Um método de detecção quantitativa para microRNAs no rim de um modelo de camundongo com lesão renal isquêmica

A expressão alterada de microRNA na LRA pode ser útil para biomarcadores e terapia. Este protocolo é simples e alcança resultados constantes entre laboratórios. A IRI do rim representa um dos principais fatores de risco para LRA. A quantificação de microRNAs que são alterados pelo IRI leva a um diagnóstico. MicroRNAs purificados da amostra de rim são aplicados a outro sistema. Monitore cuidadosamente a hipotermia, a hidratação intestinal e a profundidade da anestesia durante todo o procedimento. Isso ocorre porque existem muitas técnicas manuais para se acostumar.

[Narrador] Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé, coloque o camundongo anestesiado em uma almofada cirúrgica aquecida na posição supina. Depois de fazer uma incisão abdominal na linha média, use um cotonete umedecido com PBS para empurrar suavemente o intestino para o lado esquerdo da cavidade abdominal extra para expor o rim e o ureter direitos e use uma pinça angular para levantar o ureter direito. Ligue o ureter em dois lugares com suturas trançadas de seda 4-0, deixando laços mais longos para a sutura que está mais próxima do rim e cortada entre as suturas. Segurando cuidadosamente a sutura restante, disseque sem rodeios o tecido conjuntivo e a gordura ao longo do rim e identifique um vaso sanguíneo que não seja as artérias ou veias renais que fornecem sangue ao rim direito. Ligue o vaso e, quando o rim direito estiver suficientemente descolado, ligue a veia e a artéria renais. Usando um cotonete umedecido com PBS, empurre suavemente o intestino em direção ao lado direito da cavidade abdominal extra para expor o rim esquerdo e cobrir o intestino com uma cortina umedecida. Depois de preparar o rim esquerdo conforme demonstrado, clampeie a artéria e a veia renais a um centímetro do rim para induzir a isquemia do rim esquerdo. Uma isquemia bem-sucedida pode ser confirmada visualmente por um escurecimento gradual e uniforme do tecido renal. Quando a isquemia for confirmada, retorne o tecido intestinal à cavidade abdominal, tomando cuidado para evitar torção intestinal, e feche e cubra temporariamente a pele abdominal. Após 25 a 45 minutos, remova a pinça e confirme se a reperfusão do fluxo sanguíneo e a cor do rim melhoram. Depois de confirmar que o intestino não está torcido, instilar PBS intraperitoneal e fechar o músculo abdominal e a pele em duas camadas usando suturas de náilon 4-0. 24 horas após a indução da lesão isquêmica, reabra a incisão da linha média e use uma agulha de calibre 27 para coletar o sangue da veia cava inferior. Faça uma incisão na linha média na parede torácica e insira uma agulha de calibre 23 no ventrículo esquerdo. Depois de confirmar o refluxo na agulha, faça uma incisão no lobo direito do fígado e injete 20 mililitros de PBS. O fígado mudará de vermelho para rosa, confirmando que sangue suficiente foi drenado. Use fórceps e tesoura para remover o rim esquerdo e lave o tecido excisado em um prato de PBS. Em seguida, use a pinça para remover a fáscia renal sem secar o rim e corte o rim ao meio ao longo da linha média vertical. Para purificação de microRNA, coloque 30 miligramas da amostra de rim congelada em um homogeneizador de vidro contendo 700 microlitros de reagente de lise à base de fenilguanidina no gelo e gire lenta e repetidamente o pilão para homogeneizar completamente a amostra. Quando o tecido estiver completamente dissociado, transferir o lisado homogeneizado para o sistema de trituração de biopolímeros numa coluna de centrifugação por microcentrifugação num tubo de recolha de dois mililitros e recolher a amostra para o fundo do tubo por centrifugação. Transfira o lisado para um novo tubo de microcentrífuga contendo 140 microlitros de clorofórmio e misture o tubo por inversão por 15 segundos com a tampa bem apertada. Após uma incubação de dois a três minutos à temperatura ambiente, sedimentar a amostra por centrifugação e transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga contendo 1,5 vezes o volume de etanol 100% sem perturbar o pellet. Misture a amostra por cinco segundos por vórtice antes de transferir 700 microlitros da amostra para uma coluna giratória à base de membrana de sílica em um tubo de coleta de dois mililitros. Após uma breve centrifugação, descartar o fluxo e lavar a amostra duas vezes com 500 microlitros de tampão de lavagem 2 em uma nova coluna de centrifugação à base de membrana de sílica por lavagem para remover quaisquer vestígios de sal. Após a segunda lavagem, centrifugar novamente a coluna de centrifugação à base de membrana de sílica e, depois de eliminar o escoamento, transferir a coluna para um novo tubo de recolha de 1,5 mililitros. Adicione 25 microlitros de água livre de RNase à coluna e incube a amostra por cinco minutos em temperatura ambiente antes de centrifugar a amostra novamente. Em seguida, transfira o eluita contendo microRNA de 25 microlitros para um novo tubo de microcentrífuga. Neste estudo, foram investigados sete microRNAs expressos em humanos que foram regulados positivamente nos rins de camundongos com lesão renal aguda. Os níveis de seis dos microRNAs foram significativamente aumentados nos rins de camundongos com lesão de isquemia e reperfusão em comparação com aqueles em camundongos simulados usando PCR quantitativo em tempo real, conforme demonstrado. Os níveis séricos de nitrogênio ureico e creatinina no sangue e a necrose tubular aguda também foram significativamente regulados positivamente.

Os biomarcadores para o diagnóstico de IRI e o tratamento específico da LRA permanecem obscuros. Espero que a pesquisa de microRNA avance e contribua para o diagnóstico e tratamento da LRA.