aves e outros mamíferos2. Atualmente, foram identificados oito genótipos diferentes (GT) do vírus RNA de rna de apenas encalhe positivamente2. Embora diferam em sua identidade sequencial, rotas de transmissão e distribuição geográfica, sua estrutura genômica é altamente conservada. Mais específico, o genoma HEV de 7,2 kbp é dividido em 3 principais quadros de leitura aberta (ORF1-3). Enquanto o ORF1 codifica todas as enzimas necessárias para uma replicação bem sucedida dentro da célula hospedeira, o ORF2 codifica a proteína capsid, e a proteína ORF3 opera como um canal de íon funcional necessário para montagem e liberação de partículas infecciosas3. Uma vez liberado no lúmen basal ou apical HEV existe em ambas as espécies quasienveloped e não-envolto/nu, dependendo se o vírus se origina de sangue ou fezes,respectivamente 4,5.
Enquanto GT1 e GT2 são encontrados principalmente em países em desenvolvimento infectandoapenas humanos 6 através da rota fecal-oral, GT3, GT4 e GT7 ocorrem predominantemente nos países desenvolvidos1,7 com uma variedade de espécies servindo como reservatórios, por exemplo, suíno8, rato9, frango10,11, veado12, mangusto13, morcego14, coelho15,16, javali selvagem17 e muito mais7,18,19, fornecendo evidências de zoonose7,20,21,22. Além das condições sanitárias inadequadas23 e dos produtos alimentícios contaminados12,24,,25,,26, a transmissão via transfusão de sangue e transplantes de órgãos também é possível27,28. O HEV é uma causa comum de cirrose hepática e insuficiência hepática29 especialmente em pacientes com doença hepática pré-existente, indivíduos imunocomprometidos (genótipo 3, 4 e 7) e gestantes (genótipo 1). Note-se que há também manifestações extrahápticas como a doença hematopoiética30,31,,32, distúrbios neurológicos33 e lesão renal34.
Até o momento, o medicamento off-label ribavirin (RBV) é o tratamento de escolha para muitos pacientes infectados35,36. No entanto, casos de falha no tratamento e desfechos clínicos ruins a longo prazo foram relatados. A falha no tratamento tem sido associada à mutagênese viral e ao aumento da heterogeneidade viral em pacientes cronicamente infectados37,38,39. Pelo contrário, um estudo multicêntrico retrospectivo europeu recente não foi capaz de correlacionar mutações de polimerase à falha do tratamento RBV40. Em observações clínicas e experimentos in vitro, interferon41,42,43, sofosbuvir44,45, sais de zinco46 e silvestrol47,48 também mostraram efeitos antivirais. No entanto, ainda há um tratamento específico de HEV, dificultado pela falta de conhecimento sobre o ciclo de vida hev e sua patogênese. Portanto, éurgenteum sistema de cultura celular robusto para estudos virológicos e o desenvolvimento de novas drogas antivirais.
Infelizmente, como outros vírus da hepatite, o HEV é difícil de propagar em linhas celulares convencionais e geralmente progride muito lentamente levando a baixas cargas virais. No entanto, alguns grupos foram capazes de aumentar as cargas virais pela geração de subclones de linhacelular 50 ou pelo ajuste dos suplementos de mídia51. Recentemente, a geração de clones cDNA52 e a adaptação dos isolados do paciente primário pela passagem53,54 melhorou ainda mais a propagação de HEV na cultura celular55. Neste protocolo, usamos o genoma de uma cultura celular adaptada linhame a cepa Kernow-C1 (chamada de p6_WT)54 e uma cepa mutante que abriga uma mutação que aumenta a replicação (chamada de p6_G1634R)37. Kernow-C1 é a cepa mais usada na cultura celular HEV e é capaz de produzir altas cargas virais. Ao avaliar os números de cópias do RNA viral, a replicação hev pode ser monitorada in vitro. No entanto, essas técnicas não permitem avaliar o número de partículas infecciosas que estão sendo produzidas. Por isso, estabelecemos uma coloração de imunofluorescência para determinar unidades de formação de foco (FFU/mL).
O método56 aqui descrito pode ser usado para produzir partículas virais infecciosas de comprimento total que são capazes de infectar uma variedade de tipos celulares de diversas origens, incluindo células primárias e linhas celulares de mamíferos. Este é um pré-requisito fundamental para decifrar aspectos importantes da infecção por HEV e do tropismo. Não há necessidade de inoculação com isolados geralmente limitados de pacientes. A produção de partículas infecciosas de HEV a partir de plasmídeos representa uma fonte infinita, o que torna este protocolo comparativamente eficiente. Além disso, esse sistema pode ser usado para genética reversa, permitindo o estudo da alteração do genoma identificada in vivo e seu impacto na replicação e aptidão do HEV. Essa técnica supera muitas limitações e pode trilhar o caminho para o desenvolvimento de medicamentos, estudos de mutagênese e a avaliação de interações vírus-hospedeiros, como fatores de restrição ou entrada.

<table><tbody><tr><td>0,45 &micro; m mesh</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td>Colheita de vírus extracelular</td></tr><tr><td>4% Histofix</td><td>CarlRoth</td><td>P087.4</td><td>Imunofluorescência</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>CarlRoth</td><td>6755.1</td><td>Solução de trabalho de colágeno</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910024</td><td>Colheita de vírus</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1593</td><td>Seleção de transformados bactérias</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Roche</td><td>11140965001</td><td>in vitro transcrição e eletroporação</td></tr><tr><td>BioRender</td><td>BioRender</td><td></td><td>Figure Generation</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>Collagen R solution 0,4% estéril</td><td>Serva</td><td>47256.01</td><td>Solução de trabalho de colágeno</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Roche</td><td></td><td>Transcrição 11140922001in vitro</td></tr><tr><td>Cubeta</td><td>Biorad</td><td>165-2088</td><td>Eletroporação</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D21490</td><td>Imunofluorescência</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>gibco</td><td>41965-039</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>in vitro transcrição</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Promega</td>incluído na transcrição <td>P2077</td><td>in vitro</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Roth</td><td>3054.3</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>Escherichia coli JM109</td><td>Promega</td><td>L2005</td><td>Transformação</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>gibco</td><td>10270106</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>Imunofluorescência</td></tr><tr><td>Sistema de Eletroporação GenePulser Xcell</td><td>BioRad</td><td>1652660</td><td>Eletroporação</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>gibco</td><td>15710049</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Roche</td><td>11140957001</td><td>in vitro transcrição</td></tr><tr><td>H2O</td><td>Braun</td><td>184238001</td><td>Imunofluorescência</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630-03</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>gibco</td><td>16050122</td><td>imunofluorescência</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Roth</td><td>P749.1</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>KCL</td><td>Roth</td><td>6781.3</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.2</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>gibco</td><td>25030081</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>L-Glutationa reduzida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251-5G</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>MEM</td><td>gibco</td><td>31095-029</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>MEM NEAA (100 vezes;)</td><td>gibco</td><td>11140-035</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>2189.2</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>Microvolume UV-Vis espectrofotômetro NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>Concentração de DNA/RNA</td></tr><tr><td>Enzima MluI</td><td>NEB</td><td>R0198L</td><td>Linearização</td></tr><tr><td>Tampão NEB</td><td>NEB</td> incluído na <td>Linearização</td><td></td></tr> <tr><td>R0198LKit de plasmídeo NucleoSpin</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740588.250</td><td>Preparação de plasmídeo</td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA Clean-up Kit</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740948.250</td><td>Purificação de RNA</td></tr><tr><td>PBS</td><td>gibco</td><td>70011051</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Plasmídeo que codifica o genoma HEV de comprimento total (p6_G1634R)</td><td>Todt et.al</td><td></td><td>Produção de vírus</td></tr><tr><td>Plasmídeo que codifica o genoma HEV de comprimento total (p6_WT)</td><td>Shukla et al.</td><td>Nº de acesso ao GenBank JQ679013</td><td>Produção de vírus</td></tr><tr><td>Anticorpo primário 1E6</td><td>LS-Bio</td><td>C67675</td><td>Imunofluorescência</td></tr><tr><td>Anticorpo primário 8282</td><td></td><td></td><td>Rainer Ulrich, Instituto Friedrich Loeffler, Alemanha</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Extração de DNA</td></tr><tr><td>Ribo m7G Cap Analógico</td><td>Promega</td><td>P1711</td><td>in vitro transcrição</td></tr><tr><td>RNase afastado</td><td>CarlRoth</td><td>A998.3</td><td>Purificação</td></tr> de <tr><td>RNA RNasin (inibidor de RNase)</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td>in vitro transcrição</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-rato de burro 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21202</td><td>Imunofluorescência</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho de cabra 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11008</td><td>Imunofluorescência</td></tr><tr><td>Sódio Pyruvat</td><td>gibco</td><td>11360070</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>T7 RNA polimerase</td><td>Promega</td><td>P2077</td><td>in vitro transcrição</td></tr><tr><td>Tampão de transcrição</td><td>Promega</td> incluído na transcrição <td>P2077</td><td>in vitro</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>CarlRoth</td><td>3051.3</td><td>Imunofluorescência</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,5 %)</td><td>gibco</td><td>15400054</td><td>Cultura</td></tr><tr><td>celular IgG ultrabaixa</td><td>gibco</td><td>1921005PJ</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>UTP</td><td>Roche</td><td>11140949001</td><td>in vitro transcrição</td></tr></tbody></table>

um modelo de cultura celular para produzir estoques de vírus de hepatite e de alta titer

A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

O vírus da hepatite E é a principal causa de cirrose hepática e insuficiência hepática com prevalência crescente em todo o mundo. O vírus RNA de uma única cadeia é predominantemente transmitido por transfusões de sangue, condições sanitárias inadequadas e produtos alimentares contaminados. Até o momento, a droga fora do rótulo ribavirin (RBV) é o tratamento de escolha para muitos pacientes. No entanto, um tratamento específico de HEV ainda precisa ser identificado. Até agora, o conhecimento sobre o ciclo de vida hev e a patogênese tem sido severamente dificultado devido à falta de um sistema eficiente de cultura celular HEV. Um sistema de cultura celular robusto é essencial para o estudo do ciclo de vida viral que também inclui a patogênese viral. Com o método descrito aqui pode-se produzir titers virais de até 3 x 106 unidade de formação de foco/mL (FFU/mL) de HEV não envolto e até 5 x 104 FFU/mL de HEV envolto. Usando essas partículas, é possível infectar uma variedade de células de diversas origens, incluindo células primárias e humanas, bem como linhas de células animais. A produção de partículas infecciosas de HEV a partir de plasmídeos representa uma fonte infinita, o que torna este protocolo extremamente eficiente.

Neste protocolo, descrevemos a produção de alto título infeccioso HEVcc. O primeiro passo é isolar o DNA plasmídeo (pBluescript_SK_HEVp654 e pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figura 8a), que então é linearizado pela digestão de restrição e purificado para transcrição in vitro(Figura 1). Uma linearização bem sucedida pode ser verificada comparando o plasmídeo-DNA não digerido com o plasmídeo digerido-DNA usando eletrof...

Descrito aqui é um método eficaz sobre como produzir altos estoques virais de vírus de hepatite E (HEV) para infectar eficientemente as células hepatomas. Com o método apresentado, tanto não envolta, quanto partículas virais envoltas podem ser colhidas e utilizadas para inocular várias linhas celulares.

Um modelo de cultura celular para produzir estoques de vírus de hepatite E de alta titer

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

A pesquisa do vírus da hepatite E tem sido dificultada pela falta de um sistema eficiente de cultura celular. Nossas técnicas superam essas limitações abrindo caminho para o design de medicamentos e o desenvolvimento de vacinas. Com este protocolo, somos capazes de produzir vírus infecciosos de alta titulação de partículas hev não-envelope e envelope, facilitando a infecção de uma variedade de células.A execução deste protocolo requer acesso a uma instalação BSA-2 e experiência com técnicas básicas de cultura celular. Para linearizar o DNA plasmídeo, misture 10 microgramas do DNA modelo com 10 microliters de tampão e dois microliters da enzima de restrição de micrococcus luteus e ajuste o volume final para 100 microliters com água. Em seguida, incubar a solução por uma hora a 37 graus Celsius e confirmar a linearização do plasmídeo por eletroforese de gel agarose de acordo com os protocolos padrão.Após o isolamento e a linearização do DNA plasmídeos, o sucesso da linearização pode ser verificado comparando o DNA plasmídeo não digerido ao DNA plasmídeo digerido por eletroforese gel. Para transcrição in vitro do DNA purificado do vírus da hepatite E, misture dois microgramas do modelo de DNA linearizado com os reagentes apropriados e use água sem núcleo para levar o volume final da solução a 100 microliters. Após uma mistura minuciosa, incubar a solução por duas horas a 37 graus Celsius.Após duas horas, adicione mais dois microliters de polimerase T7 RNA ao tubo. Em seguida, misture a reação e incubar o tubo a 37 graus Celsius por mais duas horas. Ao final da incubação, digerir o modelo inicial de DNA com 7,5 microliters de DNAs com mistura completa e incubar por 37 graus Celsius por 30 minutos.Após a extração, verifique cuidadosamente a integridade do RNA e o rendimento por eletroforese de gel agarose de acordo com os protocolos padrão. No caso de baixa abundancy RNAs, bandas distintas, em vez de uma mancha borrada devem ser observadas. Algumas etapas requerem execução rápida e, portanto, preparação minuciosa.Além disso, preste atenção especial à integridade do RNA e à viabilidade celular. Para preparar células cancerígenas do fígado humano para a produção de vírus de hepatite E derivadas da cultura celular, semeou as células em 20 mililitros de DMEM completos em um prato de cultura revestido de colágeno de 15 centímetros e incubar a 37 graus Celsius até atingirem 90% de confluência. No final da cultura, lave as células com 10 mililitros de PBS antes de descolá-las da placa de cultura celular com três mililitros de 0,05% Trypsin-EDTA a 37 graus Celsius.Resuspend as células separadas em 10 mililitros de DMEM completos e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros para contagem. Transfira cinco vezes 10 para as seis células para um novo tubo de 50 mililitros e lave as células duas vezes com 35 mililitros de PBS por lavagem. Após a segunda lavagem, coloque as células no gelo sem remover o supernatante.Para eletroporação das células-alvo, suplementar 384 microliters de citomix com dois ATP mililitros e cinco glutationa milimor, posteriormente armazenar no gelo até uso adicional. Substitua cuidadosamente o supernascer por todos os 400 microliters de solução. Adicione cinco microgramas de RNA genômico viral purificado às células e transfira a suspensão celular para um cuvette de quatro milímetros para eletroporação a 975 microfarad e 270 volts por 20 milissegundos.Após a eletroporação, use uma pipeta Pasteur para transferir as células o mais rápido possível em 11 mililitros de DMEM completos e sementes 10 mililitros das células eletroporadas em um prato de cultura de 10 centímetros revestido com colágeno. Em seguida, adicione 1,3 vezes 10 às quintas células em 300 microliters de médio uniformemente em um deslizamento de cobertura em um poço de uma placa de 24 microtiter revestida de colágeno e coloque o prato e o prato na incubadora de cultura celular por 24 horas. No dia seguinte, substitua o supernascedor no prato por 10 mililitros de DMEM fresco e devolva o prato à incubadora de cultura celular por mais seis dias.No quinto ao sétimo dia, dependendo da densidade celular, realizar a coloração imunofluorescente do controle de transfecção para permitir o cálculo do número de células expressando a proteína alvo de interesse normalizada ao número total de células. A eletroporação bem sucedida pode ser monitorada pela coloração imunofluorescente do controle de transfecção. A eficiência da transfecção deve exceder 40% Um mutante deficiente de replicação pode servir como um controle negativo para confirmar a especificidade da coloração.Para colher partículas extracelulares derivadas da hepatite E, no sexto dia, filtrar o supernascer através de uma malha de 0,45 microliter para remover quaisquer detritos celulares e armazenar o vírus da hepatite E derivado da cultura extracelular a quatro graus Celsius. Para a colheita de partículas de partículas do vírus da hepatite E derivada da cultura intracelular, lave as células com PBS e despreze as células com 1,5 mililitros de 0,05% Trypsin-EDTA a 37 graus Celsius. Quando as células se separarem, pare a reação com 8,5 mililitros de DMEM e transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mililitros para centrifugação.Adicione 1,6 mililitros de DMEM meio completo por eletroporação a dois tubos de reação de mililitros individuais e use 800 microliters do meio para resuspencar as células, transferindo assim as células para os tubos. Congele as células em nitrogênio líquido e, posteriormente, descongele as células no gelo três vezes antes de centrifugar os lises resultantes por 10 minutos a 10.000 vezes g. Em seguida, transfira os supernantes para novos tubos sem perturbar as pelotas de detritos celulares por menos 80 graus Celsius de armazenamento.Para avaliar os títulos dos recém-produzidos estoques de vírus de hepatite E intra e extracelular, semente duas vezes 10 para as quatro células por 100 microliters de MEM por poço nos 60 poços centrais de uma placa microtiter revestida de colágeno e encher os poços mais externos com 100 microliters de PBS por poço. Após 24 horas a 37 graus Celsius, adicione 50 microliters de supernatante de partículas de vírus extracelular à primeira fileira de células. Após a mistura completa, dilui o conteúdo do poço seis vezes em uma concentração de um a três por poço, transferindo 50 microliters de supernascer do anterior para a próxima linha de células em duplicação até a última linha de células.Para infectar as células com partículas de vírus de hepatite E derivadas da cultura intracelular, adicione 25 microliters do supernatante de partículas do vírus intracelular à linha superior das células e misture bem antes de diluir as células seis vezes em uma proporção de um a cinco com 25 microliters de diluição em duplicata como demonstrado. Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura celular por sete dias antes da coloração imunofluorescente de acordo com o protocolo no manuscrito. Após a incubação e a coloração imunológica, as placas podem ser analisadas usando microscopia de imunofluorescência.Após a imunossuagem do título final das partículas intra e extracelulares pode ser calculado usando a fórmula apropriada como indicado. Após a infecção celular alvo com partículas de vírus E derivadas da cultura celular por diluição serial, titulações entre uma vez 10 a 10 e três vezes 10 para as seis unidades de formação de foco por mililitro podem ser esperadas das culturas celulares infectadas com as partículas de vírus de hepatite E derivadas da cultura celular não envolta. Em culturas infectadas com partículas de vírus de hepatite E derivadas da cultura extracelular, são esperadas titulações entre uma vez 10 a 10 vezes 10 para o quarto foco formando unidades por mililitro.Além disso, a razão entre cópias do genoma e partículas de vírus infecciosos intracelulares não envoltas é tipicamente menor do que a observada para cultura extracelular derivada da cultura de hepatite E culturas infectadas pelo vírus da hepatite E, sugerindo uma maior infectividade específica das espécies não-envoltas do vírus da hepatite E. A produção de partículas virais e a infecção celular alvo requerem um ciclo de vida viral completo, e podem fornecer novas percepções sobre as interações entre vírus e hospedeiros. Este protocolo pode ser modificado para realizar cinética de replicação ou para produzir partículas que podem ser usadas em ensaios de infecção.A maioria de nossa pesquisa atualmente depende de partículas infecciosas, tanto no HEV envolto e não envolto. E artigos usando nossas técnicas estão sendo publicados.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Um modelo de cultura celular para produzir estoques de vírus de hepatite E de alta titer

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